Yöntem makalesi

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

13.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54978

⸱

3 Aralık 2016

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS, The University of Edinburgh

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Embriyonik gün 15 (E15) murin metatarsal kemiklerini incelemek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Endokondral ossifikasyonun bu son derece fizyolojik ex vivo modeli, tek tabaka veya 3D kültürdeki hücrelerden daha in vivo duruma daha yakın koşullar sağlar ve kemik büyümesi ve gelişimini araştırmak için hayati bir araçtır.

Özet

Endokondral ossifikasyonun temel süreci, sağlıklı bireyde rahatsız gelişimi ve/veya uzunlamasına kemik büyümesini önlemek için sıkı bir düzenleme altındadır. Bu nedenle, insan ve hayvan hasta yararına yönelik ilerlemeler sağlamak için bu tür bozukluklarda yer alan temel moleküler mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı ilerletmemiz zorunludur. Fare metatarsal organ eksplant kültürü, in vivo olarak gözlemlenen kültürdeki kemiklerin büyüme hızı taklidi olarak endokondral ossifikasyon ve kemik büyümesini incelemek için oldukça fizyolojik bir ex vivo modeldir. Benzersiz bir şekilde, metatarsal organ kültürü, kondrogenezin farklı aşamalarında kondrositlerin incelenmesine izin verir ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini korur, bu nedenle in vivo duruma tek tabaka veya 3D kültürdeki hücrelerden daha yakın koşullar sağlar. Bu protokol, E15 murin embriyolarının arka ekstremitesinden embriyonik metatarsalların karmaşık diseksiyonunu ve endokondral ossifikasyonu ve longitudinal kemik büyümesini incelemek için yapılabilecek sonraki analizleri ayrıntılı olarak açıklar.

Giriş

iskelet iyon homeostaza, lokomosyon uzanan bir dizi fonksiyon vardır, son derece karmaşık, dinamik ve karmaşık bir organdır. Kemik ve kıkırdak oluşan bu iskeletinin yapısal, biyokimyasal ve mekanik bütünlük 1 muhafaza etmek üzere yapmaktadır fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarının oluşur. İskeletin temel işlevlerinden biri gelişme ve büyüme rolü vardır. Bu süreçler sıkı endokrin ve genetik kontrolü ile düzenlenir çoklu hücresel popülasyonların orkestrasyon gerektirir.

Düz kemikler gibi kürek kemiği, kafatası ve sternum hariç, memeli iskelet endokondral kemikleşme olarak bilinen süreçte oluşur. Düzenlenmiştir, her iki moleküler ve mekansal bu işlem, mezoderm 2 öncelikle türetilen mezenkimal hücrelerin yoğunlaştırılması ile başlar. transkripsiyon faktörü SOX9 etkisi altında, hücreler thsıkıştırmaların e iç ifade ve tip II kollajen ve Agrekanın olarak kıkırdak spesifik hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri salgılayan, kondrosit içine ayırt. Yoğuşma marjı en Hücreler muhtemel kemik 3 çizen I kolajen ve Perikondriumun oluşturan türünü ifade eder. Daha sonra, perikondriyumda ve osteoprogenitor transkripsiyon faktörleri, Runx2 ve Osterix 4 ifadesi yönettiği, osteoblastlar içine ayırt. Bu osteoblast baskın yol açar ve bu katman kemiğin orta bölümünde çevresinde bir mineralize kemik yaka oluşturan periost yeniden adlandırıldı. Kıkırdaklı iskele periost ve işgali damar penetrasyon, onunla getiren haematopoetically kondrosit kalıntıları ve kıkırdak matrisin 5 çok rezorbe kemik rezorbe hücreleri, osteoklastlar, türetilmiş oluşur. oluşan boşluklar birincil kemikleşme sebebiyet veren osteoprogenitor tarafından doldurulurgiderek diyafizinde çekirdeğini kaplayan ve periost ile birleşir merkezi. Diğer hücreler kemik iliğinde neden olmaktadır. Doğumdan etrafında, kan damarları ve osteoprogenitor ikincil kemikleşme merkezini oluşturmak üzere gelişmekte olan diafizin her iki tarafında (epifiz) de kıkırdak zengin matris nüfuz. Epifiz büyüme plağı - - bütün uzun kemiklerin 6 doğrusal büyüme koordinasyonundan sorumludur uzun kemiklerin iki ucundaki epifiz ve diyafizine arasında yer alan kıkırdak bir grup.

Büyüme plağı içindeki kondrositler başlangıçta çoğalırlar ve daha sonra transkripsiyon ve büyüme faktörlerinin sıralı ifadesi tarafından koordine morfolojik farklı bölgeleri, yoluyla ilerleme. bu olaylar dizisi doruk noktası, bu kıkırdak öncüsünün merkezinde kondrosit hücre döngüsü ve hipertrofisi çıkış olduğunu. Hipertrofik kondrositler güçlü tip X kolajen ve matris metalloproteinaz ifade-13 (MMP13) ve boyuna büyüme yönünde onların hatırı sayılır hacim genişleme memelilerde 7,8 kemik büyümesine en büyük katkıyı sağlar. Ayrıca, hipertrofik kondrositler matriks veziküllerinin serbest yoluyla çevreleyen ECM'yi mineralize membran sınırlı yapılar fosfatazlar dahil (doku spesifik olmayan alkalin fosfataz (TNAP) ve PHOSPHO1) ve kalsiyum kanal proteinlerin (anneksinler yoluyla amorf kalsiyum fosfat üretimi için uzman ) 9-11. Bu kalsifiye kıkırdak osteoklast işe ve matris rezorpsiyonu ile sonuçlanan altta yatan kemik iliğinden kan damarlarının tarafından işgal edildi. Bu hızla mineralize olan osteoid tabakası yatıp kalsifiye kıkırdak kalıntıları yüzeyine osteoblast göç ve uyum izlemektedir. Primer spongioz dokuma kemik daha sonra ikincil sünger 12 lameller kemiğe tamir edilir. epifiz füzyon sonuçlarıendokondral kemikleşme 13 durması.

Rahatsız geliştirme ve / veya boyuna kemik büyümesini 14 önleyecek şekilde endokondral ossifikasyon çok endokrin ve parakrin hormonlar ve büyüme faktörleri tarafından sıkı yönetmelik altındadır. Bu süreçleri destekleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların daha iyi anlaşılması, insan yararına yönelik klinik ilerlemeler bizim peşinde zorunludur. Benzerlik ve farklı yaş, konum ve türlerin büyüme plakaları arasındaki farklılıkları içine Önceki araştırmalar büyük ölçüde büyüme plağı dinamiklerini 15,16 çevreleyen fizyolojik mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlamıştır. Çevrelerinden kondrositlerin ayrılması, Col2a1 17 gibi önemli belirteçler ifade kaybı eşliğinde, farklılaşmadan neden olabilir Ancak, izole edilmiş kondrositlerin çalışma zordur.

Fare metatarsal organı eksplant kültürü, piHollanda'da Prof. Elisabeth Burger ve meslektaşları tarafından oneered, kültür in vivo 18 görülene taklit kemiklerin büyüme oranı olarak endokondral ossifikasyon ve kemik büyümesi çalışmak için son derece fizyolojik ex vivo modeldir. Benzersiz metatarsal organ kültürü farklı kültürleri 19-21 hücrelerin daha vivo duruma yakın koşullarının sağlanması, kondrogenezisi farklı aşamalarında kondrosit incelenmesine olanak tanır ve hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri tutar. Ayrıca, bu model, birincil kondrosit kültürlerde mümkün değildir lineer kemik büyüme doğrudan incelenmesi için izin verir. Aynı zamanda, bu nedenle büyüme plağının yerel etkileri spesifik analiz izin sistemik ve lokal faktörlerin ayrılması için izin verir.

metatarsalların kültürü birçok parametre incelenmesi için izin verir. toplam uzunluğunun ve mineralli bölgelerinin günlük ölçümleresaslar, standart faz kontrast mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı ile gerçekleştirilebilir. In situ hibridizasyon ve immünohistolojik boyama histolojik, hali hazırda hücresel ve moleküler varlıklar, geleneksel hücre kültürü metotlarına göre önemli bir avantaj uzaysal çözünürlüğü sağlar metatarsal bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Immünohistokimyasal yaklaşım kıkırdak 22 çoğalan algılama ve 5-bromo-2'-deoksiüridinin (BrdU) alımı miktarının içerir. Buna ek olarak, metatars dokuların daha fazla işlem mRNA (RT-qPCR), protein ve hücre içi sinyal analizi (Western lekeleme) ya da lipit bileşimi (kütle spektrometrisi) aşağı doğru analize imkan vermek üzere gerçekleştirilebilir. Bugüne kadar çoğu araştırmalar doğum sonrası hayvanlardan kültür embriyonik metatarsallann yerine metatarsallann kullanın. daha hızlı büyümek ve explo olabilir: her iki model de bilgilendirici olabilir iken, embriyonik kemik çalışma birçok avantajı vardırkısıtlı erişim vardır mineralizasyon süreci 23-25 başlangıcı ve ilerlemesini incelemek için.

Bu protokol ayrıntılı olarak embriyonik gün 15 (E15) fare embriyolarının arka bacak embriyonik metatarsallara karmaşık diseksiyonu açıklar. Ayrıca, anatomik farklı metatars büyüme ve mineralizasyonu gösterilmiştir.

Protokol

Hayvan denekleri Prosedürleri Verilen veya Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Bred Konut ve Bakım için Uygulama Kodu yayınlanan UK Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve hayvanlar Home Office ile uyumlu tutuldu uygun olarak yapılmıştır.

Not: vahşi tip C57BL / 6J fareler kullanılarak yapılan deneyler iyi kurulmuş ve aşağıda tarif edilmiştir. Büyüme ve mineralizasyon hızları, burada ayrıntılı olarak açıklanan farklı olsa da, farklı fare türüne embriyonik metatars Benzer in vitro kültürlenebilir.

1. Diseksiyon Koşulları ve Araçların hazırlanması

  1. medya ve embriyonik esaslar kısırlık sağlamak için laminer akış kaputu tüm medya hazırlanması, dokuların diseksiyonu ve kültür çalışmaları yapmak.
  2. Kültür ve diseksiyon ortam kullanımdan önce 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde en az 1 saat boyunca dengelenmeye bırakın.
  3. diseksiyon sterilizemakas, Dumont # 5 ve Dumont # otoklav ile süper ince Vannas mikro bir makasla birlikte 4 cımbız (8 cm düz, 3 mm bıçaklar). Otoklavlamadan sonra,% 70 etanol içinde kullanmadan önce diseksiyon ekipman bırakın.

Diseksiyon ve Kültür Medya 2. Hazırlık

  1. Diseksiyon ortamı hazırlayın
    1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (1:13) içinde α-Minimum Esansiyel Ortam (nükleosit olmayan, αMEM) seyreltilir ve filtre, bir 0.22 um, 33 mm çapında bir şırınga yoluyla sterilize edilmesinden önce 2 mg / m l'de sığır serum albümini (BSA) tekrar süspansiyon filtre.
      Not: Diseksiyon ortamı yapılabilir filtre sterilize edilir ve belirsiz -20 ° C 'de parçalar halinde saklandı.
  2. Kültür ortamı hazırlayın
    1. (Her biri iyi bir 24-yuvalı kültür plakası) kültür ortamında 300 ul kültür, embriyonik metatarsalların. / BSA hac% 0,2 ekleyerek kültür ortamı hazırlayın; / Ml L-ASCO 5 ugrbic asit fosfat; 1 mM β-gliserofosfat (βGP; opsiyonel - Sonuçlar bölümüne bakınız); 0.05 mg / ml gentamisin ve αMEM 1.25 ug Amfoterisin B ve filtre, bir 0.22 um, 33 mm çapında bir şırınga filtre ile sterilize edilir.

3. Fare Embriyonik metatarsal Diseksiyon ve Kültür

  1. İngiltere'de ev ofis kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon ile, 15 günlük yaşındaki embriyoların barındıran, hamile fare itlaf
  2. hayvan sırtüstü yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtülerek cildin dezenfekte edin. Kullanarak diseksiyon makas deri ve karın boşluğuna maruz periton hem delici, orta hatta büyük bir kesi yapmak.
  3. vücut boşluğunda dorsal bölgedeki hayvan iki rahim boynuzları bulun. öncelikle diseksiyon makas ile dikkatli kesiler ile mesometrium her uterin kurtararak ve sonra nihayet kendi üssünde serbest rahim boynuzları keserek rahim boynuzları çıkarın. Placdiseksiyon ortama e rahim boynuzları.
  4. uterin horn boyunca implantasyon siteler arasında keserek her bir embriyo ayırın ve forseps kullanılarak bireysel Keselerden embriyolar kaldırmak. İngiltere'de ev ofis talimatlarına uygun olarak kafaları kesilmek suretiyle itlaf embriyolar
  5. % 70 etanol ile püskürterek cildin dezenfeksiyonu sonra, proksimal femur etrafında incising embriyolardan arka bacaklarda kaldırmak için Vannas mikro makas kullanın. kaldırılır sürede bu arka bacak kadar sağlar. metatarsal diseksiyon öncesinde diseksiyon orta batık bir petri içine arka bacaklarda yerleştirin.
  6. bir mikroskop altında, kısma ve sabit arka ekstremite tutan içinde 4. cımbız kullanarak iken 5. cımbız kullanarak çekerek, embriyonik ayak çevreleyen deri kaldırmak başlar. Bu en etkili tibianın seviyesinde cildi açgözlü ve bilek doğru çekerek gerçekleştirilir. Bu aşamada makas kullanımı kesmek içinÇok ince deri gerekli değildir.
  7. Dikkatle 4. cımbız ile embriyonik ayak tarsals tutun ve 5. cımbız kullanarak ve atın tarsals yakın kapalı kısma birinci ve beşinci metatarsallann çıkarın.
  8. aynı pozisyonda tutulan ayak, kalan üç falanks ve metatars arasında bağ dokusunu bozmaya 5. cımbız kullanın. metatarsallara gelen falanksı kaldırmak için falanksların ve metatars arasındaki eklem 5. cımbız ucu yerleştirin.
  9. Son olarak, tarsals ve metatars arasında bağ dokusunu bozmaya 5 cımbız # kullanın. Yine tarsals gelen tarsals ve metatars ve yavaşça serbest metatars arasında ortak alanda içerisinde 5. cımbız ucu yerleştirin.
  10. Yavaşça taze diseksiyon orta içerisinde 4. cımbız ve yer ile artık özgür metatarsallann pick up.
    NOT: Dikkatli diseksiyon her embriyodan 6 metatarsallann sağlamalıdır.
  11. Gerekli tüm metatars disseke edildiğinde, dikkatli bir şekildayrı ayrı kültür ortamı 300 ul ihtiva eden önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakalara lly yer metatarsalların. 14 güne kadar bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de kültür metatarsalların.
    NOT: Bu onların mineralizasyon yeteneği 26 etkilediği kültürün en azından 5 gün kadar E15 kültürlerin ortamı değiştirmek etmeyin. Bunun nedeni tam olarak bilinmemektedir, ancak doğrusal büyüme ve matris mineralizasyon metatars salınan büyüme faktörleri tarafından uyarılması bağlı olabilir.

4. Analiz ve metatarsal Kültürlerin Manipülasyon

  1. Diseksiyon (gün 0) gününde bir dijital kamera takılı ve görüntü analiz yazılımı ile bir mikroskop kullanılarak başlangıç ​​boyuna ölçümler yapmak. o kültürün birkaç gün sonra göründüğünde merkezi mineralizasyon zonunun uzunluğunu ölçün.
  2. Gerekli periyodik olarak, bu noktada m kültürünün son güne kadar (genellikle her 2. gün) daha fazla ölçümler yapmaketatarsal kemikler (tartışıldığı) Gerekli sonuçları bağımlı işlenir.
  3. Çeşitli dışsal faktörlerle metatarsal organı kültürlerin Supplement orta büyüme faktörleri, hormonlar ve kültür 22,24 gün 0'dan farmakolojik ajanlar, örneğin. Bu tür tüm çalışmalarda, muamele edilmemiş metatarsallar gerekmektedir kontrol eder.
    NOT: Kontrol kemikleri kontralateral bacak eşdeğer rudiment olduğu tavsiye olmasına rağmen, lineer büyüme veya kültür E15 2 nd cevherleşme potansiyeli herhangi bir farklılık olmamıştır, 3. ve 4. metatarslarda (aşağıya bakınız, Şekil 2) .

Sonuçlar

Bu yöntemin amacı, uzunlamasına kemik büyümesi ve ECM mineralizasyon incelenmesi için embriyonik metatarsallann ve kültürünü onları izole etmek oldu. ışık mikroskobu ile görüntülendi burada tarif edildiği gibi, bizim protokolünü kullanarak, embriyonik metatarsal kemikler başarıyla disseke edildi. Şekil 1 'de gösterildiği gibi yapılan metatarsal kemikleri, ölçümleri, bunların ECM boyuna uzunluğu büyüme ve mineralize etme kapasitelerini gösteren (Şekil 2 ve 3). Matrisin mineralizasyonu birinci kemik güdük orta diafizde not edilir ve kolay bir ışık mikroskobu ile görülür. kalseinin alımı yeni kurulan mineral gelişmiş görselleştirme sunabilir rağmen hiçbir boyama gereklidir.

Bugüne 22,27,28 embriyonik metatarsallann kullanan Çalışmalar disseke 2 nd toplanmış olması, 3. ve 4. (central üç) metatars, in vitro büyüme ve mineralizasyonu varsayarak karşılaştırılabilir olması. fare metatarsallara in vivo gelişimsel, ancak, 3. ve 4. basamak öncesinde tüm diğer metatars ve falanks 29 mineralizasyon delil olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrı ayrı izole ve kültürlü E15 2 nd büyüme ve mineralizasyon potansiyelinin değerlendirilmesi, 3. ve 4. metatarslarda kültür 7 gün (Şekil 2) sonra mineralizasyon görünüm veya ölçüde farklılık gözlenmedi. başlangıca yüzde artış fark yok kültür döneminde bulunmuştur. Mineralizasyon potansiyelinde hiçbir fark belirtildiği gibi 2. 3. ve 4. metatarsallann havuzu standart protokol gelecekteki çalışmalar için geçerlidir görünür.

Geleneksel olarak, araştırmacılar medyaya βGP ekledikECM mineralizasyon teşvik etmek, kültür embriyonik metatarsallara için kullanılır. Ancak, hücre kültürü çalışmalarda, TNAP enzimi βGP ihtiva osteojenik ortama ilave edilir ise, dış hidroksiapatit mineral tortulaşmasından dahi hücre 30 yokluğunda meydana geldiği gösterilmiştir. metatarsal mineralizasyonu yeteneği çeşitli mineralizasyon substratların ve agonistlerin etkilerini incelemek için, biz takviyeleri bir dizi içeren kültür ortamında E15 metatarsallann kültürlü ve görüntüleri ve uzunluk ölçümleri günlük olarak kaydedildi. Sonuçlar E15 metatarsal kemikler hala büyümek ve βGP yokluğunda kendi ECM mineralize belirtti. Metatarsalların βGP (Şekil 3) mevcudiyetinde kültürlenmiştir olarak askorbik asit içinde kültürlenmiş E15 metatarsal kemikleri yalnızca ortam uzunluk ve mineralizasyon karşılaştırılabilir artışlar göstermiştir.

Ayrıca lentivirüs kültürlenmiş metata ekzojen DNA transfekte etmek için kullanılabilir olduğunu göstermiştirrsals. Burada başarılı metatarsal başına 2 x 10 6, yeşil floresan proteini (GFP) virüs partiküllerinin kültür (diseksiyon örneğin gün) 0. günde metatarsal kemikleri transfekte edildi. Virüs transdüksiyonunu etkinleştirmek için, polibren, aynı anda 1 kültürlere ilave edildi: 500. Kültürler konfokal mikroskop (kullanarak 4 ile kuluçkalanmıştır önce, ortaya E15 metatarsal mineralizasyonu için gereken şekilde, 5 dakika, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), leke 'Resim ortam değişiklikleri ile, 7 gün boyunca bırakıldı ve daha sonra, doğrudan görselleştirilmiştir Şekil 4). kavram deneylerin Bizim kanıtı açıkça etkili transdüksiyon göstermektedir. Ancak onların transfeksiyon ve etkili gen manipülasyonu değerlendirmek için metatarsal kemiğin bütünlüğü boyunca bölümlerini incelemek ihtiyatlı bir davranış olacaktır.

figure-results-1
Şekil 1: Standart Metodoloji t Tedbir için kullanılanO Uzunluk ve Embriyonik metatarsallara mineralizasyonu Bölgesi. (A) kültür 0. günde E15 metatarsallara toplam uzunluğu ölçümleri (diseksiyon gün) metatarsal merkezi aracılığıyla çekilen. Kültür içinde yedi gün sonra, bir metatarsal toplam uzunluğunun (B) Ölçümleri. metatarsal hafif bir eğrilik edin. (C) kültüründe yedi gün sonra mineralizasyon zonu uzunluğu ölçümü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
E15 farelerin arka bacak w gelen Büyüme ve Anatomik Farklı E15 metatarsallardan Görüntüleme mineralizasyonu Kapasitesi ve 2. ölçümü, 3 ve 4 metatarslarda: Şekil 2.gerçekleştirildiği şekilde. (A) kültür dönemi boyunca 2., 3. ve 4. metatars seri görüntüler. Kültürlerin her gün gün 0 uzunluğu (B) yüzde artış. Kültür süresi boyunca 2., 3. ve 4. metatarsalların (C) mineral uzunluğu, toplam metatarsal uzunluğunun bir yüzdesi olarak ifade edilir. Veri, ortalama ± standart ortalama hatası (SEM) olarak ifade edilmiştir (n = 6). (D) Kültürün her gün C57Bl / 6J metatarsal uzunlukları. Veri temsil edilir, ortalama ± standart sapma (n = 6). Siyah çubuk = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: Yabani-tip büyüme ve mineralizasyon KapasitesiÇeşitli osteojenik Medya E15 metatarsalların kültürlü. (A), yalnızca, askorbik asit, 1 mM βGP, 3 mM fosfokolin, 1.5 mM kalsiyum klorür veya ortam ihtiva eden 3 mM kalsiyum klorid içinde kültüre metatarsalların seri ve görüntüler. Metatarsalların 0. günden uzunluğu (B) yüzde artış, çeşitli takviyeleri ile kültürlendi. Çeşitli ortamında kültürlenir metatarsalların (C) mineral uzunluğu, toplam metatarsal uzunluğunun bir yüzdesi olarak ifade edilir. Veriler, ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) ile temsil edilmektedir (n = 6). Siyah çubuk = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: GFP Virüs P E15 metatarsallara transfeksiyonumakaleler. (A) E15 metatarsal kemikleri kavramının kanıt gfp virüs partikülleri ile transfekte edilmiştir. (B) Kemikler, DNA görselleştirme için DAPI ile boyanmıştır. (C) Çift görüntüleri metatarsal kemiklerin bütünlüğü boyunca GFP virüs başarılı transfeksiyon göstermiştir. Beyaz barlar = 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

fare embriyonik metatarsallara kültürü endokondral büyüme ve mineralizasyon son derece fizyolojik bir model sağlar. İlk çalışmalar E15 fare metatars iskelet büyüme ve farklılaşma normal desen geçmesi onaylamıştır. Kıkırdak (kondrositler) ve kemik (osteoblastlar ve osteoklastlar) hücreleri ve bunların ilgili kollajen matris, in vivo olarak gözlenen ayırt edilemez. Ancak, bu modelin bazı tanınmış sınırlamalar vardır. osteoklast farklılaşması hızı (ancak farklılaşma kıkırdak değil) kemik büyümesi olarak bozulur. Kemik büyümesi in vivo gözlenen göre yaklaşık% 50 daha yavaş ve lokal faktörler (örneğin, IGF-1, BMP, vb) 31 üretimini etkileyen sistemik faktörler eksiklikler nedeniyle olabilir. Ayrıca, iyi bir kemik mekanik çevreye duyarlı olduğu bilinmektedir ve bu da C yanıt kültürlenmiş metatarsalların, için de geçerlidirmekanik yüklenme 32,33 olarak Hanges. Bu nedenle, yüksüz durumlarda, bu protokolde, mineralizasyon açıklanan ve mineral emilmesi bozulabilir. Bununla birlikte, metatarsal modeli doğrudan in vitro kültür sistemlerinde 2D ve 3D aracılığı ile mümkün değildir doğrusal kemik büyümesini ölçmek olanağı sunar.

Biz ilk kez, gerçekten E15 fare metatars ve diseksiyonu ve kültür katılan protokol kapsamlı bir açıklama sağladı, deneyler için 2., 3. ve 4. metatarsallann havuzu geçerliliğini doğrulamaktadır.

E17 / E18 metatarsallann yaygın (kültür içinde 14 günden fazla le) uzun süreler için ex vivo olarak büyümesi olağanüstü potansiyeli sayesinde kemik büyüme mekanizmalarını incelemek için kullanılır. Onlar embriyonik uzunlamasına kemik büyümesi üzerine büyüme faktörlerinin rollerini araştırmak için köklü bir modeldir.Ayrıca, doğum sonrası metatars diseksiyonu ve kültür sık olarak doğum sonrası kemik büyümesi ve fetal kemik büyümesi farklı 21 düzenlenmiş olduğu anlaşılmaktadır olarak doğum sonrası kemik büyümesi çevreleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılır. Kültürlü doğum sonrası metatarsallara gözlenen kemik büyümesi uzun vadeli çalışmalarda potansiyellerini sınırlayıcı ve bu doğum sonrası aşamada kemik büyümesi üzerine daha sistemik bir etkiye vurgulayarak, ancak embriyonik rudiments 25,34 gözlenen önemli ölçüde daha azdır. Gerçekten de, fareler 3 günlük sonrası metatarsalların tipik haliyle ölçülebilir bir artış 34 elde etmek için kullanılabilecek en son aşamasıdır.

Burada E15 embriyonik metatarsal kemikler izolasyonu için bizim protokol açıklar. E15 metatarsal kemiklerde hydroxyapaptite mineral olmaması da rakipsiz uzunlamasına kemik büyümesini çevreleyen sadece mekanizmalarını araştırmak için bir model, ama inisiyasyon sağlamak anlamına geliriskelet mineralizasyonu. Terminal hipertrofik kondrosit bölgenin mineralize matriks daha sonra mineralize edilen kemik spesifik matris (osteoid) bırakmaya osteoblast işgal için bir iskele sağlar ve böyle bu ilk mineralizasyon başarılı ve fonksiyonel kemik oluşumu 35 için hayati önem taşımaktadır. Nitekim E15 metatarsallann kullanan son raporlar bir dizi mineralizasyon süreci 28,36,37 araştırılması için kendi benzersiz yeteneği doğruladı. Ayrıca, araştırmacılar, kemik büyümesi / mineralizasyon ayarı dışında model olarak embriyonik metatarsallara potansiyelini vurgulayarak, anjiyogenez 38 bir model olarak E15 metatarsallara kullanımını tarif etmişlerdir.

Bizim tarif protokol laminer akış kaputu, diseksiyon gerçekleştirmek için bir mikroskop ve eksize rudiments kültürü için CO 2 inkübatör dahil olmak üzere yalnızca standart laboratuar ekipmanı gerektirir. Ayrıca, bir çok temel culOrta αMEM, BSA, antibiyotikler, antimikotikler ve L-askorbik asit ihtiva eden Ture (hidroksiprolin ve hidroksilizin sentezinde bir ko-faktörü, kollajen 39 üretimi için iki temel amino asitler), hayvan serası olarak tanımlanmamış katkı maddelerinin kullanımını önler . Geleneksel olarak, araştırmacılar, kültür embriyonik metatarsalların için kullanılan ortamlara βGP eklemiş ancak sonuçlar ortaya koyduğu gibi, ek bir fosfat kaynağı kullanımı, bu kültür sistemi başarılı mineralizasyonu için gerekli değildir. Bu ECM mineralizasyon destekleyen mekanizmaların anlaşılması bizim peşinde önemli bir bulgudur.

Metatars önce uzun kemik gelişimi 40 düzenlenmesine büyüme faktörü beta dönüştürme rolünü araştırmak için Smad2 dominant-negatif formları içeren adenovirüs ile enfekte olmuştur. Burada da t gösteren gfp virüs partikülleri ile, vahşi tip E15 metatarsal kemiklerin başarılı bir transfeksiyon ortayaşapka lentiviral teknikleri kolayca metatarsal kültürlerde gen ekspresyonu işlemek için kabul edilebilir. Benzer şekilde, metatarsal organ kültürü sistemi daha iyi kemik büyüme sürecinde belirli bir genin rolünü anlamak için genetik olarak değiştirilmiş farelerin kemik gelişimini karşılaştırmak için mükemmel bir modeldir. Daha önceki çalışmalar endokondral kemik büyüme sitokin baskılayıcı sinyalizasyon-2 (SOCS2) rolünü belirlemek için metatarsal organ kültürü sistemi kullanmışlardır. SOCS2 içinde eksik fareler metatarsal kemiklerin kullanılması, söz konusu büyüme hormonu insülin benzeri büyüme faktörü kendi boyuna büyüme bağımsız taklit edebilen göstermiştir (IGF-1), büyüme hormonu tedavisi 34 yanıt yok, vahşi tip metatarsal kemikleri farklı olarak, 41. Bu metatarsal kültürleri, farklı genler ve / veya endokondral kemik büyümesi üzerine dışsal faktörlerin etkilerini incelemek için manipüle edilebilir ölçüde vurgulamaktadır.

Özetle, detai sahipmanipüle edilebilir embriyonik metatarsal kemiklerin başarılı çıkarma ve kültür için bir yöntem açtı ve çeşitli analizler kullanılarak incelendi. Bu eks vivo modeli, bu nedenle tek tabaka ya da 3 boyutlu kültür hücrelerine göre daha fizyolojik bir model sağlayan, hem de kondrojenez farklı aşamalarında kondrositlerin içerdiği, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini tutar. Metatarsal organ kültürleri nedenle endokondral kemikleşme sorumlu moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir modeldir ve kemik fizyolojisi ve patofizyolojisi hem anlayışımızı ilerletmek için gerekli olan

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'ne (BBSRC) DH (BB/J01446X/1), CF ve VEM (Enstitü Stratejik Program Hibe Fonu BB/J004316/1) için minnettarız. Ayrıca Arthritis Research UK'ye KAS'a (20413) fon sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıntılı deneylerdeki yardımları için Bayan Elaine Seawright'a, lentiviral teknikler konusundaki yardımları için Dr. Neil Mackenzie'ye ve hayvan çalışmalarındaki yardımları için Bay Darren Smith ve Bay Alex Robertson'a (Roslin Enstitüsü BRF) teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Diseksiyon makasıWorld Precision Instruments14393Kullanmadan önce otoklav sterilize edin
Dumont #5 cımbızWorld Precision Instruments500342Kullanmadan önce otoklav sterilize edin
Dumont #4 cımbızWorld Precision Instruments500339Kullanmadan önce otoklav sterilize edin
SuperFine Vannas makasWorld Precision Instruments
Mutlak etanolFisher ScientificE/0650DF/17Nükleositler olmadan dH2O&alfa;-MEM'de %70 v/v'ye seyreltin
Thermo Fischer Scientific 
Sığır serum albüminiSigma AldrichA3059
Şırınga filtreleri (0.22 & mu; m) 33 mm çapMerck MilliporeSLGP033RS
Fosfokolin klorür kalsiyum tuzu tetrahidratSigma AldrichP0378Deneyden önce doğrudan ortama ekleyin
L-askorbik asit-2-fosfatSigma AldrichA89605mg / ml'de stok soution ve -20 & °C'de alikot hazırlayın; C
Kalsiyum klorür dihidratSigma AldrichC5080150mM'de stok soution ve -20 &°C'de alikot; C
β-gliserofosfat disodyum tuzu hidratSigma AldrichG94221mM'de stok soution ve -20&°C'de alikot yapın; C
GentamisinThermo Fischer Bilimsel 
Amfoterisin BThermo Fischer Scientific 
Nunc hücre kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu plakalarThermo Fischer Scientific 
PolybreneSigma AldrichH9268
DAPIThermo Fischer Scientific D3571
501778225610211571004915290018142475 Serisi

Kaynaklar

  1. Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
  2. Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
  3. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
  4. Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
  5. de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
  6. Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
  7. Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
  8. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
  9. Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812(2011).
  10. Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
  11. Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
  12. Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
  13. Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
  14. Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
  15. Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
  16. Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
  17. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
  18. Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
  19. Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
  20. Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
  21. Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
  22. Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
  23. Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
  24. MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
  25. Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
  26. Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
  27. Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
  28. Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
  29. Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
  30. Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
  31. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
  32. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
  33. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
  34. Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
  35. Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
  36. Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
  37. Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
  38. Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
  39. Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
  40. Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
  41. Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Embriyonik Fare Metatarsal KültürüKemik BüyümesiDiseksiyon ProtokolüHücre KültürüMineralizasyon AnaliziWestern BlottingİmmünohistokimyaRTQPCR
Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.