Method Article

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

DOI:

10.3791/55034

⸱

December 31st, 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1 ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları 4 kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

GABA A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda 5,6 optimize edilmiş ve rutin 7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT'de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA A reseptörleri 10-12, insan rekombinant klorür kanalları 13, tripanosom potasyum kanallarının 14 ve miyo -inositol taşıyıcı 15, 16 olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir.

Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür.

başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oositin bir ortamda kolayca kontrol eksprese eden hücrelerin yüksek oranda ve membran potansiyelinin kontrolü, .

Bu ifade sisteminin dezavantajı birçok laboratuvarda 17-20 gözlenen mevsimsel çeşididir. Bu varyasyon nedeninet olmaktan çok uzaktır. Buna ek olarak, oosit kalitesi genellikle güçlü bir değişiklik gözlenmiştir. Geleneksel yöntemler 7-9 yumurtalık loblar izolasyonunu, bazı saat kollajenaz için yumurtalık lobların pozlama, soyulmuş oosit seçimi ve oosit mikroenjeksiyon dahil ettik. Burada, alternatif, hızlı prosedürlerin bir dizi bize oosit kalitesinde mevsimsel değişimi ve küçük farklılıklar ile 30 yılı aşkın için bu ifade sistemi ile çalışmak için izin olduğunu bildirildi.

Oosit izolasyonu, mikro enjeksiyon cRNA ile ve foliküler hücre tabakası çıkarılması için anlatılan tadil edilmiş ve geliştirilmiş yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için kullanılabilir. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı ve taşıyıcıların çalışmaya uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri Bern Kantonu Kantonstierarzt yerel komite, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) tarafından onaylanmıştır.

Kara kurbağası cinsi oositlerinde hazırlanması 1.

  1. Katı, 20 ° C 'de muhafaza edilir, su içinde 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde kurbağa (Xenopus laevis) tutun.
  2. Dişi kurbağa 9'dan yumurtalıkların lobları çıkarın.
    NOT: lobların kaldırma rejenerasyonu için bir uyarıcı olduğunu ve sık sık oosit kalitesi cerrahisi ile geliştirir. Oosit, bir Vitellin tabakası, folikül hücrelerinin hücre tabakası, ve kan damarları 21 ihtiva eden bağ dokusu ile kaplıdır. tüm yapı "folikülü." denir
  3. Yoğun penisilin ve streptomisin (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2.4 mM ile desteklenmiş steril Barth'ın Tuzlu 7 (MBS) içinde oosit içeren folikül ile paketlenir yumurtalıkların lobları yerleştirinNaHCO 3, 0.82 mM MgSO 4, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit; HEPES (pH 7.5, NaOH), 100 ug / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin).
  4. Tek çıkış aşaması V-VI 21 folikülleri. forseps ile yumurtalık lob tutun. Köklerinin üzerinde platin döngü (Şekil 1) indirin ve yavaşça yumurtalık dokusundan folikülü içeren bağ dokusu bozmaya döngü çekin.
    NOT: Sahne V-VI 21 folikül kendi büyüklüğü ile karakterize edilir (1.0 - çapı 1,2 mm) ve koyu pigmente hayvan yarımkürede ve sarımsı bitkisel yarımkürede arasında iyi aksine.
  5. Bir plastik Pasteur pipeti (1.5 mm'lik bir açıklık çapına geri kesilmiş) vasıtasıyla 35 mm çaplı Petri kabı sadece sağlıklı görünümlü folikülleri (yani mükemmel küresel ve bozulmamış pigmentasyon ile) aktarın.

2. Sitoplazmaya mRNA'nın Mikroenjeksiyon

Not: Burada açıklanan mikroenjeksiyon sistemi Kressmann ve Birnstiel 22 tarafından bildirilen türetilmiştir.

  1. In vitro transkripsiyon bir alıcı, bir poli (A +) kuyruğu ve RNA miktarının eklenmesi jel elektroforezi 23 tarafından α 4 β 2 δ GABA alt birimleri kodlayan ilgili cDNA'lardan cRNAs hazırlayın.
  2. Mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam kılcal damarlar (1.0 mm dış çapı (OD), 0.58 mm iç çapı (ID), 100 mm uzunluk) den mikroenjeksiyon pipetler hazırlayın. bir eğimli ucu ile 15 mikron - 12 bir ucu çapı oluşturmak için bir mikromanipülatör ve microfilament kullanarak bir mikroskop altında cam kılcal damarların ipuçları kesiyorum.
  3. 10 ml şırınga kullanılarak parafin yağı ile mikroenjeksiyon pipetler dolgu, ve daha sonra bir homebuilt MICR üzerine mikroenjeksiyon pipet monteoinjection cihaz (Şekil 2).
    NOT: homebuilt yağ hidrolik enjeksiyon cihazı, bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir ızgara motorundan oluşmaktadır. Ek bir anahtar motorun dönme modunu değiştirir. Bu motor, avans ya da 10 uL cam şırınga pistonu geri çekilir bir mikrometre vidası (0,5 mm / dönüş) çalıştırır. Enjeksiyon 3 rpm'lik bir hızda ve bir 0.5 dönüş folikül bir 50 nL enjeksiyon karşılık gelir. şırınga ucu kendisine Tygon hortumunun çok kısa bir parça enjeksiyon iğnesine bağlanır kalın duvarlı politetrafluoroetilen boru bağlanmıştır. Enjeksiyon kılcal bir micromanipulator tarafından denetlenen bir mandrenle tarafından düzenlenmektedir. Tüm sistem parafin yağı ile doldurulur. Onlar enjeksiyon sistemine zarar verecek herhangi bir hava kabarcıkları, kaçınılmalıdır. Kur soğuk ışık kaynağı ile aydınlatılmış. Bir stereomikroskop optik kontrol için gereklidir. Foliküllerinin bir stereomicr soğuk ışık altında görüntülenmiştirOscope (40X büyütme). Enjeksiyon kurulum Performans Xenopus oosit içine radyoaktif izleyici enjeksiyonu ile test edilir. 45 A hacim - 55 nL enjeksiyon başına teslim edilmelidir.
  4. steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak, neme karşı dirençli bir termoplastik (2 x 2 cm), temiz iç kısmına steril bir su damlasının yerleştirilmesi kurulumu test. Bu damlacık içine enjeksiyon pipet ucu batırın ve sonra pistonu (enjeksiyon pipet içinde negatif basınç) geri çekmek için motoru çevirin.
    NOT: Su pipet girmek ve yağ ile görünür bir arayüz oluşturmalıdır.
  5. damlacık gelen pipet ucu geri çekin ve enjeksiyon pipet içine pozitif basınç uygulayın. Bir su damlacığı enjeksiyon pipetine ucunda oluşturmalıdır.
  6. Bir Pe altına yapıştırılmış: bitkisel kutuplar naylon örgü boşlukları (0.8 mm G) yukarı bakacak şekilde onları sıraya folikül enjeksiyon için hazırlayınMBS ile kaplı üç çanak (60 mm).
  7. Bir termoplastik temiz iç kısmına steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak mRNA 2 ul koyun. enjeksiyon pipetine içine negatif basınç uygulayarak, enjeksiyon pipetine mRNA al.
  8. Mikromanipülatör kullanarak bireysel folikül üzerinde enjeksiyon pipet yerleştirin.
  9. Bitkisel kutup merkezine iğne takın ve pipet içine pozitif basınç uygulayarak 0.6 mL / dk'lık bir akış oranında mRNA 50 nL enjekte edilir. mRNA kaçış önlemek için folikül enjeksiyon pipet çıkarmadan önce 10 sn - 5 bekleyin.
    NOT: mRNA hayvan yarımkürede yer alan çekirdeğin içine enjeksiyon önlemek için bitkisel (sarımsı) kutupta enjekte edilmelidir.
  10. MBS 2 mL dolu yeni bir petri (35 mm) enjekte folikülleri aktarın. 18 ° C'ye ayarlanmış bir şarap soğutucuya çanak yerleştirin. 1 enjekte folikülleri inkübe -7 gün Kayıttan önce, yeni Sentezlenen proteinin ne olduğu ile ilgili olarak.

3. Foliküllerinden soyma (Şekil 3)

NOT: olarak bilinen, yukarıda belirtilen kan damarları 24 içeren bir vitelline tabakası, folikül hücreleri ve bağ dokusu ile kaplıdır oosit olarak "folikül." hücre yüzeyine çözümleri erişim engellemeden, mekanik stabilite temin vitelline tabakası hariç tüm tabakalar elektrofizyolojik deneyler önce çıkarılmalıdır. Çevredeki hücre katmanları olmadan folikül önce bir "soyulmuş" oosit 25 olarak adlandırılmıştır. Bu adım genellikle elektrofizyolojik deneyler ile aynı gün yapılır.

  1. Aktarım on MBS 0.5 mL, 1 mg / ml kollajenaz, ve 0.1 mg / ml tripsin inhibitörü içeren bir borosilikat cam tüp köklerinin enjekte edilmiştir. 36 ° C 'de muhafaza edilen bir su banyosu içinde tüp bırakın. tasarlamak20 dakika folikülleri ve bazen tüpler sallayın.
  2. RT'de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın.
  3. 4 mM etilen glikol-bis (2-aminoetileter) ihtiva eden iki kat konsantre edilmiş MBS 0.5 mL ihtiva eden bir üçüncü tüpe köklerinin transfer - N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) ve 4 dk için inkübe RT. bazen tüp sallayın.
    Not: hipertonik çözeltisi (iki kat konsantre edildi MBS) ve böylece oositten foliküler hücre katmanları ayırma folikül hücresi tabakaları içinde oosit, bir çekme indüklemek için kullanılır; EGTA kolajenaz aktivitesini inhibe eklenir.
  4. RT'de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın.
  5. MBS 2 mL içeren bir Petri kabı (35 mm çap) oosit aktarın. Bir stereomikroskop altında, tarafından köklerinin gelen dış zarfları ayrısadece platin döngü kullanarak Çıplak oosit iterek.
    NOT: oosit dış zarf kültür kabı sıkıca kalan ve kolayca oosit ayrılabilir. Bazı oosit kendiliğinden dış zarfları kaybedecek ve soyulmuş oosit olarak telafi edilecektir. Bu prosedür oosit küresel görünümünü korur nispeten istikrarlı bir hazırlık olur.

Oosit etrafında 4. Hızlı Çözüm Değişikliği

  1. 9,26 tarif edildiği gibi, bir voltaj kelepçesi deneyi gerçekleştirmek.
  2. deney gereği perfüzyon anahtarları çevirerek yerçekimi beslenen perfüzyon sisteminin çözümünü değiştirin.
    1. oositin etrafında agonist konsantrasyonunu hızlı değişiklikler izin vermek için, oosit yüzeyinden yaklaşık 0.4 mm yerleştirilir ağzı olan 1.35 mm'lik bir iç çapa sahip bir cam kılcal yoluyla 6 mL / dakika perfüzyon çözeltisi uygulanır.
      NOT: değişim hızı önceden tahmini olmuşturaz 0,5 s 27 70% olarak, d.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus oositleri mekanik bir platin döngü (Şekil 1) kullanılarak ayrılmıştı. 0.5: oosit mRNA 2, δ, 0.5 p, A reseptör alt birimleri 4 a GABA kodlayan microinjected, 2.5 fmol / oosit (Şekil 2). 4 Gün sonra, foliküler hücre tabakaları (Şekil 3) uzaklaştırılmıştır. Oositler voltaj -80 mV'de kenetlendi ve 1 uM 3a, 21-dihidroksi-5α-pregnan-20-on (THDOC), güçlü bir pozitif allosterik modülatör mevcudiy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel 7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi 8 yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit köklerinin daha mikroenjeksiyon sı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibesi 315230_156929/1 tarafından desteklenmiştir. M.C.M. bir burs sahibidir (CONICYT, Ministerio de Educacion, Şili'den Beca Chile Postdoctorado).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma71380
KClSigmaP-9541
NaHCO3SigmaS6014
MgSO4 SigmaM-1880
CaCl2 Sigma223560
Ca(NO3)2 SigmaC1396
HEPESSigmaH3375
Penisilin / streptomisinGibco15140-148100 & mu; g penisilin / mL ve 100 μ g streptomisin / mL
Platin tel döngüev yapımı
Mikropipet çektirmeZeitz-Instruments GmBHDMZ
Hamilton şırınga ve nbsp;Hamilton8030010 μ L, Tip 701N
Kalın duvarlı politetrafloroetilen boruLabmarket GmBH1.0 mm OD 
Parafin yağıSigma18512
Naylon ağ, G: 0,8 mm ZBF Zü daha zengin Beuteltuchfabrik AG
Borosilikat cam tüp Corning99445-12PYREX
Kollajenaz NB Standart SınıfSERVA17454
Tripsin inhibitörü tip I-SSigmaT-9003
EGTASigmaE3389
Cam kılcalJencons (Bilimsel) LTD.H15/101.35 ID mm (perfüzyon için), alternatif şirket: Harvard Apparatus Limited
Borosilikat cam kılcalHarvard Apparatus Limited30-00191.0 OD x  0.58 ID x 100 Uzunluk mm (mikroenjeksiyon için) 
Borosilikat cam kılcal damar ve nbsp;Harvard Apparatus Limited30-00441.2 OD x 0.69 ID x 100 Uzunluk mm (iki elektrotlu voltaj kelepçesi için)
& gama; -Aminobütirik asit (GABA)SigmaA2129
3 & alfa ;, 21-Dihidroksi-5 & alfa; -pregnan-20-on (THDOC)SigmaP2016
ızgara motoruFaulhaber DC mikromotor Tip 2230, dişli Tip 22/2
mikrometre vidalıKiener-Wittlin10400TESA, AR 02.11201
Steril plastik transfer pipetleriSaint-Amand  Mfg.222-20'LI YILLAR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
  2. Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
  3. Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
  4. Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
  5. Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
  6. Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
  7. Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
  9. Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
  10. Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
  11. Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943(2016).
  12. Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
  13. Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
  14. Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
  15. Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
  16. Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
  17. Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
  18. Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
  19. Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
  20. Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
  21. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
  22. Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
  23. Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
  24. Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
  25. Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
  26. Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
  27. Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus OocytesMicroinjection TechniqueFollicular Cell RemovalElectrophysiological ExperimentsGABA A ReceptorscRNA InjectionCollagenase TreatmentSolution Change MethodOocyte IsolationVoltage Clamp Recording

Related Articles