Yöntem makalesi

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme Drosophila Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

DOI:

10.3791/54764

⸱

29 Aralık 2016

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Drosophila gastrulasyonunun canlı görüntülerini yakalamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, erken gelişimde yer alan apikal daralmayı daha iyi anlamamızı ve doku yapısı modifikasyonu sırasında hücresel hareketleri yöneten mekanizmaları daha fazla analiz etmemizi sağladı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrulasyon gibi Drosophila olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. Bu morfolojik değişim de mezenkimal geçiş (EMT) için epitel olarak kabul edilmektedir. EMT düzeninin bozulması fibroz ve kanser metastaz ile ilişkilidir. EMT, moleküler bir dizi mekanizma tarafından kontrol edilir dair yeni kanıtlar vardır. apikal daralma kontrol gibi, pek çok önemli genler de bilindiği gibi kanser metastazı gözlenen EMT önemli faktörler olduğu. Drosophila gastrulasyon sırasında EMT gibi, epitel hücreler şeklini değiştirmek için indüklenebilir ve çeşitli hücre tipleri karşı hücre kaderine yönlendirmek için yeniden programlanması. Burada embriyonik gelişimin bu aşamasında morfogenetik hücresel hareketler ve hücre kaderi kimlik başlatılmasını tahlil Drosophila gastrulasyon sağlam bir görüntüleme yöntemi sağlamaktır. Bu yöntemi kullanarak, c tespitell gastrulasyon sırasında yeniden düzenlenmesi ve GFP kullanarak gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini göstermek DE-kaderin etiketli.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrulasyon Drosophila 1,2 olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. İlginçtir ki, delil ortaya çıkan bu süreç, mekanik ve moleküler mekanizmaları 3 arasındaki etkileşim yoluyla düzenlenir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, gastrulasyon önemli bir işlemdir mezenkimal geçiş (EMT), epitelial ayrıca kanser metastazı 4-8 insan hastalık süreçlerine dahil edilir. Apikal daralma kontrol gibi birçok genler de bilindiği gibi kanser metastazı 9 gözlenen EMT önemli etkenler olarak. Böylece, gastrulasyon sırasında apikal daralma yukarıda belirtilen düzenleyici mekanizmaların araştırılması ve kanser metastazı anlayışımızı geliştirmek için mükemmel bir model. Bu tekniğin avantajı, bu nedenle, gerçek zamanlı ve gastrulasyon zamanda hücre hareketi dikkate ki, biz olacakkanser metastazı yanı sıra gastrulasyon rol oynayan genleri ekrana mümkün.

Nispeten bilinmeyen, ancak, hücre-hücre yapışması apikal daralma 1 merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. Drosophila genetiği iyi düzenleyici moleküler mekanizmaları keşfetmek tek bir hücre düzeyinde araştırmaları için uygundur. Bu model gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini ortaya çıkarmak için bize sağlayacaktır. Ayrıca, bu yöntem, kanser metastazı rol oynayan genleri taranması için kullanılabilir. Drosophila gastrulasyon yakalayan canlı görüntüleri daha daha ayrıntılı doku yeniden düzenleme düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak sağladı. Bu yazıda bunu başarmak için basit bir yöntem kapsamlı bir açıklama sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: DE-cad :: GFP 10: Bu çalışmada kullanılan transjenik sinekler şunlardır.

Elma Plate 1. Hazırlık

  1. Mikrodalgada 12.5 g ağar, 125 mL% 100 ticari olarak temin elma suyu, 12.5 g glikoz ve 375 mL H2O ısı karışımının bir karışım hazırlayın ve 3 cm hücre kültürü çanağı içine dökün. ileride kullanım için 4 ° C'de karışım saklayın.
  2. elma plakasını hazırladıktan sonra, sinekler yumurta bırakmaya izin bunun üzerine yoğrulmuş maya hamur ince bir tabaka ekleyin.

2. Embriyo Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Protokolü

  1. dostum ve daha sonra yoğrulur maya kaplı bir elma plaka üzerinde bir gecede yumurtlamak için bir şişe yaklaşık 50 sinekler (25 erkek ve 25 kadın) yerleştirin. Şişenin ağzında elma suyu plakasını ayarlayın. baş aşağı bir kuluçka şişesi bulundurun. Inci istemi için alüminyum folyo ile plastik Drosophila stok şişeleri Wrape daha fazla yumurta bırakmaya uçar.
  2. Ertesi sabah, bir yenisi ile eski elma suyu plakasını değiştirin.
  3. sinekler alüminyum folyo ile sararak şişeyi 3 ila 4 saat süreyle yumurtalarını edelim.
  4. Üç dört saat sonra, bir fırça veya pamuk feci kullanarak elma suyu plaka embriyo süzgeç embriyolar toplamak ve PBS ile yıkayın. 12 oyuklu kültür tabaklarında embriyo PBS ile 2 veya 3 kez daha yıkanır.
  5. 12-Kaynak kültür tabağı içindeki 5 dakika için% 50 çamaşır suyu ile embriyolar Dechorionate.
  6. dechorionation işleminden sonra, PBS ile embriyolar, 2 ila 3 kez daha yıkanır.
  7. PBS basıp evre kendi sınırları şeffaflık seviyesine göre mikroskop altında 5 embriyoları içeren bir 3 cm hücre kültürü çanak embriyolar aktarın. 200 uL pipet kullanarak aşamalı embriyolar pipetle.
  8. Sonra, bir cam lamel seçilen iki embriyo yerleştirin ve ince bükülmüş kağıt mendil ile aşırı PBS kaldırmak. yukarı embriyolar dorsal yüzü yönlendirmekince bükülmüş kağıt mendil kullanarak lamel. Bundan sonra, ince bir iğne ve bükülmüş kağıt mendil kullanarak silikon gres ile cam lamel embriyolar takın.
  9. slayt altındaki biraz boşluk bırakarak, embriyolar üzerinde halokarbon yağı 700 küçük bir damla ekleyin ve baş aşağı girintili slaytta embriyoları içeren lamel yerleştirin.
  10. Konfokal görüntüleme sistemi, bir Argon / 488 lazer ve bir yağ daldırma objektif (63X) ile embriyolar inceleyin.
    NOT: Uygun gelişim aşamasında embriyo belirlenmesi gastrulasyon olayın görüntülerini yakalamak için önemlidir. Bu koşullar altında, neredeyse tüm embriyolar analiz embriyo bir yetişkin olarak geliştirmek için daha fazla kültür edilebilir en az bir aşama 14 kadar normal gelişim gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Drosophila embriyo gastrulasyon olaylarını ve embriyo hazırlama prosedürünün genel bir bakış (Şekil 1) göstermektedir. Hücre zarları DE-kaderin :: GFP ve hücre hareketlerinin canlı görüntüleme Drosophila gastrulasyon sırasında yapılır (Şekil 2) kullanılarak etiketlenir. DE-kaderin GFP sinekler bize hücre yapışma kavşakları görselleştirmek için izin beri, biz apikal hücre şekli ve bu sistemi kullanarak hareketlerini takip edebiliyoruz. Da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophilla1'deki gastrulasyon sürecinin canlı görüntülerini yakalamak için daha önce benzer bir prosedür bildirmiş olsak da, burada tanımladığımız yöntem ayrıntılıdır ve endojen kaderin ekspresyonunu izlemek kolaydır ve bu nedenle gastrulasyonda yer alan anahtar faktörlerin genetik taraması için oldukça yararlıdır. Bu görüntüleme prosedüründe başarıyı en üst düzeye çıkarmak için girintili bir slayt kullanmak önemlidir. Mekanik basınç bazen embriyonik ölüme neden olur. Bu nedenle, herhangi bir mekanik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı (HT), Takeda Bilim Vakfı (HT) ve Özel Üniversitelerde Stratejik Araştırmalar Vakfı için MEXT Destekli Program (HT) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Halokarbon yağı 700SigmaMKBH 5726
Vakum gresi SilikonBeckman335148
Cam lamelMatsunami camKalınlığı No124 - 36 mm
Embriyo starinerCorningCorning3477
Plastik Drosophilla Stok ŞişeleriHitecMKC-100
DE-Cadherin knock-in sineklerREF (10)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Apikal DaralmaKonfokal G r nt lemeZaman Atlamal G r nt lemeEpitelyal Mezenkimal Ge iEmbriyonik Geli imGFP Etiketli

İlgili makaleler