Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

13.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54657

⸱

30 Kasım 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Metastatik klonların uzak bölgeleri kolonize etme yeteneği, çoğalma kapasitelerine ve/veya önemli bir çoğalma olmaksızın konakçı mikro ortamda hayatta kalma yeteneklerine bağlıdır. Burada, metastatik klonlar tarafından her iki tip karaciğer kolonizasyonunun kantitatif olarak görselleştirilmesine izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz.

Özet

Karaciğer metastazlarının ve ilerlemesi yavaş oranlarının sınırlı sayıda hasta başarılı bir şekilde lokal tedavi ile tedavi edilebilir 1,2 yaklaşır. Bununla birlikte, küçük bir karaciğer metastazlarının heterojenliği hakkında bilinen ve tek tek metastatik koloni gelişimini değerlendirmek edebilen hayvan modelleri ihtiyaç vardır. Burada, kantitatif karaciğerde bireysel tümör klonların gelişimini görselleştirmek ve büyüme kinetiği ve kolonizasyon verimliliğini tahmin yeteneği sağlar hepatik metastaz gelişmiş bir model sunuyoruz. Bu stabil olarak lusiferaz ve tdTomato ve farklı büyüme özelliklerine sahip ile etiketlenmiş HCT116 insan kolorektal kanser hücrelerinin monoklonal türevlerinin bir panel oluşturulur. Bir splenektomi ardından dalak enjeksiyonu ile, bu klonların çoğunluğu karaciğer metastazı üretebilen, fakat kolonizasyon farklı frekanslarda ve farklı büyüme oranları ile vardır. In vivo görüntüleme Sisteml kullanılmasıM (IVIS), görselleştirmek ve in vivo ve ex vivo Işıklı flüoresan görüntüleme ile metastazı gelişimi ölçmek mümkündür. Buna ek olarak, Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) in vivo karaciğer metastazı 3D dağılımını sağlar. Hasat karaciğerin ex vivo floresan görüntüleme bireysel hepatik metastatik kolonilerin nicel ölçümler sağlar, karaciğer kolonizasyon sıklığı değerlendirilmesi ve büyüme kinetiği için izin metastaz. Model klinik gözlenen karaciğer metastazları benzer olduğundan, karaciğer metastazı ile ilişkili genleri tespit etmek için ve karaciğer metastatik hastalık için potansiyel ablatif veya adjuvan tedaviler test etmek için bir yöntemi olarak hizmet verebilir.

Giriş

Primer kolorektal kanserler (CRC) karaciğer metastazı olan hastalar kötü prognoz ile karakterizedir. % 12 5 - karaciğer metastazlarının (evre IV) olan hastalar sadece 8 5 yıllık sağkalım oranı ise% 88 3,4 - birincil metastatik olmayan CRC için 5 yıllık sağkalım oranı (aşamaları I - III) 75 olarak tahmin edilmektedir 6. Ancak, metastatik hastalar metastazlar ve farklı nüks kez farklı numaralar ile başvuran, heterojen bir grubunu temsil etmektedir. Klinik gözlemler, ve (yerel büyüme oranı ile orantılı) tek bir metastaz boyutu (kolonileşme yetisi ya kolonizasyon frekansına orantılı olabilir) metastaz sayısı bağımsız prognostik faktörler 1,7 olduğuna işaret etmektedir. büyümek için kendi yetenek ve yaymak ve karaciğer mikroçevresinin hayatta kendi yeteneği: Bir başka deyişle, karaciğer kolonize metastatik klonların başarısı iki önemli özelliği bağlıdır.

Dizaynyakalama ve büyük ölçüde karaciğer metastazı biyoloji anlayışımızı geliştirmek ve potansiyel terapötik yaklaşımların tasarımı için etkili bir araç sağlayabilir metastatik klonların özelliklerini nicel yeteneği ile başarılı klinik modelleri. Deneysel karaciğer metastazı modelleri daha önce 8,9 rapor edilmiştir, ancak bunların hiçbiri niceliksel yakalamak ve in vivo ve ex vivo hem de bireysel metastatik klonların özelliklerini tanımlamak için yeteneği sağladı.

Burada, farklı karaciğer kolonizasyon verimlilik ve büyüme özellikleri ile tümör klonların nesil içeren karaciğer metastazı yeni, gelişmiş bir model sunuyoruz. Metastatik kapasite iç farklılıklar vardır monoklonal hücre çizgilerinin üretimi ile lusiferaz ve tdTomato floresan protein kanser hücrelerinin çift etiketleme bir arada kullanılabilir. Bu deneysel modelde, veriler gelişimi göstermektedirKaraciğer metastazları kolonizasyon sıklığı açısından ve klinik gözlemlerle tutarlı iki katına zaman (Td), tarif edilebilir. Bu modelin sayısal doğa ilaç keşfi ve tanı amaçlı kolayca uyarlanamıyor yapar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Chicago Üniversitesi (Protokol # 72213-09) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir.

1. hazırlıklar

  1. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): 500, HCT116 tümör hücrelerinin kültürü için orta mL olun.
  2. 20 dakika boyunca 251 ° F 'de, 4, cerrahi havlu, gazlı bez, iki küçük Adson alıcılar, iğne sürücüsü, makas iki çift küçük bir kelepçe ve 3 microclips - cihazlar dahil olmak üzere 3 dalak enjeksiyon modeline için kullanılabilir, otoklavın .
  3. , Fareler için ameliyat sonrası anestezi hazırlayın dalak enjeksiyonu takiben deri altına uygulanacak. fare başına 0.9 normal serum fizyolojik 500 uL buprenorfin 4 ug - 2 seyreltilir.
  4. periton enjeksiyonlar dur için ateşböceği luciferase 150 mikrogram / 150 uL hacimde hazırlayınbiyoparlaklık deneyleri ing. -20 ° C'de saklayın ve ışıktan korumak.

Lusiferaz / tdTomato etiketli monoklonal hücre çizgileri 10,11 2. Üretim

  1. Çözülme ve HCT116 insan kolorektal kanser hücre ve% 10 FBS, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM içerisinde 293FT insan embriyonik böbrek hücreleri korumak. % 5 CO2 ve 37 ° C 'de kültür içinde muhafaza edin.
  2. yüksek titre lentivirüs üretin.
    1. 12 x 10 6 293FT% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ile bitmiş DMEM, 18 ml (cDMEM) 15 cm hücre kültür tabaklarında kanalı 3 ve 10 arasında hücreler ve% 1 temel olmayan amino asitler, - D 1, levha 10 üzerinde . 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2.
    2. D2, aşağıdaki transfeksiyon çözeltisi kullanılarak hücrelerin transfekte:
      1. Her yemeğin, aşağıdakileri kullanın: lusiferaz (Luc2) ve tdTomato eklenen pFUG lentiviral vektör 37.5 ug DNA karışımınısteril H 2 O. 1062 uL toplam tekrar süspanse 11 (Chicago Üniversitesi'nde Dr. Geoffrey Greene bir hediye), pCMVΔ8.74 25 ug ve pMD2.G ve 12.5 mikrogram yapıları 2 M CaCl 2 188 mcL ekleyin.
      2. Ekle 1,250 2x Hepes-tamponlu tuzlu su (HBS, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 180 mM NaCl, pH 7.12), DNA / CaCl2 çözeltiye, bir kerede, bir damla uL, Kabarcık üflerken bir pipet ile çözüm.
      3. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir, ve sonra da 25 uM'lik bir son konsantrasyon yapmak için RT cDMEM ve klorokin 15.5 ml.
    3. 293FT hücrelerinin her tabak ortamı aspire ve transfeksiyon solüsyonu ile değiştirin. Kaplama hücreleri kolayca yerinden gibi, yavaş transfeksiyon solüsyonu 16 mL ekleyin.
    4. D3 üzerine 8 sonra - yine Taki 16 saat transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkama hücrelering hücreleri çıkarmak için değil bakım. 10 mM Hepes taze cDMEM 18 mL ile değiştirin.
      Not: yavaşça bulaşık hareket transfeksiyon solüsyonu aspire ve hücreleri uzaklaştırmak için, böylece plakaların yan duvarı boyunca ortamı eklenir.
    5. D, 4, transfeksiyon zamanı 48 saatte, hücreleri çıkarmak için şekilde bir pipet ile yavaşça aspire yemekler ortamı toplar. Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg'de toplanan medya büyük hücreli enkaz çöktürmek için.
    6. kullanılarak viral süpernatan filtre 0.45 um düşük-protein bağlayıcı 50,000 xg ve 4 ° C 'de 2 saat süre ile, SW-28 rotor kullanılarak filtre şişesi ve santrifüj. santrifüj bittikten hemen sonra süpernatant süzün ve silecekler ile tüpün içini kurutun.
    7. % 1 FBS, düşük serum Ortamı (RSM) 50 uL viral pelletini. Alikotlar ileride kullanmak (viral stok) -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. lentivirüs transduceve HCT116 hücrelerine es tdTomato pozitif klonlardan oluşan bir panel oluşturabilir.
    1. Viral enfeksiyondan önce 1 x 10 5 1 yuvalı plakalar 24 d yoğunluğunda HCT116 hücreler plaka.
    2. % 1 penisilin / streptomisin ve 8 ug / ml polibren ile: (100 seyreltme 1) (CRSM) RSM 4 mL (2.2.7) yeniden süspansiyon haline getirilmiş virüs 40 uL seyreltilir.
    3. enfeksiyonun günde, DPBS ile bir kez yıkama hücreleri ve daha sonra her bir aşama 2.3.2 seyreltilmiş virüs 250 uL ekleyin. Her bir oyuğa cDMEM 1 ml, sonra 37 ° C'de 4 saat ve% 5 CO2 inkübe ve; 72 saat - 48 CO2, 37 ° C'de inkübe ve% 5.
    4. % 0.05 tripsin 1 mL 0.53 mM EDTA hücrelerin tekrar ve tripsin nötralize etmek için cDMEM 1 ml. 4 dakika boyunca 300 x g'de bir mikrosantrifüj tüpü ve pelet hücreleri aktarın. Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) artı% 2 FBS 1 mL pelet 3x yıkanır.
    5. Adım 2.3.4 den pelet1 x 10 6 hücre / mL, tek bir hücre süspansiyonu içine FACS tamponu (% 2 FBC ve PBS içinde 2 mM EDTA) ile.
    6. Sıralama PE pozitif hücreler için yolluklama bir hücre ayırıcıyla tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (uyarım / emisyon: 556/585 nm). Ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (Şekil 1 A) oluşturmak için% 5 CO2 37 ° C'de 10 cm'lik bir tabak içinde toplanan hücreler büyümek.
    7. % 0.05 tripsin 8 mL, 3 0.53 mM EDTA 2.3.6 gelen ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri tekrar - 5 dakika ve daha sonra tripsin nötralize etmek için 8 mL cDMEM ilave edin.
      1. 4 dakika boyunca 300 x g'de 50 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın. Süpernatantı ve cDMEM (Şekil 1B) 200 uL başına 1 hücreye ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri sulandırmak.
    8. % 5 CO2 ve 37 ° C'de (Şekil 1C) bir 96-çukurlu plaka içinde çukur başına bir tek hücre (seyreltme 200 uL) plaka.
    9. % 5 CO2 37 ° C'de şişeler içinde tek tek monoklonları büyütün. (Şekil 1D).

Hücre sayısı bir işlev olarak Floresan Sinyal Şiddeti 3. Kalibrasyon

  1. 10 3, 0 yoğunluğunda, hemen HCT116-l2t olarak adlandırılır, transfekte olmamış HCT116 hücreleri, levha 2 x 10 4, 3 x 10 5 x 10 4 5, 7 x 10 4, x, 10 4 9 ve 10 5 hücre / göz her yoğunluk üç kez, 96 oyuklu plakalar.
  2. Inkübasyondan 5 saat sonra, IVIS 10 kullanılarak tdTomato floresan şiddetleri ölçmek.
    1. Yazılımı başlatmak için masaüstündeki görüntü yazılımı simgesini tıklayın. görüntüleme sistemi başlatmak için "Başlat" butonuna tıklayın. (Birkaç dakika sürer) başlatma tamamlandıktan sonra, "Floresan", "4 saniyelik" pozlama süresi, "Orta" binning, "2" F / durdur seçeneğini "535" uyarma filtresi,ve "580" emisyon filtresi.
    2. görüntüleme istasyonu üzerinde 96 plaka yerleştirin ve görüntüleme başlatmak için "Acquire" üzerine tıklayın. Görüntü alındıktan sonra, araç paleti içinde "ROI Araçlar" linkine tıklayın ve yarık simgesinden 12 x 8 seçin.
    3. 96 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini tıklayın 12 x 8 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare başına steradyan'dır s başına fotonların birimleri ile ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemlemek (fotonlar / s / sr / cm2).
  3. hücre sayısı ve sinyal yoğunluğu temsil eden işlev (Y ekseni) eşit bağımsız değişken (X ekseni) bir scatterplot oluşturun. Floresan yoğunluğunun birimine karşılık gelen hücrelerin miktarını hesaplamak için (Şekil 2) 10, bir veri analiz yazılımı kullanılarak regresyon eğrisi hesaplanır.

Karaciğer Metastazlarının 4. Hayvan Modeli

  1. HCT116-l2t hücreleri 70 ulaştıklarında-% 80 confluency, dalak enjeksiyon yaklaşık 1 saat önce onları hazırlamak. 3 0.53 mM EDTA,% 0.05 tripsin kullanılarak hücreleri ayırmak - 5 dakika, ve daha sonra cDMEM eşit miktarda ile nötralize. topaklanma önlemek için iyice pipetle emin olun.
  2. Otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
  3. 2 x 10 6 hücre / 100 uL - 1.2 'lik bir konsantrasyon 1 x DPBS tekrar süspansiyon hücreleri. pipet ve topaklanma önlemek için iyice hücreleri tekrar süspansiyon emin olun.
  4. bazen tüp onları resuspending, enjeksiyon kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
  5. fareler anestezi öncesinde, adım 1.3 açıklanan buprenorfin karışımı 500 uL enjekte deri altından tarafından ameliyat öncesi anestezi ve sıvı bolus sağlar. Ağrı (hareketliliğin azalması, kambur boy, damat başarısızlık, ele seslendirme) belirtileri çözülene kadar günde iki kez ek buprenorfin karışımının aynı dozunu.
  6. 6 ila 8 haftalık anestezisibir anestezi bölmesi oksijen içinde% 2 izofluran ile -eski dişi atimik çıplak fareler. Fareler kuyruk sıkıştırarak anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. dalak enjeksiyon için tek bir burun konisi her anestezi fare aktarın. insizyon önce, her bir fare olan steril bir cerrahi örtü ile kaplanmalıdır.
  7. çıplak farelerin sol kanattan deri yoluyla dışarıdan görülen bir mor alanı olarak dalak tanımlayın. Mikrodiseksiyon makas kullanarak, sadece dalak üstündeki cilde 8 mm sol yan kesi yapmak.
    1. Sonraki, karın duvarında yukarı kaldırın ve küçük bir kesi yapmak. iç organlar kesi uzaklaşmaya böylece karın boşluğuna hava izin verin. Yaklaşık 5 mm karın ön duvarı kesi büyütün.
    2. hafifçe bir pamuklu çubuk ile kesi çevresinde basınç uygulayarak dalak Açığa. Gerekirse, pankreas şişman nazikçe adam olabilirdalak zarar etmeyecek şekilde maruz kalma ile yardımcı olmak için ipulated.
  8. Yavaşça maruz dalak ucuna bir 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak hücrelerin 100 uL enjekte edilir. İlave karaciğer tümörleri önlemek için, 60 s - en az 30 daha uzun bir sürede, yavaş yavaş enjekte edilir.
  9. önceden enjekte edilen hücre süspansiyonu sızmasını önlemek için enjeksiyon sonunda iğne çıkarmadan dalak bir mikro yerleştirin.
  10. 5 dakika boyunca yerine mikro-klip bırakın.
  11. 5 dk enjeksiyondan, hemostaz için bir el koter cihazı kullanılarak bir splenektomi gerçekleştirin. Ön taraftan başlayarak dalak hilusu teşrih. Büyük Gemilerin diseksiyon, aşırı kanama önlemek için koter kullanılarak, komşu yağ dokusu ile damarların proksimal tarafı ön coagulate.
    NOT: hemostaz için Yöntemler: koter ile doğrudan kanama noktasını koagüle 3 kanama noktasına baskı uygulamak - 5 dakika, ya da bir 5-0 ipek kravat ile kanama noktası dikiş-Arter.
  12. iki kat, her bir fare cenah kesi kapatın. İlk olarak, tek bir yatay dikiş 5-0 emilebilir örgülü sütür (örneğin, vikril) ile karın duvarı kapatın. Sonra, tek bir yatay dikiş ile yine 4-0 emilemeyen monofilament sütür (örneğin, prolen) kullanarak cilt kapatın.
  13. Her prosedür arasındaki steril koşulları sağlamak için% 70 izopropanol püskürterek bütün aletleri temizleyin.
    NOT: Anestezi uyanık iken hayvanlar ısındı emin olun. Onlar ayakta olmak ve normal aktiviteye dönünceye kadar ameliyat sonrası tüm fareleri izleyin. 5 dk - Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 3 olduğunu. Onlar sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.

Vivo Bioluminescent Görüntüleme 5.

  1. üzerinde görüntüleme gerçekleştirmekhaftalık olarak ölçmek ve zamanla biyoparlaklık değişiklikleri ölçmek için.
  2. Bir anestezi odasına fareler yerleştirin ve oksijen içinde% 2 izofluran ile onları uyutmak. Fareler kuyrukları kısma anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  3. Daha sonra, periton boşluğu içine adım 1.4 firefly luciferase önceden hazırlanmış 150 uL her fare enjekte edilir.
  4. Bireysel burun konileri izofluran uygulanması ile IVIS fareler yerleştirin. Bitişik farelere sinyali en aza indirmek için aralarında ayırıcılar ile yatar pozisyonda fareler yerleştirin. beş farenin en fazla bir zamanda görüntülenebilir.
  5. Tedbir ve bioluminescent şiddetleri luciferase enjeksiyondan sonra 3 dakika analiz.
    1. Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, "Luminescent", "1 saniye" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin.
    2. IMAGin başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayınörn. luciferase enjeksiyondan sonra tutarlı bir süre (3 dk) her görüntüleme gerçekleştirmek için emin olun.
    3. Görüntü alındıktan sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünecektir. "YG Araçlar" tıklayın ve "1", "2", "3", "4", ya da "5" daire simgesi, görüntülü farelerin sayısına karşılık gelen.
    4. , İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak fare karın boşluğuna ışıldayan sinyalinin sinyal alanını daire ve sonra radyant verimlilik keyfi bir birim olarak ROI "ölçümleri" tıklayın ((fotonlar / s / cm 2 / steradyan) / (uW / cm2)). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun.
  6. Dört hafta sonrası enjeksiyon ve önceki hayvan kurban etmek, tek tek tümör kolonileri biyolüminesans şiddetlerinin gerçek zamanlı 3D rekonstrüksiyon kullanarak tümör yükünü ve dağılımını değerlendirmek için IVIS kullanarak Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) gerçekleştirin.
    1. fareler anestezi ve aşama 5.2.4 de tarif edildiği gibi, luciferase enjekte edilir. DLIT her seferinde bir fare üzerinde gerçekleştirilmiştir.
    2. Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, "Görüntüleme sihirbazı", "biyolüminesensin" seçin ve "İleri" ye tıklayın. "DLIT" seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. "Firefly" probları seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. "Fare" görüntü konusunu, "Otomatik" poz parametresi, görüş "C-13 cm" alan ve "0,5 cm" konu yüksekliği seçin ve "İleri" butonuna tıklayınız. görüntüleme başlatmak için "Edinme" düğmesini tıklayın.
    3. Görüntü alındıktan sonra, "DLIT 3D İmar" sekmesini seçin ve "Analiz" sekmesine gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntü oluşturmak için "yeniden yapılandırma" tıklayın.
    4. "Araçlar" ve "3D Animasyon" tıklayın. 3D animasyon penceresinde "Y ekseni üzerinde Spin SOLA" seçeneğini seçin. Bir .mov dosya biçimi içine "Kaydet" ve "Kaydet" i tıklayın.

6. Ex Vivo Floresan Görüntüleme

  1. dalak enjeksiyonları izleyen 6 hafta - anestezi, veya 4 kurumsal yönergelere göre ise servikal dislokasyon ile fareler kurban.
  2. karaciğer Hasat. sağdan sola bir yatay bir kesi yapmak. Bir pikap ile kılıç şeklinde sürecini kapma falciform, hepatik ven ve inferior vena kava teşrih.
    1. triadın diseksiyon sırasında kaudat lob kesmemeye özen sağ hepatorenal ligament, triadın ve sol hepatorenal ligament teşrih. Bu otofloresans gösterecektir olarak karaciğer hasat sonra, safra kesesi çıkarın. Mevcut herhangi bir ek ekstra karaciğer tümörlerinin not edin.
  3. Mevcut makroskopik numaraları ve karaciğer tümörlerinin boyutları not alın ve DPBS hasat ciğeri yerleştirin.
    NOT: Tümörler çıplak gözle makroskopik olarak görünürBeyaz tümörler (a Örnek örneğin, bakınız Şekil 4).
  4. Önceki görüntüleme kağıda yerleşimi, her karaciğer alıp yavaşça bir kağıt havlu üzerine blot aşırı sıvı kaldırmak.
  5. IVIS kullanarak her bir tümör kolonisinden floresan şiddetleri ölçün.
    1. "Floresan", "4 saniye" pozlama süresi, "Orta" binning, "2" F / stop "535" uyarma filtresi ve "580" emisyon filtresi seçin. görüntüleme başlatmak için "Edinme" düğmesini tıklayın.
    2. Görüntüyü aldıktan sonra, görüntü penceresi ve araç paleti bulun. "YG Araçlar" tıklayın ve daire simgesinden "1" seçeneğini seçin. ((Radyan verimlilik keyfi bir birim olarak ROI "ölçümleri" tıklatın daire, görüntü üzerinde bireysel tümör kolonileri sinyal alanını İB'leri tanımlamak ve fotonlar / s / cm 2) / steradyan / (uW / cm 2) ). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun.
  6. Bir küre olmaya varsayarak toplam tümör hacmini hesaplayın. Tümör hacmi = 4 x π xr 3/3 (r = yarıçap). splenically enjekte edilen hücrelerin sayısı bölü karaciğer tümör sayısı gibi tümör koloni oluşturan hücrelerin (Fc) fraksiyonu hesaplayın.
  7. Adım 3.3 doğrusal yaklaşım gelen koloni başına toplam hücre sayısını (= X) hesaplayın. Td (gün) 28 / Y. = Y = 2 X ve Td günlük olarak hücre bölünmeleri (= Y) sayısını hesaplayın

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu denemenin amacı,., In vivo metastatik tümör yükü seri ölçümü için ve kolonize sıklığı ve karaciğer metastazları gelişen büyüme kinetiğinin tahmini için potansiyeli olan bir tutarlı ve kolayca tekrarlanabilir hayvan modeli kurmak oldu 2-6 Rakamlar efsanelerle, Creative Commons CC-BY lisansı 10 altında önceki yayın sağlanmaktadır.

Çift etiketli tümör hücre monoklonları Üretimi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Geçerli raporunda sunulan hayvan modeli iki ana yaklaşım dayanmaktadır. İlk olarak, koloni ve karaciğerde çoğalan farklı eğilimleri metastatik klonlar gözlemleme yeteneği sağlamak için, yüksek ölçüde heterojen monoklonal hücre soylarının bir paneli yerine kurulmuş bir bölünmemiş kanser hücre hattı 12,13 daha kurulmuştur. Metastaz gelişmesine monoklonal yaklaşımı son genomik verileri 14 tarafından haklı ve başarılı metastatik süreç 10,15,16 modellemek için önceden kullanıldı. İkinci olara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz Luc2-tdTomato plazmid ve HCT116 hücre hattı, yardım için Sayın Ani Solanki (Hayvan Kaynak Merkezi) fareler yönetimi için, ve Dr. Lara Leoni Dr. Geoffrey L. Greene (Chicago Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum DLIT ile. Floresan ve ışıldayan yoğunlukları sayımsal bir IVIS Spectrum Chicago Üniversitesi (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) Entegre Küçük Hayvan Görüntüleme Araştırma Kaynak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Kanser Araştırma Virginia ve DK Ludwig Fonu tarafından desteklenen, Akciğer Kanseri Araştırma Vakfı (LCRF), Prostat Kanseri Vakfı (PCF), ve Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA014599). fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
IVIS Spectrum In Vivo Görüntüleme SistemiKumpas Yaşam Bilimleri124262In Vivo görüntüleme sistemi
LivingImage 4.0 YazılımıKumpas Yaşam Bilimleri128165Görüntüleme yazılımı
VAD-MGX Araştırma Anestezik MakinesiVetamacVAD-MGXİnhalasyon anestezi makinesi
DMEMGibco11965-118Hücre kültürü reaktifleri
DPBSGibco14190250Hücre kültürü reaktifleri
Penisilin / Streptomisin, sıvı (10.000 ünite penisilin; 10.000 μ g streptomisin)İnvitrojen15140163Hücre kültürü reaktifleri
HBSSThermoFisher24020117Hücre kültürü reaktifleri
Buprenex Enjeksiyonu (0.3 mg/mL)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-5Buprenorfin hidroklorür
İkizler Koter SistemiBraintree ScientificGEM 5917Splenektomi için elde tutulan koter
, Mikro Klip; Düz; 70 gram basınç; 1,5 mm Klips Genişliği; 10 mm Çene UzunluğuRoboz Cerrahi AletRS-5426Hemoclip: Dalak enjeksiyonu sonrası hemostaz aletleri
D-lusiferin, potasyum tuzuGoldbio TeknolojisiLUCK-1GLuciferin potasyum tuzu
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985062Azaltılmış Serum Ortamı
TC20 Otomatik Hücre SayacıBIO-RAD1450102Otomatik hücre sayacı
JMP10 yazılımı SAS EnstitüsüVeri analiz yazılımı
BD FACSAria II hücre sıralayıcıBD BiocsiencesHücre sıralayıcı

Kaynaklar

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714(2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821(2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141(2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650(2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Karaci er MetastazIVIS G r nt lemeBiyol minesans G r nt lemeFloresan G r nt lemeSplenik EnjeksiyonSplenektomi Prosed rHCT116 H creleriDif z L minesan G r nt leme Tomografisi
İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.