Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

11.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55063

⸱

15 Ocak 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.

Özet

Doğal öldürücü (NK) hücreye belirli genlerin iletim verimli büyük bir mücadele vardı. Başarılı transductions geliştirme, farklılaşma ve NK hücreleri fonksiyon ilgi gen rolü tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Kanserli hastalarda chimeric antijen reseptör (CARs) ile ilgili son gelişmeler eksojen genler efektör lenfositler için teslim etmek etkili bir yöntem ihtiyacını vurgular. Lentiviral-aracılı gen transductions birincil insan veya fare NK hücreleri içine verimliliği önemli kısıtlayıcı bir faktör olduğu önemli ölçüde düşük kalır. Son gelişmeler polybrene gibi Katyonik polimerler kullanılarak geliştirilmiş gen iletim verimliliği T hücreleri gösterir. Ancak, bu ürünlerin NK hücreleri iletim verimliliği artırmak başarısız oldu. Bu iş o dextran dallı glukan polisakkarit gösterir önemli ölçüde iletim insan ve fare birincil NK hücreleri artırır. Bu son derece tekrarlanabilir iletim yöntemi klinik gen teslim uygulamalar ve böylece NK hücre tabanlı kanserli hastalarda. büyük ölçüde artırabilirsiniz insan birincil NK hücreleri transducing için yetkili bir araç sağlar

Giriş

Doğal öldürücü (NK) doğuştan gelen bağışıklık sistemi1büyük lenfositik nüfusu hücrelerdir. NK hücreleri karşı tümörler ve enfeksiyonlar2,3,4ana bilgisayar bağışıklık yanıtının ilk satır savunucuları olarak işlev. NK hücreleri de güçlü sitokinler ve kemokinler5salgılanmasını aracılığıyla tolerans gelişimi merkezi bir rol oynamaktadır. Hedef ve tümör hücreleri ortadan kaldırmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle, donör elde edilen insan NK hücreleri kanser6,7için bir adoptive immünoterapi olarak değerlendirmek için birden fazla klinik çalışmalar yürütülmektedir. Aksine T hücreler, NK hücreleri gelişim biyolojisi henüz iyi karakterize8olmak zorundadır. Bu bilgi kısmen genler ilgi fare veya insan birincil NK hücreleri göndermek verimli teknikleri yokluğu nedeniyle eksikliğidir. Bu nedenlerden dolayı hücre hatları yerine Primer hücre en NK hücre çalışmaları yapılmıştır. Bu nedenle, birincil NK hücreleri genler ilgi ile transduce güvenilir ve etkin bir iletişim kuralı için ihtiyaç çok önemlidir.

Bu çalışmada genel amacı lenti - veya Retrovirüsler birincil insan veya fare NK hücreleri transduced tutarlı ve güvenilir bir yöntem formüle etmek oldu.

Büyük ölçüde birincil NK hücreleri geçici dönüşümü kullanarak bu sorunu çözmeye çalıştığınız önceki çalışmalar yapılmıştır. Bu plazmid transfection9,10, Epstein - Barr virüsü (EBV) içerir / retroviral hibrid vektör11, vaksinia vektörler12,13ve14Ad5/F35 chimeric adenoviral vektörel çizimler. Bu teknikler mütevazı verimliliğini rağmen iletim geçici doğasını onlara genetiği değiştirilmiş NK hücreleri uzun süreli kullanımı için uygun olmayan hale getirir. Bir kaç son yıllarda yapılan çalışmalarda retroviral vektörler NK hücreleri, enfeksiyon gen ifade11,15kabul edilebilir bir düzeyde sağlamak için birden fazla döngüleri gerektiren transduce için kullandık. Retroviral vektörler aksine, lentiviral vektörler konak hücre nükleer alma makine viral öncesi entegrasyonu karmaşık çekirdek translocate için kullanabilirsiniz. Bu virüs birincil NK hücreleri dahil olmayan bölme hücrelerdeki çoğaltma büyük bir sınırlayıcı faktördür.

Farklı hücre yüzey reseptörleri ve viral parçacıkların arasındaki etkileşimler viral alımını hücre içine izin verir. Viral zarf proteinleri ve onların soydaş ana bilgisayar reseptörleri arasındaki ilk nişan bu iki arasında mevcut potansiyel negatif ücretleri nedeniyle sınırlı olabilir. Polybrene (Pb), protamine sülfat (PS) veya dextran, gibi Katyonik polimerler ek hücre yüzey reseptörleri için olumlu bir ücret vermek ve böylece viral zarf bağlama çoğaltmak birçok iletim teknikleri arkasındaki mantığı olduğunu proteinler. Bu hücreler16tarafından füzyon verimlilik ve viral parçacıkların alımını artırır. Her ne kadar Türkçe veya PS gen transferi T hücreleri17artırabilir rapor edildi, bunların uygulama birincil NK hücreleri iletim verimliliği herhangi bir etkisi yoktu. Ayrıca, birincil NK hücreleri kullanarak bu Ayıraçlar arasında karşılaştırmalı bir analiz gerçekleştirilmedi. Bu çalışmada, üç Katyonik polimerler iletim verimliliği karşılaştırıldı. Bu üç Katyonik polimerler arasında sadece dextran önemli fare ve insan birincil NK hücreleri içine etkili viral iletim artırır, sonuçlar gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan iletişim kuralları insani ve ahlaki muamele-in hayvan takip ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tıbbi College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI Biyomedikal Araştırma Merkezi (BRC) içinde tarafından kabul edildi. İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) kullanımı kurumsal inceleme Kurulu (IRB) kan Merkezi Wisconsin, Milwaukee, WI kan Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi.

1. fare, hücre satırları ve vektörel çizimler

  1. C57BL/6 fareler ticari satıcıları tarafından elde etmek. Patojen-Alerjik koşulları fare kolonilerde korumak ve 6 ve 12 hafta yaş arası kadın ve erkek fare kullanın. De-tanımlanan insan PBMCs IRB tarafından onaylanan kaynaklardan elde edilir.
  2. % 20-30 v/v isoflurane propilen glikol fareler anestezi için (1, 2-propanediol, USP sınıf) karışımı hayvanlarla anestezi. Fareler anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözlerinin veteriner merhem uygulamak.
  3. Hayvanlara ötenazi için anestezi indüksiyon sonra servikal çıkığı gerçekleştirin.
    1. Fareler Bankası kuyruk tek elle sıkıca kavra tarafından dizginlemek. Sağlam sopa-tipi kalem veya başparmak ve ilk parmak boyunda, arkası karşı diğer el kafatası tabanında yer.
    2. Çıkık üretmek için el baş hayvan iletmek ve kuyruk temel tutan el ile geriye dönük kablolarıylaberaber bastır frenleyici itin. Servikal doku ayrılması için duygu tarafından çıkığı etkinliğini doğrulamak.
  4. Odası/kafes en az 5 min için hayvanları koruyup onları sadece solunum aktivite yoktur veya algılanabilir bir kalp atışı eksikliği olduğunda kaldırmak.
  5. K562 ve yas-1 hücreleri ticari satıcıları tarafından elde etmek ve RPMI1640 içinde proje % 10 içeren orta ısı FBS inaktive. Düzenli olarak Mikoplazma bulaşma olasılığını dışlamak için bu hücre hatları test.

2. hazırlık ve titrasyon lentiviral vektörlerin

  1. Kültür 5 × 106 293T hücreleri bir çözüm olarak RPMI1640 orta %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, ile 20 mL % %5 7.5 sodyum bikarbonat çözüm ve % 0.001 içeren bir T75 cm2 şişeye gecede Β-mercaptoethanol. %5.2 CO2ile infüzyon 37 ° C kuluçka şişeye koyun.
  2. Tripsin (0.025%)/EDTA (1 mM) fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS). kullanarak 293T hücre hasat Tripsin/EDTA 5 mL PBS içinde ekleyin ve Şişeler 10 dk 37 ° C'de T75 cm2 şişe 293T hücrelerden dekolmanı izin vermek için bir kuluçka için kuluçkaya.
    1. Müstakil hücreleri toplamak ve iki kez tripsin tüm izlerini kaldırmak için PBS ve EDTA içinde yıkayın. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak ve mL başına bir milyon hücre hücre sayıya ayarlayabilirsiniz.
  3. PsPAX2 3.95 µg, pMD2G 1.32 µg ve pLEP-GFP-Puro (in-house BRI oluşturulan EF1alpha organizatörü pWPI pLenti CMV-GFP-Puro bir CMV organizatörü yerine gelen klonlama tarafından) 5,26 µg 293T hücreleri18 transfect19.
    1. 1 mL 150 mm NaCl artı 0.6 mg/mL polyethylenimine 63 µL hazırlamak (PEI; 25.000 kD, doğrusal). İyice karıştırın ve sonra plazmid ekleyip karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve hücrelere ekleyin.
    2. 16 h sonrası transfection, eski yerine koymak ile taze orta transfection orta artı 4.5 mM sodyum bütrat. Virüs 48 saat sonrası transfection içeren süpernatant hasat ve 5000 × g de gecede Santrifüjü tarafından konsantre. Malzemeler tabloya bakın.
  4. Seri dilutions gerçekleştirerek 293T hücreleri kullanarak viral titreleri belirlemek ve Akış Sitometresi 72 h sonrası iletim20tarafından tahlil. Viral titreleri ölçmek için bir tedbir olarak yeşil flüoresan protein (GFP) deyimi kullanın.

3. arıtma ve fare birincil NK hücreleri genişlemesi

  1. Fare birincil NK hücreleri21arındırmak. Kısaca, tek hücreli dalak süspansiyonlar B hücreleri ve makrofajlar oluşan yapisan nüfus tüketmek için naylon yün sütunların üzerinden geçmek.
  2. 1000 U/mL İnterlökin (Il) RPMI1640 orta -2 ile %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, % %5 7.5 sodyum bikarbonat ile fare NK hücreleri içeren naylon yün sütundan yapışık olmayan nüfus eluted kültür çözüm ve % 0.001 β-mercaptoethanol (RPMI1640 tam orta).
  3. Orta şişeler olmayan-yapışık T ve NKT hücreleri kaldırmak için bu kültür gün 4 değiştirin; Şişeler için yapıştırılan kalan büyük ölçüde NK hücreleri hücrelerdir. Taze RPMI1640 tam orta ve 1000 U/mL şişe doldurmak için IL-2 20 mL ekleyin.
  4. Hazırlıklar CD3 fazla % 95 ile kullanarak NK hücre özgü işaretleri20 günde 7 Akış Sitometresi tarafından fare NK hücre kültürleri saflığı kontrol-NK1.1+ nüfus.

4. arıtma ve insan birincil NK hücreleri genişlemesi

  1. PBMCs yoğunluk gradient sağlıklı insan gönüllü buffy kat üzerinden tarafından izole et. Kısaca, dikkatli bir şekilde yarı-(HBSS ile) seyreltilmiş hücre yoğunluğu geçişin bir 50 mL kurallı tüp üzerinde 15 mL 35 mL katman. Vasıl 400 × g için sallanan bir kova Open End fren olmadan 20 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Antikor tabanlı ticari negatif seçim kitleri üreticinin protokolüne göre insan birincil NK hücreleri arındırmak için kullanın.
  3. Yalıtım, NK hücre hazırlıklar saflığı ayirt analizleri tarafından belirler. NK hücre hazırlıkları 20 dk. yıkama 2 µg/mL anti-CD3 ve 4 ° C'de 2 µg/mL anti-CD56 antikorlar ile hücreleri ile iki kez PBS NK hücre popülasyonlarının CD3 yokluğu ve CD56 varlığı hücre yüzeyinde tarafından belirlenen leke.
  4. 4 ° C'de 20 dk antikorlar ile hücre hazırlıkları kuluçkaya, PBS ile yıkayın ve bir Akış Sitometresi analiz. NK hücre hazırlıklar kullanmak ile % 85'den fazla gen iletim için saflık20deneyleri.

5. lentivirus ile fare ve insan birincil NK hücreleri iletim

  1. Fare veya insan birincil NK hücreleri bir 24-şey plaka 0,5 × 105/mL orta GFP lentivirus enfeksiyonu (MOI) 5, 10 ve 20 çokluğu süpernatant huzurunda ve Pb varlığında, askıya alma (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) veya dextran (8 µg/mL).
  2. 60 dk 1000 × g de tabak santrifüj kapasitesi.
  3. Süpernatant decanting olmadan kültür hücreleri gecede (16-18 h) %5.2 ile infüzyon 37 ° C kuluçka CO2.
  4. Yıkama PBS ile 10 mL ve tam RPMI1640 kültür orta IL-2 huzurunda 2 ml resuspend (300 U/mL).
  5. İnsan test ve fare birincil NK Hücre-aracılı sitotoksisite karşı K562 ve yas-1, sırasıyla 51Krom (Cr) gerçekleştirerek-yayın deneyleri, çeşitli efektör için hedef hücre oranları22.
    1. Kısaca, bir milyon hedef hücreleri 50 µCi radiolabeled sodyum kromat 51Cr ver. 4-h kuluçka sırada, onlar alımı 51Cr hücresel proteinler içine. İnkübasyon sonunda herhangi bir unincorporated etiketi kaldırmak için hücreleri yıkayın.
    2. 51Cr mutlak, spontan ve deneysel sürümü hedef hücrelerden miktarına göre belirli tümör hücre lizis hesaplayın.
      Not: Pentaplicate deneyler üzerinden belirli lizis yüzdesi hesaplama yapıldı aşağıdaki denklemi kullanarak: % belirli lizis = ((51Cr ortalama deneysel açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın) / (Cr51demek maksimal açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın)) nerede "51Cr ortalama spontan yayın" 51yokluğunda NK hücreleri, hedef hücrelerden serbest Cr ve "51Cr ortalama maksimal yayın" 51Cr х 100, hedef hücre lizis üzerine 2 N hidroklorik asit (HCl) tarafından serbest.
  6. Transduced NK hücreleri gün 7 şişe hafifçe dokunarak hasat.
    1. Plaka bağlı anti-NKG2D (A10) mAb titre konsantrasyonları ile hasat hücreleri gecede anti-NKG2D mAb 2,5 µg/mL konsantrasyonları ile 96-de, yüksek oranda protein-emici polistren levha kaplama tarafından aktif hale getirin.
    2. Her yıkama PBS 100 µL üç kez önce birincil NK hücreleri ilavesi ile iyi.
  7. Sitokinler IFN γ gibi ölçmek için 16 ve 18 s etkinleştirme sonrası arasında bir çok kanallı pipet kullanarak kültür supernatants toplamak. Standart eğrileri enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kitleri ile sağlanan rekombinant sitokinler kullanarak oluşturun.
  8. Annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) Boyama23 kullanarak NK hücre canlılığı test ve Akış Sitometresi kullanarak dönüştürülmüş NK hücreleri arasında nekrotik hücre yüzde belirlemek.
    1. Bu tahlil gerçekleştirmek için fare ve insan NK hücreleri iletim sonra dört gün hasat iki kez 10 mL 500 × g 5 min için de soğuk PBS ile yıkayın ve bir Annexin-V (PE) kuluçkaya / 7-AAD kiti.
  9. Verileri çözümlemek için uygun Akış Sitometresi yazılımını kullanın. Canlı hücre nüfus seçin ve viral iletim24bir ölçüsü olarak GFP (FITC kanal) ifade analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Dextran birincil insan ve fare NK hücreleri lentiviral vektörü verimli gen transferi neden olmaktadır.

İnsan NK hücreleri izole ve PBMC (bir saflığı % 85'inden fazlası ile) saf ve gecede rIL-2 300 U/mL ile inkübe. Bu birincil NK hücreleri sonra çeşitli ilişkilendirmenin çeşitliliği enfeksiyon, GFP lentivirus ile transduced (MOI; 3, 10 ve 20 IU hücre başına) 8 µg/mL Türkçe, PS veya dextran huzurunda 24-şey tabak içinde. Hücreler içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Katyonik polimer Ajan fare ve insan birincil NK hücreleri lentiviral iletim verimliliğini artırır gibi bu çalışmada dextran o kullanımını gösterir. Ayrıca, Türkçe veya PS, gibi Katyonik diğer ajanlar insan birincil NK hücreleri viral vektörler teslimini üzerinde fark edilebilir bir etkisi olması. Daha önce Türkçe insan T hücreleri17gen iletim çoğaltmak olabilir kanıtlanmıştır. Bu sonuçlar, ancak, ne Türkçe ne de PS benzer bir verimlilik insan birincil NK hücreleri üzerinde var öneririz. Bu çalışma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışması iddia.

Teşekkürler

Lucia Sammarco ve onun Lulu'nun limonata standı ilham, motivasyon ve destek için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen NIH R01 AI102893 ve ncı R01 CA179363 (S.M.) tarafından desteklenmiştir; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Vakfı (S.M.); HRHM Program MACC Fonu (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Aile Vakfı (S.M.); Gardetto ailesi (S.M.); Hyundai bilim adamları (M.S.T.) programı; Hyundai umut gezici (S.R.); MACC Fonu (M.S.T. ve S.M.); Çocuk Araştırma Enstitüsü, MCW (S.R.); ve Kathy Duffey Fogerty Ödülü (M.J.R.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DekstranSigma-Aldrich90-64-91-9
polibren (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamin sülfat (PS)Sigma-Aldrichp3369
TripsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Sığır SerumuATALANTAS11150
PenisilinCorning30-001-CI
B-merkaptoetanolSIGMAM3148
sodyum piruvatCorningMT25000CI
İnterferon gama (IFN -&gama; )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding boyama çözeltisiBD51-66211E
Lipofektamin 3000Thermo FisherL3000015
İzofluranPHOENIXNDC 57319-559-05
NK hücre negatif seçim kitiKök Hücre19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
FarelerJakson664
293T hücreleriATCCCRL-3216
T75 şişeleriCornnig430641U
antikor bazlı negatif seçim kitleriKök Hücre19055
51< / sup> Krom (Cr) salım tahlilleriperkin elmer'inNEZ030'u
ELISA kitleriEbioscience00-4201-56
Sodyum ButiratSigma5887-5G
Doğrusal polietileniminpolibilimleri23966-2
FicollGE Yaşam Bilimleri17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Kaynaklar

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95(2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94(2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529(2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Do al Katil H crelerDekstran G lendirmeAk SitometrisiH cre zolasyonuSitokin AnaliziGen Aktar mmm noterapi UygulamalarViral Titre
Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.