Yöntem makalesi

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test

11.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55007

⸱

3 Kasım 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

Bu makalede

Özet

Bu yöntem etkili bir kanser hücrelerinin damar invaziv yeteneğini test etmek zebrafish embriyolar kullanır. Floresan kanser hücrelerinin gelişmekte olan embriyo precardiac sinüs ve yumurta sarısı kesesinin içine enjekte edilir. Kanser hücresi vasküler invazyon ve damar dışına 24-96 saat sonra kuyruk bölgenin floresan mikroskobu ile değerlendirilir.

Özet

Kanser hücresi vasküler invazyonu ve ekstravazasyonu, metastatik ilerlemenin ayırt edici özelliğidir. Endotelin kanser hücresi istilasının geleneksel in vitro modelleri, tipik olarak, istilacı hücrelerin in vivo olarak maruz kaldığı sıvı dinamiklerinden yoksundur. Bununla birlikte, fare modelleri gibi in vivo sistemler, fizyolojik olarak daha ilgili olsa da, daha uzun deneysel zaman ölçekleri gerektirir ve izleme ve veri analizi ile ilgili benzersiz zorluklar sunar. Burada, kanser hücresi vasküler invazyonu ve ekstravazasyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin vererek bu teknik boşluğu kapatmayı amaçlayan bir zebra balığı testini açıklıyoruz. Yaklaşım, floresan kanser hücrelerinin, damar sistemi zıt bir floresan raportör tarafından işaretlenen şeffaf 2 günlük zebra balığı embriyolarının prekardiyak sinüsüne enjekte edilmesini içerir. Enjeksiyonu takiben, kanser hücreleri dolaşımda hayatta kalmalı ve daha sonra damarlardan embriyonun kaudal bölgesindeki dokulara ekstravazat yapmalıdır. Ekstravaze kanser hücreleri, sabit bir zaman noktasında floresan görüntüleme yoluyla canlı embriyolarda verimli bir şekilde tanımlanır ve puanlanır. Bu teknik, enjeksiyon bölgesini yumurta sarısı kesesine değiştirerek heterojen bir kanser hücresi karışımı arasındaki intravazasyon ve / veya rekabeti incelemek için değiştirilebilir. Birlikte, bu yöntemler kanser hücrelerinin ayırt edici bir davranışını değerlendirebilir ve metastatik fenotipe malign ilerlemeyi gösteren mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Metastatik hastalık kanser mortalite ve kanser hücresi yayılmasını sağlayabilmek 1 keşfedilmeyi beklemektedir birçok mekanizmalar önemli bir nedenidir. Başarıyla metastaz için bir kanser hücresi için, öncelikle dolaşım sistemi içine (intravasate) girin, primer tümörü çevreleyen stroma ile işgal gerekir, dolaşımdan transit çıkış (extravasate) hayatta ve son olarak uygulanabilir bir koloni kurmak uzak organ sitesinde 2'de. Intravasation ve damar dışına böylece metastatik kaskad önemli adımlardır, ancak her kanser hücresi bozarak ve endotel kavşaklar 3 ile göç de doğal olarak usta değildir. Aslında, kanser hücresi vasküler invazyonu çevreleyen ve işlem ayrıca iç ve dış faktörlerin 4 çeşitli etkilenebilir özel baskılar bir dizi bulunmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, ileri evre kanser saldırgan davranış prob teknikleri genellikle v odaklanmakmetastatik yayılması tahmin etmek için bir araç olarak, invaziv yeteneği ascular.

Çeşitli model sistemler in vitro kanser hücresi vasküler invazyon çalışma kolaylaştırmak için vardır. En vitro deneylerde kullanılan kanser hücreleri 6 tarafından sağlam endotel tek tabaka gerçek zamanlı bozulmasını izlemek için bir endotel bariyer 5 ya da elektrik Hücre Yüzey empedansını algılayarak, (ECIS) teknolojisi ile kanser hücre göçü değerlendirmek ya Transwell sistemleri içerir. Bu tahliller, tipik aksi bir endotel duvara kanser hücresi eki etkileyecektir akışkanlar dinamiği ve stromal faktörleri yoksundur. Bu sorun biraz stromal hücreler destekleyen endotelinin 3D kültür kaynaklanan perfusable vasküler şebekeler tarafından atlatılabilir edilir ve bu 3 boyutlu mikroakışkan sistemleri artık vitro mevcut seçeneklerin 7,8 ön planda temsil etmektedir. Yine de, bu yaklaşımlar fonksiyonel dolaşım sisteminin sağlam mikro ihmalve bu nedenle sadece in vivo modeller için parça atama.

En yaygın olarak vasküler invazyon in vivo modelde kullanılan nispeten kısa zaman ölçeği üzerinde meydana gelir ve metastatik yeteneği 9 genellikle göstergesidir için deneysel metastaz tahlilleri sık gerçekleştirilen edildiği fare,. Bu deneyler dolaşıma kanser hücrelerinin direkt enjeksiyon içerir ve bu nedenle metastaz, organların yani ekstravazasyon ve kanser hücresi kolonizasyon son aşamalarını modeli. Deneysel metastaz tahlilleri kanser hücre enjeksiyon yerinde göre farklılık ve organlar sonuçta analiz edildi. İlk deney türü, kanser hücreleri akciğer fareler ve kanser hücresi tohumlama kuyruk damarının içine enjekte edilir 10,11 izlenir. İkinci tahlil kemik mikroçevresindeki 12-14 doğru metastatik tohumlama yönlendirmek için intrakardiyak enjeksiyon gerçekleştiren, fakat aynı zamanda beyin 15 içerir. Üçüncü bir deneyde, kanser Cıarşın karotid artere dördüncü dağıtım yolu, beyin 17,18 kanser hücreleri taşıyan ise karaciğer 16 kolonizasyonunu izin vermek amacıyla dalak içine enjekte edilir. Ne olursa olsun kanser hücresi teslim yönteminin organ kolonizasyonu kabul deneysel uç ve genellikle lüminesans, histoloji, ya da PCR tabanlı teknikleri ile tespit edilir. Bir fare konak içinde deneysel metastaz deneyleri yürüten fizyolojik avantajlarına rağmen, bu deneyler hala tamamlamak ve analiz etmek için aylar haftalar gerektirir.

Zebra balığı (Danio rerio) modeli son zamanlarda kanser ilerlemesini 19,20 incelemek için yeni bir sistem olarak ortaya çıktı ve fareler 21-24 ile karşılaştırıldığında çok daha kısa bir süreye üzerinde fonksiyonel dolaşım sistemi içinde kanser hücresi damar invazyonu değerlendirilmesi için olanak sağlamaktadır. yöntem, endotelin yeşil resif mercan fluo ile etiketlenmiş olan şeffaf zebrafish gerginlik kullanırkdrl promotör, vasküler endotelyal büyüme faktörü 25 zebrabalıkları reseptör tarafından yönlendirilen rescent protein muhabiri. tahlilde, kanser hücreleri, bir kırmızı floresan işaretleyici ile etiketlenir ve 2 günlük embriyoların precardiac sinüs içine enjekte edilir. Anywhere 48 saat 96 arasındaki enjeksiyondan sonra, damarsal dışında ve embriyoların kaudal bölgeye işgal etmiş kanser hücreleri bir floresan mikroskop verimli attı edilebilir. Burada da vasküler invaziv yeteneği açık farkları göstermek için yaygın olarak kullanılan insan göğüs kanseri hücre çizgileri panelinde tekniği uygulanır. Ayrıca, kanser hücre popülasyonları farklı olarak florasan boyalarla işaretlenmiş floresan damar yoksun zebra balığı embriyoların içine enjekte edilebilir embriyo yumurta sarısının için enjeksiyon yerinin değiştirilmesi, heterojen bir hücre etkileşimleri çalışma için izin verdiğini göstermektedir. Bu ikinci deneyde, sarısı işgal ve sahip kanser hücreleri vasculatur içine intravasatede enjeksiyonundan sonra 48 saat için kaudal bölgede 24 puanlanır. Nedeniyle bu modelin etkililiği ve kolaylık, zebra balığı giderek hızla fizyolojik bir ortamda altında kanser hücrelerinin damar invaziv kabiliyetini test etmek için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Beyanı: onaylı IACUC protokole göre Zebra balığı embriyolar üretildi. Bu deneyler, Georgetown Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından tavsiyelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Enjeksiyon için Embriyolar Organize ve Stok Çözümleri Oluşturmak

  1. kanser hücresi damar invazyonu değerlendirmek için gerekli Zebra balığı larvaları oluşturun.
    1. Mitfa b692;; ednrb1 b140 balık: (grcfp kdrl) zn1 Tg ile çapraz çiftleşme çifti bilge ya da grup kurmak.
      NOT: Tg oluşturulan (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafish, Tg (kdrl: grcfp) geçerek pigment hücreleri yoksun bir çizgi, mitfa ile endotel hücrelerinde mercan floresan protein yeşil resif ifade zn1 25, b692; Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi'nde geliştirilen ednrb1 b140.
    2. Collect yumurta, temiz ve döllenmemiş veya deforme embriyolar ertesi gün 22 kaldırın.
    3. Zebra balığı embriyolar 2-günler olduğunda oluştuğu, kanser hücreleri enjeksiyon için hazır olana kadar 28.5 ° C embriyolar inkübe sonrası fertilizasyon (2 dpf).
  2. enjeksiyon plakaları olun.
    1. Her plaka için dH 2 O% 1.5 agaroz 25 ml eritin.
    2. 100 mm x 15 mm Petri kabı içine agaroz 12 mi dökün ve sertleştiriniz.
    3. Yeniden eritebilir plaka kalan agaroz dökün sonra.
    4. o agaroz bir 30 derecelik açıyla ve plakanın ortasına konumlandırılmış böylece hemen kesme cam kalıp (genişlik x 7.5 cm uzunluğunda 3 mm x 7.2 cm) yerleştirin.
      NOT: Bu dik bir 60 ° duvarı ve 30 ° eğimli rampa yaratacaktır.
    5. yerinde cam kalıp Bant ve agaroz sertleşmesine izin verin.
    6. Yavaşça cam kalıp çıkarmak ve agaroz gözyaşı için dikkatli olmak.
      Not: Kalıplar, 4 ° C'de dH 2 O saklanabilir.
  3. Balık, su (0,3 g / L, deniz tuzu) enjeksiyon plaka dengelenmesi.
    1. İki kez distile su ile durulayın plaka.
    2. 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde plaka ve yer balık 10 ml su ilave edilerek plaka dengelenmesi.
    3. plaka balığı, su ile bir kez dengelenmesi.
  4. Balık suyu 22 içeren yemeklerin içine aktararak enjeksiyon gruba 2 gün sonrası fertilizasyon (dpf) embriyolar bölün.
  5. enjeksiyondan sonra kullanmak için her grup için kurtarma yemekleri hazırlayın. Kurtarma çanağı 10 mi balık suyu artı penisilin (25 ug / ml) ve streptomisin (50 ug / ml ug) içerdiğinden emin olun.
  6. Balık su artı penisilin ve streptomisin, 50 ml tamponlanmış tricaine stok (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) içinde 4 ml ekleyerek 2x tricaine çözeltisi hazırlayın.
  7. IMAGin canlı embriyolar hareketsiz bir montaj anestezi ortam oluşturmak için 2x tricaine çözeltisi, 10 ml 15 mg düşük erime noktalı agaroz eritilirörn.
    Not: Montaj ortamı% 1.5 agaroz oluşur.
  8. mikroenjeksiyon iğneler çekin.
    1. dikey pipet çektirmesi cam kılcal boru yerleştirin. 20 mAmp akımı ve 2-coil ısıtma elemanı kullanarak uzun konik pipetler çekin.

Lipofilik Floresan Boya ile 2. Etiketleme Kanseri Hücreleri

  1. tavsiye edilen kültür koşullarında kanser hücreleri korumak.
    NOT: Bu hatlar, DMEM +% 10 FBS muhafaza edilmiştir: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve SK-BR-3. Bu hatlar, RPMI +% 10 FBS içinde muhafaza edilmiştir 1806 HCC ve T-47D. Tüm hücre çizgileri, inkübasyon sırasında 37 o C ve% 5 CO2 de muhafaza edilmiştir.
  2. Kanser hücrelerinin bir yapışkan kültürü süzülerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturur.
    1. PBS ile ilk hücreleri yıkanır ve daha sonra% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi edilir.
      NOT: Tripsin maruz kalma süresi hücre hattına bağlıdır.
    2. se ile tripsin çözüm nötralizerom içeren hücreler ayırmak sonra hücre kültürü ortamı.
  3. 200 x g'de 5 dakika boyunca tripsin nötralize hücre süspansiyonu santrifüj, daha sonra hücre sayımı için taze kültür ortamı hücre pelletini.
  4. bir otomatik sayaç hücre süspansiyonu sayımı ve hücre kültür ortamı 200 ul 1.000.000 hücreleri hazırlamak.
    1. Zebra balığı embriyolarının içine enjeksiyon öncesinde tripan mavi boya dışlama hücre canlılığını doğrulayın.
      NOT: Sadece canlı hücre popülasyonları, gerçek vasküler invazyonu yansıtmaz ölü hücrelerin enjeksiyonu gibi, zebra balığı embriyoların içine enjekte edilmelidir.
  5. 100 seyreltme karıştırın ve daha sonra 20 dakika boyunca 37 ° C'de karışım inkübe bir 1: kanser hücre süspansiyonu kırmızı lipofilik boya 2 ul ekle.
    Not: boya ve markalama zaman konsantre her bir hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir.
  6. İnkübasyondan sonra, tüp taze ortam 1 ml ilave edilir ve daha sonra 5 dk süreyle santrifüj200 x g.
  7. kanser hücreleri kalıntı floresan boya silsin.
    1. Aspire hücre peletinin yüzen kısmı, 200 x g'de 5 dakika boyunca, taze kültür ortamı, 1 ml pelet ve santrifüj yeniden süspanse edin.
    2. 200 x g'de 5 dakika boyunca daha sonra santrifüj, süpernatan aspire taze ortam 1 ml hücre pelletini ve: yıkama aşamasından ikinci kez tekrarlayın.
    3. 200 x g'de 5 dakika boyunca daha sonra santrifüj, süpernatan aspire taze ortam 1 ml hücre pelletini ve: yıkama aşaması, üçüncü bir zaman tekrar edin.
  8. Süpernatant aspire ve taze ortam 500 ul 1.000.000 etiketli kanser hücrelerini içeren hücre pelletini.
    Not: 0.5 mM EDTA hücre topaklanma önlemek için ortama ilave edilebilir.

Zebra balığı Embriyolar Öncesi kalp Sinüs içine 3. Enjekte Kanseri Hücreleri

  1. Bir basınçlı hava kaynağına mikroenjeksiyon dağıtım sistemini takın ve inci açmake mikroenjeksiyon dağıtım sistemi güç kaynağı.
    1. ayak pedalına basılarak Test basıncı. Havanın kısa bir darbe iğne tutucu yayarlar gerekir.
  2. 2x tricaine çözeltisi ile iki kez enjeksiyon plakaları dengelenmesi.
    1. Her dengeleme adım için, 10 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde, enjeksiyon plakası ve yere 2x tricaine çözeltisi 20 ml ekleyin.
  3. 2x tricaine çözeltisi içeren küçük bir çanak embriyoların bir grup aktarmak için plastik pipet kullanın.
  4. Bir jel yükleme pipet ucu kullanılarak kanser hücreleri mikroenjeksiyon enjeksiyon iğnesi Dolgu.
    1. Hücreler ucuna yakın yerleşmek böylece aşağı bakacak sivri ucu bir elektrot depolama kavanoz iğne yerleştirin.
  5. Transferi 20 - plastik bir pipet 2x tricaine bol embriyolar toplayarak bir enjeksiyon plakasına 30 anestezi embriyolar.
    1. Embriyolar pipet ucu yerleşmek için izin verin.
    2. centilmenly oluk uzunluğu boyunca embriyolar yayılan, enjeksiyon plaka çukur içine embriyolar sınırdışı.
    3. çukur dik duvara bakan yukarı bakacak başkanları ve karınlarına embriyolar hizalayın.
      NOT: Tricaine çözüm embriyolar sadece yalak ikamet ile, yalak uzunluğu ve düz agaroz yüzeyi hem kapsamalıdır. Embriyolar artık enjeksiyon için hazır.
  6. mikroenjeksiyon dağıtım sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarının precardiac sinüse - (5 nl 2) 100 kanser hücrelerini - 50 enjekte edilir.
    1. Bir Mikromanipülatör iğne tutucu iğne takın.
    2. sola 60 derece duvar Stereoskop altında enjeksiyon plakasını yerleştirin ve 25x büyütme üst embriyo odaklanmak.
    3. uzatılmış zaman, iğne embriyo delmek olacak, böylece mikromanipülatör yerleştirin.
    4. neredeyse embriyo dokunmadan kadar gözle iğne uzatın.
    5. Mikroskop altında bakıldığında, t böylece iğne hizalamakşapka daha da uzatma üzerine embriyo delmek olacaktır.
    6. Pierce, sadece en ucu yerleştirerek yolk kesesi yoluyla embriyo, ama değil, önceden kalp sinüs.
    7. Ayak pedalına hücreleri enjekte edilir. enjeksiyon kuvvet kalp sinüs içine hücreleri kovar. iğne geri çekin.
    8. Sağ elini kullanarak, genişletmek ve enjeksiyon iğnesi geri çekin. sol el ile, bir sonraki embriyo konumlandırmak için ince ayarlamalar yapmak.
    9. başka bir plaka enjekte kurarken elektrot depolama kavanoz iğne dönün.
  7. tüm plaka enjekte edildikten sonra kurtarma çanak embriyolar aktarın.
    1. çukur dışında kalan embriyolar yıkama ve plastik pipet ile onları toplama, altta embriyolar havuz enjeksiyon plaka yatırın.
    2. Embriyolar pipet dibinde yerleşmek için izin verin.
    3. tricaine bir minimal hacimde geri çanak embriyolar aktarın.
  8. doğmuş iyileşmesini1 saat süre ile 28 ° C 'de te geri çanak.
    1. ölü embriyo ve diğer enkaz ayrı canlı zebrafish embriyolar.
  9. 96 saat - tipik olarak 24, puanlama için hazır olana kadar 33 ° C'de çanak inkübe edin.
    NOT: Bu sıcaklık 37 ° C, kanser hücreleri için ideal sıcaklık ve 28.5 ° C, zebrabalıkları için ideal sıcaklık arasında bir uzlaşma olarak belirlenir.

4. Puanlama Ekstravazasyon

  1. Embriyoların toplu tricaine solüsyonu ile bir tabak yerleştirerek atılır için uyutmak.
  2. tricaine bir damla bir depresyon mikroskopi slayt üzerinde bir anestezi larvaları yerleştirin.
    1. kaudal bölgenin uygun görüntüleme için yanal olarak yönlendirilmesi larva.
  3. başarıyla açıkça sağlam hücreleri ayırt etmek kuyruk bölgesinden geçen yukarı ve aşağı odaklanarak damarsal dışında işgal kanser hücrelerinin sayısını sayın.
    NOT: t katılan en az iki kişi olması en iyisidirbalık puanlama bireysel deneysel durumuna kör onun süreç, değerlendirilen.
    1. 10x objektif lens ile bir bileşik floresan mikroskop larvaları puanı. herhangi bir zor aramalar için 20x objektif kullanın.

Slaytlar ve sonraki Floresan Görüntüleme üzerine 5. Montaj Embriyolar

  1. % 1.5 agaroz / tricaine çözeltisi eritin ve 37 ° C'ye getir.
  2. embriyo anestezisi tricaine çözelti içinde yerleştirilerek yansıması.
  3. görüntüleme yüzeyine tricaine çözümün bir damla embriyo transferi. İsteğe bağlı olarak cam alt çanak veya mikroskop lamı kullanın.
  4. görüntü yüzeyinde embriyo koruyarak, aşırı tricaine çözüm kaldırmak için bir cam pipet kullanın.
  5. embriyo üzerinde erimiş agaroz çözüm bir damla Yerleşimi.
  6. Çabuk, agaroz polimerize önce, bir kirpik fırçası gibi hassas bir aracı kullanmak ekstra bakım veren görüntüleme için yanal embriyo yönlendirmek içinembriyo sağlamak için görüntü oluşturma yüzeyi üzerinde düzleştirilir.
  7. tricaine çözümü altında şimdi polimerize agaroz damla Batmak.
  8. mikroskopik görüntüleme için canlı zebrafish embriyo Konu.

6. Modifikasyon: Zebra balığı Embriyolar sarısı kesesinin içine enjekte Kanser Hücreleri

  1. Daha önce bu protokol bölüm (3) 'de tarif edildiği gibi mikroenjeksiyon dağıtma sistemi ve enjeksiyon tabak hazırlayın.
  2. Daha önce bu protokol bölüm (2) 'de tarif edildiği gibi floresan boyalar zıt olan iki hücre popülasyonu etiketleyin.
  3. sarısı kesesinin içine 2 x 10 7 hücre / ml 10 nl - 5 enjekte edilir. Her hücre popülasyonundaki - (200 kanser hücreleri 100) özdeş hücre sayıları enjekte enjeksiyon hacmi sabit tutmak
    NOT: Bir bu deney için floresan damarsal eksik şeffaf zebrafish embriyolar kullanabilir. damar içine partiküllerin pasif giriş veya flüoresan boncuklar (<10 um) enjekte edilmesiyle kontrol edilebilir değiştirebilirAlternatif olarak, intravsate olmayan bir hücre çizgisi.
  4. Daha önce (3) Bu protokolün ardından başarılı enjeksiyonları için ekran bölümünde açıklandığı gibi enjekte embriyolar kurtarın.
    1. Ekrana ve başarılı yeni bir çanak enjekte edildi embriyo transfer etmek Stereoskop kullanın.
      NOT: Tüm embriyolar sarısında bulunan hücrelerin sürekli boyutta kütleye sahip olmalıdır. Herhangi hücreler sarısı dışında bulunuyorsa Embriyolar kitle boyutu farklıysa atılır ya da vardır.
    2. Kanser hücreleri açıkça yumurta sarısının görülür ise yeni bir çanak embriyo transfer.
  5. 48 saat - tipik olarak 24, puanlama için hazır olana kadar 33 ° C'de çanak inkübe edin.
    NOT: Bu sıcaklık 37 ° C, kanser hücreleri için ideal sıcaklık ve 28.5 ° C, zebrabalıkları için ideal sıcaklık arasında bir uzlaşma olarak belirlenir.
  6. intravasation puan için (4) Bu protokolün, ancak bunun yerine c sayısını bölümünde açıklanan yönergeleri izleyinbaşarıyla kaudal bölgede damar içine işgal ancer hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada bir zebrabalıkları embriyo modelinde yaygın olarak kullanılan meme kanseri hücre hatları (Şekil 1), vasküler invaziv yeteneği test edildi. Titiz kriterler, kanser hücreleri açıkça ekstravaze olsaydı pozitif olaylar sadece sayıldı bu farklı hücre hatları için puanlama ekstravazasyonunda hücresel enkaz puanlama ortaya çıkabilecek herhangi bir yanlış-pozitif sınırlamak için esas yapılması bu varlık istihdam edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu teknik, etkili bir şekilde, kanser hücreleri (Şekil 1 e bakınız) vasküler invaziv yeteneğini test etmek zebra balığı modeli kullanmaktadır. (; - 3 Şekil 2 Tablo 1) Burada diğer araştırmacılar daha sonra kendi çalışmalarını inşa edebilirsiniz hangi üzerine bir temel sağlamak amacıyla meme kanseri hücre hatları bir panel tekniği uygulandı. MDA-MB-231 hücreleri kolayca zebra balığı embriyolarının kaudal bölgeye işgal gözlem vasküler invazyonu inhibe olabilir ajanların t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Zebra balığı embriyolarının görüntülenmesindeki yardımları için Georgetown Üniversitesi Mikroskopi Çekirdeği'nden Peter Johnson'a teşekkür ederiz. Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynağı ve Zebra Balığı Paylaşılan Kaynağı, NIH / NCI hibesi P30-CA051008 tarafından kısmen desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda NIH/NCI CA71508 (AW) ve CA177466 (AW) tarafından da desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin-EDTAYaşam Teknolojileri25300-054
100 mm TabaklarCorning Incorporated3160-100
5 3/4" Tek Kullanımlık Pastur Pipetleri, borosilikat CamFisher Marka13-678-20B
60 mm ÇanakCorning Incorporated3160-60
Agaroz, Düşük Erime NoktalıFisherBP165-25
Agaroz, Moleküler SınıfBiolineBIO-41026
Kılcal Cam, Standart, 1,2 mm x 0,68 mm, 4"A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C Dikey Pipet ÇektirmesiHofstra Group3600
DMEMYaşam Teknolojileri11995-065
Elektrot Saklama Kavanozu, 1.0 mmWorld Precision Instruments, IncE210
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain, MS-222)FlukaA5040
Kirpik FırçasıTed Pella, Inc113
Fetal Sığır Serumu, Isı ile İnaktive EdilmişOmega ScientificFB-12
Fisherbrand Transfer PipetleriThermoFisher Scientific13-711-7M
Jel Yüklemeli Pipet UçlarıFisher Brand02-707-181
Cam Tabanlı Tabaklar (12,0 mm)ThermoFisher Scientific150680
Cam Çöküntü KaydırağıVWR470005-634
Anında Okyanus Tuzu, Deniz TuzuPentairIS50
Lateks Kauçuk Ampuller, 2 ml, 72'li PaketHeathrow ScientificHS20622B
SP8 Konfokal MikroskopLeica
MikromanipülatörNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
Penisilin-G Potasyum FisherBiotechBP914-100
Petri Plakaları, 100 mm x 15 mmFisher Brand 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Orta Yaşam Teknolojileri11875-093
Streptomisin SülfatFisher BiotechBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiOThermoFisher ScientificV22886
Zebra balığı Georgetown Zebra Balığı Paylaşılan Kaynaklar
Hücre hatları, RPMI + %10 FBS'de tutulan BT-474 ve HCC18-6 hücrelerinin beklentisiyle DMEM + %10 FBS'de tutuldu.
FB0875713

Kaynaklar

  1. Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
  2. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  3. Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
  4. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  5. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
  6. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  8. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
  11. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260(2012).
  13. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  14. Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
  15. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  16. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677(2014).
  17. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
  18. Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
  19. Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
  20. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
  21. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
  22. Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
  23. Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
  24. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
  25. Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
  26. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
  27. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
  28. Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  29. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  30. Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
  31. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  32. Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebra Bal EmbriyosuKanser H cresi nvazyonuVask ler EkstravazasyonFloresan G r nt lemeMikroenjeksiyon Tekni iTrikain AnestezisiFloresan MikroskobuKanser H cre HatlarMetastatik KaskadEmbriyo Skorlamas

İlgili makaleler