Yöntem makalesi

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

DOI:

10.3791/54707

⸱

30 Aralık 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yollarını incelemek için güçlü araçlardır. Olası deneylerin spektrumunu genişletmek için, akış sitometrisi kullanarak optik olarak kontrol edilen maddeleri gerçek zamanlı olarak incelemek için bir cihaz geliştirdik: LED Thermo Flow.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetik araçlar, karmaşık sinyal yolakları içindeki hemen hemen her sinyal molekülünün izole, işlevsel araştırmalarına izin verir. Önemli bir engel, ışığın hücre örneğine kontrollü bir şekilde verilmesidir ve bu nedenle optogenetik çalışmalar için en popüler araçlar mikroskopi tabanlı hücre analizleri ve in vitro deneylerdir. Akış sitometresi, tek hücre çözünürlüğünde binlerce hücreyi hızlı bir şekilde ölçme yeteneği de dahil olmak üzere mikroskoba göre büyük avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, optogenetikte henüz yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, optogenetik ve akış sitometrisinin gücünü birleştiren bir cihaz sunuyoruz: LED Thermo Flow. Bu cihaz, akış sitometrik ölçümleri sırasında hücreleri belirli dalga boylarında, ışık yoğunluklarında ve sıcaklıklarda aydınlatır. Düşük maliyetle inşa edilebilir ve en yaygın akış sitometreleri ile kullanılabilir. Faydasını göstermek için, Dronpa proteinlerinin foto anahtarlama kinetiğini in vivo ve gerçek zamanlı olarak karakterize ettik. Bu protokol hemen hemen tüm optik olarak kontrol edilen maddelere uyarlanabilir ve olası deney setini önemli ölçüde genişletir. Daha da önemlisi, yeni optogenetik araçların keşfini ve geliştirilmesini büyük ölçüde basitleştirecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onlar yolları 1-4 sinyal kablolarını deşifre etmek için kullanılabilir, çünkü optogenetic araçlar kısmen, popülerlik kazanmaktadır. Işıkla aydınlatıldığında, kendi yapısını ve bağlanma afinitesini değiştirme fotoaktıfleştırılebılır proteinlerin yeteneğine dayanmaktadır. Sinyalizasyon elemanları bu proteinlerin kaynaştırarak karmaşık hücre içi sinyal yollarının 5-12 içinde tek bir oyuncunun belirli düzenlenmesi için izin verir. Sonuç olarak, bir sinyal yolu yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile ele alınabilir.

Çoğu hücre bazlı Optogenetic çalışmalarda biyokimyasal analiz 11,12 ardından ışık varlığında ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tasarımı ve Aygıtı Bina

  1. Pilot Deneyler
    NOT: Belirli bir optogenetic aracı ve hücre tipi için gerekli olan ışık yoğunluğu önemli ölçüde değişebilir. prototip Pilot deneyler gerekli minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek yararlıdır. Aşağıdaki deneyler için kullanılan Optogenetic aracı Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon konstruktu olup. Dronpa dizisi ticari (Malzeme Listesi) elde edildi. Uzun bir bağlayıcı ifade yapısı, molekül-içi (ve moleküller arası) dimerlerinin oluşturulması için izin vermek için iki Dronpa diziler arasında klonlandı. aşağıda tarif edilen kademeler bir çok Optogenetic araçları veya optik olarak kontrol edilen maddel....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir Akış Sitometre LED Thermo Flow kullanarak

Cihazın bir işlevsel çekirdek ışıkları içe bakan dairesel bir biçimde düzenlenir LED silindirik bir bölme olabilir. Bu bölme ışıklarının sıcaklığı, hem de hücre örneği kontrol edilmesi için izin veren bir su ve pompa bağlanabilir. LED'ler bir transformatör bağlı ve dolayısıyla her dalga boyu için ışık yoğunluğu ayrı ayrı kontrol edilebilir. Cihazın merkezi çoğu standart akış sitometr.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LED Thermo Akış bir akış sitometresinin içinde optogenetic araçları incelemek için yenilikçi bir cihazdır.

Şimdiye kadar, optogenetic numuneler sadece mikroskopi lazerler veya el feneri cihazlarla 11,12 ile aydınlatılan edilmiştir. örnek el feneri açısı ve mesafeye bağlı olarak, aydınlatma miktarında önemli değişkenlik deneyler arasında bekleniyor. Ayrıca, tek bir kişi bir deney çalışabilir fenerleri sayısında bir sınır yoktur. Bu deneysel repertuar ve tekrarlanabilirlik kısıtlar........

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cihazı yaptığı için Freiburg Üniversitesi'nden J. Schmidt'e teşekkür ederiz. P. Nielsen ve D. Medgyesi'ye bu el yazmasını destekleri ve eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, SFB746 aracılığıyla Deutsche Forschungsgemeinschaft ve Alman Araştırma Vakfı'nın (GSC-4, Spemann Graduate School) Mükemmellik Girişimi tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam FACS tüpüThermo Fisher Scientific; Waltham, ABD14-961-26Borosilikat cam tüpler 12x75 mm
Akış SitometresiBD Bioscienceg; Heidelberg, AlmanyaFortessa IIÖzel Sipariş
Dronpa: pcDNA3-mNeptün2-NAddgene; Cambridge, ABD41645
PolyJetSignaGen, Rockville, ABDSL100688
LED 505 nmAvago Teknolojileri; Boeblingen, AlmanyaHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Teknolojileri; Boeblingen, AlmanyaUV5TZ-400-15
Pleksiglas tüp 15 mmMaertin; Freiburg, Almanya76999
Pleksiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Almanya692230
Pleksiglas 2,5 mmMaertin; Freiburg, Almanya692225
Pleksiglas 1,5 mmMaertin; Freiburg, Almanya692215
PVC karo 5 mmMaertin; Freiburg, Almanya690020.005
PVC karo 6 mmMaertin; Freiburg, Almanya690020.006
PVC blok 50 mmMaertin; Freiburg, Almanya690020.050
RPMIInvitrogen, Yaşam Teknolojileri; Darmstadt, Almanya61870-010
2-MerkaptoetanolEMD; Almanya805740
FCSPAN Biyoteknoloji; Aidenbach, AlmanyaP30-3302
Penisilin / Strptomisin (10.000 U / mL)İnvitrojen, Yaşam Teknolojileri; Darmstadt, Almanya15140-122
Acrifix pleksiglas yapıştırıcıEvonic industries, Essen, Almanya1R0192
Tangit PVC-U yapıştırıcıHenkel, Dü Sseldorf, Almanya

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Wein....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

İlgili makaleler