Yöntem makalesi

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

DOI:

10.3791/55011

⸱

4 Şubat 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, kararlı izotop izleme, belirli hücre tiplerini izole etmek için hücre sıralama ve kütle spektrometresinin bir kombinasyonunu kullanarak, birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık topluluklarda hücresel metabolizmayı incelemek için bir yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücre tipleri özelleşmiş metabolizma sergiler ve bir arada var olan çeşitli hücre tiplerinin metabolik işbirliği içinde olduğuna dair bol miktarda kanıt vardır. Ayrıca, tek bir hücre tipinin kültürleri bile, dinlenme veya döngü hücreleri gibi farklı metabolik durumlardaki hücreleri içerebilir. Bu tür alt popülasyonların metabolik aktivitelerini ölçme yöntemleri, hücresel metabolizmayı anlamak için değerli araçlardır. Karmaşık hücre popülasyonları en yaygın olarak bir hücre sıralayıcı kullanılarak ayrılır ve bu yöntemle izole edilen alt popülasyonlar metabolomik yöntemlerle analiz edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili bir sorun, hücre sıralama prosedürünün hücreleri metabolizmalarını bozabilecek streslere maruz bırakmasıdır.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, kararlı izotop etiketli besinlerle kültürlenen hücrelerden alınan metabolitlerin kütle izotopomer dağılımlarının (MID'ler) mutlak metabolit konsantrasyonlarından daha kararlı olma olasılığının yüksek olduğunu düşündük, çünkü MID'ler daha uzun zaman ölçeklerinde oluşur ve hücre sıralama koşullarına kısa süreli maruz kalmaktan daha az etkilenmeleri gerekir. Burada, hücre sınıflandırmayı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (LC-HRMS) ile birleştiren bu prensibe dayalı bir yöntemi açıklıyoruz. Prosedür, üç tip numunenin analiz edilmesini içerir: (1) doğrudan karmaşık popülasyondan elde edilen metabolit ekstraktları; (2) herhangi bir spesifik popülasyonu geçitlemeden hücre sıralayıcı cihazından geçirilen "sahte sıralanmış" hücrelerin özleri; ve (3) gerçek sıralanmış popülasyonların özleri. Sahte sıralanmış hücreler, gerçek sıralanmış popülasyonları analiz etmeden önce, MID'lerin gerçekten hücre sıralama prosedürünün kendisi tarafından değiştirilmediğini doğrulamak için doğrudan ekstraksiyonla karşılaştırılır. Nükleotid metabolizmasındaki değişiklikleri ortaya çıkaran, hücre döngüsü fazına göre sıralanmış HeLa hücrelerinden elde edilen örnek sonuçları gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek organizmalar daha karmaşık işlevleri hakkında getirmek için işbirliği farklı hücre tiplerinin karmaşık topluluklar içerir. Örneğin, tümörler de sadece kanserli hücreleri, ancak fibroblastlar, kan damarlarını oluşturan ve genellikle bağışıklık hücresi 1 infiltratlarının hücreleri içerir; Kan bağışıklık hücresi alt tiplerinin 2 onlarca karmaşık bir karışımını içerir; ve hatta kültürlenmiş hücre çizgileri, luminal ve göğüs kanseri hücrelerinin 3 taban alt tipleri gibi birden fazla alt popülasyonlarının, oluşabilirler. Metabolik "işbirliği" sergileyebilir arada Dahası, farklı hücre tipleri. Ör....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metabolit Ekstraksiyon

  1. Çanak Ekstraksiyon
    1. izotop etiketli kültür ortamı + diyaliz takviyeleri (serum veya diğer büyüme takviyeleri) içinde üç kopya halinde bir 6-yuvalı plaka içindeki kültür hücreleri hücreler% 75 konfluent hale gelene kadar.
      Not: U- 13 C-Glukoz% 40 ihtiva eden RPMI içinde 48 saat ve% 70 U 13 C, 15, N2-glutamin ve% 5 diyaliz edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu) için Buraya Kültür HeLa hücreleri. Diyaliz FBS etiketlenmiş ortamı kontamine olabilir küçük molekül ağırlıklı metabolitleri kurtulmak için kullanılır. gerçek deneyden önce diyaliz ek hücrelerin kültürlenmesi Hücreler ort....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir örnek olarak, burada, hücre döngüsü faz göre düzenlenmiş HeLa hücrelerinin metabolizmasını araştıran bir deney tarif eder. Her iki karbon ve nitrojen merkez metabolitlerin geniş bir etiket için, U-13C-glükoz ve U, 13C, izleyiciler olarak 15 N-glutamin ile 48 saat boyunca hücrelerin kültürü yapıldı. Izotopların ara seviyeleri daha değişik MI desen 14 üretmek eğilimindedir doğrulama deney için zengin MID elde etmek için, biz bura.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim yöntemi hücresel metabolitleri MID bir hücrenin metabolik faaliyetleri "tarihini" yansıtması ilkesine dayanmaktadır. Bu, daha önceki bir hücre ayırma prosedürü, hücrelerin karmaşık eden oluştu şekilde mümkün hücrelerin alt popülasyonunda metabolik faaliyetlerini araştırmak için yapar. Buna karşılık, metabolitleri pik alanları sıralanmış hücreler ve kültür çanak 11 doğrudan çıkarma özleri arasında belirgin farklılıklar göstermektedir. Bölümünde farklı kimyasal bileşimi, kütle spekt.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, kütle spektrometresi yöntemlerini optimize etmedeki değerli yardımları için Dr. Anas Kamleh'e ve hücre sıralama konusundaki yardımları için Annika von Vollenhoven'e teşekkür eder. Bu araştırma İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. FFL12-0220) ve Kanser Araştırmaları Stratejik Programı (IR, RN); İsveç Kalp-Akciğer Vakfı (CEW, HG); ve Mary Kay Vakfı (JW, MJ).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HBSSSigmaH6648
AKIŞ (inFlux v7 Sıralayıcı)BD Biosciences
U-13< / sup>C-GlikozCambridge izotopları40762-22-9 / GLC-018
U-13< / sup>C,15< / sup>N2-GlutaminCambridge izotoplarıCNLM-1275-H-0.1
Metanol (JT Baker), HPLC sınıfıVWRBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV santrifüj filtreler. Durapore PVDF 0.1 & mikro; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3.000 UHPLCThermo Fisher scientific
Q-Exactive Orbitrap Kütle spektrometresiThermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC sütunu (150 mm x 4.6  mm, 5 ve mikro; m)Merck KGaA1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC koruma kolonu (20 mm x 2,1 mm)Merck KGaA
Asetonitril Optima LC-MS, amber camFisher ScientificA955-212
Milli-Q suMilliporeMili-Q Gradyan sistemi ile üretilmiştir
Myrsyra %99,5 Optima (Formik asit)Fisher Scientific11423423
X100 Vidalı Flakon 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 adetThermo Fisher scientific10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Ambalaj 8-425 (Vidalı kapaklar)Thermo Fisher scientific12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix Sigma-AldrichMSCAL5Kalibrasyon kiti
SNAKESKIN 10K MWCO Thermo Fisher bilimsel88245
Mathematica v.10 Wolfram Araştırma

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stable Isotope TracingCell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

İlgili makaleler