Method Article

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyonel koregülatörler, nükleer kromatin yapısının verimli transkripsiyonel regülasyonu için hayati öneme sahiptir. Yardımcı düzenleyiciler, transkripsiyonun düzenlenmesinde çeşitli roller oynar. Bunlar, transkripsiyon faktörleri ile doğrudan etkileşimi, histonların ve diğer proteinlerin kovalent modifikasyonunu ve ara sıra kromatin konformasyon değişikliğini içerir. Buna göre, bu ağ içinde etkileşime giren proteinleri tanımlamak için nispeten hızlı yöntemler oluşturmak, altta yatan düzenleyici mekanizmaları anlamamızı geliştirmek için çok önemlidir. LC-MS/MS aracılı protein bağlayıcı partner tanımlaması, protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan doğrulanmış bir tekniktir. Bir protein kompleksinin önceden tanımlanmış bir üyesini bir antikorla (bazen etiketli bir protein için bir antikorla) immünopresipite ederek, kütle spektrometresi analizi yoluyla bilinmeyen protein etkileşimlerini tanımlamak mümkündür. Burada, nükleer kofaktörleri ve bunların bağlanma ortaklarını içeren protein etkileşimlerinin LC-MS/MS aracılı yüksek verimli tanımlanması için bir protein hazırlama yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem, hedeflenen nükleer faktörlerin transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimi, birçok biyolojik fonksiyonları çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bu etkileşimler sinyal transdüksiyonunda rol oynamaktadır; hücre zarlarından protein taşıma; Hücre metabolizması; ve DNA replikasyonu, DNA hasarı tamiri, rekombinasyon ve transkripsiyon da 1, 2, 3, 4 de dahil olmak üzere çok sayıda nükleer işlemler. Bu etkileşimlerin yer alan proteinleri belirlenmesi bu hücresel süreçlerin anlayışımızı ilerleyen nedenle önemlidir.

Imüno-(IP) protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan bir geçerli bir tekniktir. Ko-immünopresipitasyon proteinlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için, kütle spektrometresi, genellikle kullanılır 5, 6, 7, 8,9. bir antikor ile bir protein kompleksinin bir bilinen elemanının hedefleyerek, protein kompleksi izole etmek ve daha sonra kütle spektrometresi analizi ile de bilinmeyen bileşenleri tanımlamak mümkündür. ARIP4 (androjen reseptörü-etkileşimli protein 4), bir transkripsiyon coregulator açmak ya da bağlam-bağımlı bir şekilde 9, 10 hedef promoterleri bastırmak amacıyla nükleer reseptör proteinleri ile etkileşime girer. daha iyi bu nükleer faktörler düzenleyen transkripsiyon düzenleyici mekanizmaları anlamak için, biz arındırmak ve LC-MS / MS sistemi kullanılarak ARIP4 etkileşen proteinleri tespit için kapsamlı bir yöntem açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfeksiyon

  1. 100 mM kültür plakaları (2 x 10 6 hücre / çanak) içinde HEK293 hücrelerinin tohumu. Kültür,% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml streptomisin ve 100 birim / ml penisilin takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde hücre. % 5 CO2 ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin.
  2. Sonraki gün, FLAG-etiketli ARIP4 plazmid 10 ug üreticinin talimatlarına 11'e göre transfeksiyon reaktifi 40 ul kullanarak hücreleri transfekte.

2. Protein Ekstraksiyonu

  1. Yaklaşık olarak transfeksiyondan 36 saat, buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yıkayın ve bir kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat edilir. 1.5 mltube içine hücreleri aktarın ve 4 ° C 'de 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj o. Aspire süpernatan ve 5x hücre pelletini 0.4 M KCI tamponu pelet hacmi (yüksek tuz tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.4 M KCI, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-mercaptethanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). 4 ° C'de 20 dakika boyunca karışımın döndürün.
  2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,700 x g'de santrifüjleyin tüpü.
  3. (Yeni bir 2 ml'lik tüp süpernatantı (bütün hücre ekstresi) aktarın ve 0 M KCI tampon başlangıç hacminin 3x ilave seyreltme tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, % 0.1 NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli).
  4. Başka bir santrifüj (4 ° C 'de 10 dakika süre ile 17,700 x g) gerçekleştirmek ve yeni bir 2 ml tüp supernatant (bütün hücre ekstresi) aktarın.

3. Immunoprecipitation

  1. 20 mM Tris: santrifüj (2.4) boyunca (0.1 M KCI tamponu ile iki kez düşük tuzlu tampon yıkama, ardından PBS ile anti-FLAG, boncuk tanelerin 50 ul, 0.1 M glisin-hidroklorür, ve daha sonra 1 M Tris-hidroklorür, yıkama HCI (pH 8.0), 0.1 m KCI, 5 mM MgCI2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). Bu yıkama işlemi için santrifüj 4 ° C de 1 dakika boyunca 2.000 x g'de gerçekleştirilir.
  2. bütün hücre ekstresi ile FLAG, boncuk tanelerin 50 ul karıştırın ve yavaşça 2-4 ° C (adım 2.4 bütün hücre ekstresi% 1, ayrıca ileride kullanmak üzere, -80 ° C'de saklanmalıdır 4 st için karışımın döndürme ) bir girdi olarak.
  3. Bir mikro spin kolon (yerçekimi bırak) örnek aktarın. (Giriş ve akış-through Western Blot analizi kullanılarak hem protein düzeylerini kontrol), 1.5 ml tüp içinde akış yoluyla tutmak sıvı azot kullanarak dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
  4. FLAG boncuk (yerçekimi damla) ilave edilmiştir 0.1 M KCI tamponu (düşük tuz tamponu) 1 ml ilave edilir.
  5. 3.4 En az dört kez daha (beş yıkar toplam) adımı tekrarlayın.

4. Elüsyon

  1. 1.5 ml tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de olarak santrifüje tabi tutulur; boncuk kurur.
  2. alt Capsütun.
  3. 0.1 M glisin-HCl (pH 2.5) (bayrak boncukların hacmine eşit), 50 ul ekle.
  4. Yavaşça oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karışımın çalkalayın.
  5. yeni bir 1.5 ml'lik tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de da santrifüj.
  6. elüt Çözelti, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 10 ul ile nötralize edilir; pipetleme veya vorteks makinesi ile iyice karıştırın.

5. alkilasyonu ve tripsinleme

  1. 100 mM NH4 HCO3-, CH3CN 10 ul, ve karışım ditiotreitol 2 ul (112 ul toplam hacim) 50 ul ekle.
  2. 56 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  3. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek yerleştirin.
  4. iyodoasetamid örnek 333 mM, 10 ul ilave edin ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
  5. Karışıma tripsin 10 ul (33 ng / | il) ilave edilir ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe.

6 çıkar. LC-MS / MS analizi

  1. Gecede Tripsinizasyonu takiben LC-MS / MS tesisine veya analiz 12 için üçüncü taraf kütle spektrometresi laboratuarına son ürünü taşımak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlü bir ARIP4 sinyali 160 kDa, hem de sahte bir numune kontrol ve çeşitli diğer bilinmeyen proteinleri gibi (Şekil 1) tanımlanmıştır. LC-MS / MS analizi ARIP4 kompleks peptidleri ve FLAG boncuklar (Tablo 1) fraksiyonu içinde potansiyel peptid kofaktörleri iki tespit edilmiştir. P62 (Sequestosome1), bilinen bir ARIP4 kofaktör 11, bu sistemin 11 etkinliğini teyit analizi (Tablo 1) olarak te...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verimli transfeksiyon bu protokol ile başarılı bir sonuç elde etmek esastır. Buna göre, imüno-FLAG etiketli proteini seviyelerini belirlemek için, Batı benek analizi kullanılarak önerilir. Bu adım, IP başarıyla gerçekleştirildi olduğunu, kendi ilgi protein düzgün dahası, aşırı ve doğrulamak için olanak sağlar. FLAG-etiketli protein seviyeleri, aynı zamanda kütle spektrometresi analizi önce kontrol edilmelidir.

Bir sahte örnek, yanlış pozitif sonuç elde bilmek ve gerçek etkileşimlerden arka a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı (HT), Takeda Bilim Vakfı (HT) ve Japonya Bilimi Teşvik Derneği (B) to Genç Bilim İnsanları için Yardım Hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher Scientific11668019
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (EDTA içermez) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Afinite JeliSigma-AldrichA2220
Mikro Bio-Spin SütunlarıBIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PreparationNuclear CofactorLC MS MS AnalysisProtein InteractionTranscriptional RegulationImmunoprecipitationMass SpectrometryFlag Tagged ProteinsHEK 293 CellsSilver Staining

Related Articles