Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar

7.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55113

⸱

16 Şubat 2017

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Bu makalede

Özet

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Özet

Embriyonik gelişim sırasında, yetişkin vücut formunda çok çeşitli hücre tipleri ve dokuları oluşturmak için dikkate değer ölçüde az sayıda hücreden hücreye sinyal iletim yolu gereklidir. Yine de, her yıl bireysel sinyal yollarının daha fazla bileşeni keşfedilmektedir ve çalışmalar, bağlama bağlı olarak bu yolların çoğu arasında önemli bir çapraz konuşma olduğunu göstermektedir. Bu karmaşıklık, herhangi bir in vivo gelişimsel model sisteminde hücreden hücreye sinyallemeyi incelemeyi zor bir görev haline getirir. Ek olarak, yeni nesil diferansiyel ekranlar tarafından oluşturulan büyük veri kümelerinden tanımlanan sinyal yollarıyla ilişkili molekülleri karakterize etmek için verimli fonksiyonel analizler gereklidir. Burada, deniz kestanesi embriyolarında hücre kaderini ve eksen spesifikasyonunu yöneten sinyal iletim yollarının bileşenlerini verimli bir şekilde tanımlamak için basit bir yöntem gösteriyoruz. Deniz kestanesininkine benzer embriyoların genomik ve morfolojik basitliği, onları karmaşık sinyal etkileşimlerini anlamak için in vivo gelişimsel modeller haline getirir. Burada açıklanan metodoloji, bireysel yollardaki yeni sinyal iletim moleküllerinin yanı sıra diğer birçok organizmadaki çeşitli yollardaki moleküller arasındaki etkileşimleri tanımlamak için bir şablon olarak kullanılabilir.

Giriş

Gen düzenleyici ağları (GRNs) ve sinyal iletim yolları yetişkin hayvan vücut planı oluşturmak için kullanılan embriyonik gelişim sırasında genlerin mekansal ve zamansal ifade kurmak. Hücre-hücre sinyal iletim yolları hücrelerin iletişim hangi araçları sağlayan bu düzenleme ağların temel bileşenleri vardır. Bu hücresel etkileşimler kurmak ve embriyogenez 1, 2 sırasında çeşitli bölgelerde ve arasında düzenleyici ve farklılaşma genlerinin ekspresyonunu rafine. salgılanmış hücre dışı modülatörlerinin (ligandlar, antagonistler), reseptör ve ko-reseptörleri arasındaki etkileşimi sinyal transdüksiyon yollarının aktivitelerini kontrol eder. hücre içi moleküller bir yelpazesine bir hücrenin gen ekspresyonu değişimlerinin, bölme ve / veya şekli ile sonuçlanan, bu giriş çeviren. ana yoldan büyük hücre dışı ve hücre içi seviyede kullanılan anahtar moleküllerinin çoğu, birliktebilinen, tek tek sinyal yollarının karmaşıklığı nedeniyle büyük ölçüde eksik bilgidir. Buna ek olarak, farklı sinyal yolları çoğunlukla dışı, hücre içi de olumlu veya olumsuz ya birbiri ile etkileşim ve transkripsiyon seviyeleri 3, 4, 5, 6. Önemli olarak, sinyal transdüksiyon yollarının ana bileşenleri çok tüm metazoan türlerinde korunan ve özellikle yakından ilgili filumlar organizmaların karşılaştırırken, son derece önemli sinyal yollarının en sık birçok türün içindeki gelişim işlevleri yerine 7, 8, 9, 10, 11.

gelişimi sırasında sinyal çalışma herhangi bir organizmada zor bir görev olduğunu ve oradaomurgalılarda büyük olası ligand ve reseptör / ko-modülatör etkileşimlerinin sayılar, hücre içi iletim molekülleri, hem de orada 1): en ikincil ağızlılar modelleri (omurgalıların omurgasız omurgalılar, yarı sırtipliler ve derisidikenlilerde) 'de sinyal yolları okuyan bazı önemli zorluklar nedeniyle genom 12, 13, 14 karmaşıklığı farklı sinyaller arasındaki etkileşimler; 2) omurgalıların karmaşık morfolojisi ve morfogenetik hareketler genellikle daha zor ve sinyal iletim yollarının arasında fonksiyonel etkileşimleri yorumlamak yapmak; 3) En dışı derisi dikenliler omurgasız ikincil ağızlılar modeli türlerinde Analizleri bazı tunikat türlerinin 15, 16 hariç gravida kısa pencereler ile sınırlıdır.

Deniz kestanesi embriyo yukarıda belirtilen sınırlamaları birkaç vardır ve in vivo sinyal iletim yollarının ayrıntılı bir analiz yapmak için birçok benzersiz niteliklere sahiptir. Bunlar aşağıdakileri içerir: 1), deniz kestanesi genomunun uygulama kolaylığı önemli ölçüde mümkündür ligand, reseptör / co-reseptör ve hücre içi iletim molekülü sayısını azaltır 17 etkileşimi; 2) germ ve büyük embriyonik eksenlerin özellikleri ve desenlendirme kontrol GRNs iyi sinyaller 18, 19 alıcı hücre / topraklarının düzenleyici bağlamında anlamada yardımcı, deniz kestanesi embriyolarda kurulur; Embriyolar olan morfoloji analiz etmek kolay bir tek katmanlı epiteli oluşur zaman 3) Birçok sinyal iletim yolları erken bölünme ve gastrula aşamaları arasında ele alınabilir; 4) molekülleri içerenkolayca manipüle edilir deniz kestanesi sinyal yolları d; 5) Birçok deniz kestanesi 10 ila 11 ay bir yıl (örneğin Strongylocentrotus purpuratus ve Lytechinus variegatus) için gebe edilir.

Burada, sistematik ve verimli bir şekilde belirtmek ve deniz kestanesi embriyolarda desen bölgeleri birkaç omurgasız model sistemler karmaşık moleküler mekanizmaların çalışmada sunduğumuz avantajları göstermek için sinyal yollarının bileşenlerini karakterize bir yöntem mevcut.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Yüksek Verimli Morfolino Tasarım Stratejisi

  1. Bir ilgi gen (ler) (örneğin aday gen yaklaşımı, cis-düzenleyici analiz, RNAseq ve / veya proteomik diferansiyel ekranları) belirleyin.
  2. Sık sık güncellenen web sitelerinde mevcut genomik, transkriptomik ve gen ifadesi verileri kullanın (örn SpBase http://www.echinobase.org 20 ve S. purpuratus Genom Arama http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) uzaysal ekspresyon profili söz konusu gelişimsel mekanizma ile örtüşmektedir belirlemek için. Resim sentezleme verileri yoksa, o zaman qPCR primerler oluşturur ve / ya da in situ probu bir antisens geni sentezleme modelini değerlendirmek.
  3. uzaysal ve geçici ekspresyon modelini tespit edildikten sonra, genomik web sitelerinden DNA dizisini elde etmek.
    1. çeviri engelleme morfolino oligonükleotitler üretebilmek için, o dizisini eldef 5 'un çevrilmiş bölge (5' UTR) doğrudan yukarı gelen SpBase veya S. purpuratus Genom Arama web sitelerinde mevcut sentezlenmiş dizi etiketi (EST) veritabanlarından başlangıç kodonu. Bu bilgiler ilgi gen için mevcut değilse, o zaman 5 'RACE gerçekleştirin.
    2. , Bir bağlayıcı bloke morfolino tasarım ekson ve SpBase veya S purpuratus Genom ara aracında iskele BLASTN alet intronlar içeren genomik sekans arayın.
  4. istenen 25 baz çifti morfolino dizisini tasarlamak amacıyla, oligonükleotid tasarımı web sitesi http://oligodesign.gene-tools.com kullanın.
    1. bir çeviri-bloke morfolino, translasyon hedef dizinin kaynağı olarak 3 '5' mRNA dizisini kullanır. 5 'UTR sekansını (kopyalama başlangıç ​​sitesinin, akış yukarı yaklaşık olarak 70 nükleotid) artı belirgin wi kodon başlaması ile (başlangıç ​​sitesinin alt) kodlama bölgesi 25 bazlarinci parantez (ATG).
    2. bir bağlayıcı bloke morfolino, intron-ekson veya ekson-intron sınır dizisini ve sınır bölgeleri yaklaşık 50 baz (ekson sekansı 25 bazlar ve intron sekansı 25 bazları) içerir. dizi benzersiz olduğunu doğrulamak için morfolino dizisi ile genom tarayın.

Morfolino oligonükleotidleri 2. Mikroenjeksiyon

  1. 300 nmol morfolino şişenin içine nükleaz içermeyen suyun 100 uL eklenmesiyle morfolino oligonükleotid 3 mM stok çözelti hazırlayın.
    NOT: dietil pyrocarbonate morfolino zarar verebilir, çünkü yeniden süspansiyon için DEPC arıtılmış su kullanmayın.
  2. tam hızda 30 sn için stok oligonükleotid çözeltisi içeren flakon aşağı ilk sulandırma spin için - 5 ila 10 dakika, kısaca vorteks için 65 ° C'de (14,000 16,000 xg), kısaca girdap, ısı ve oda morfolino stok tutmak en az 1 saat boyunca sıcaklığı. Morfolino stok solüsyon s + 4 ° C ile -20 ° C arasında saklanır.
  3. istenilen konsantrasyonda morfolino oligonükleotitler içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Bu çözelti, genellikle% 20 gliserol ya da bir taşıyıcı olarak 125 mM KCI ve 15% (fluorescein isothiocyanate dekstran 10,000 MA 2.5 mg / ml stok çözelti) FITC Dekstran içerir. FITC Dextran ve diğer floresan dekstran konjugatlar rutin Epifloresans mikroskobu ile enjekte edilen embriyolar tanımlamak için kullanılır. -20 ° C'de saklayın enjeksiyon çözümleri.
  4. 5 dakika - en az 2 bir ısı blok ya da su banyosu içinde 65 ° C sıcaklıkta morfolino çözeltisi ısıtılır.
  5. En az 10 dakika boyunca - (16,000 xg 14,000) tam hızda 1 dakika santrifüj için - (16,000 xg 14,000), girdap Kısaca morfolino tam hızda 30 sn için çözüm dönerler.
  6. morfolino çözümü ile enjeksiyon iğneleri yükleyin. Ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü için Stepicheva ve Song 2014 21 ve alkış ve Ettensohn, 2004 bakınız"> 22.

S. purpuratus Embriyolar 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 3. Sabitleme ve Yerinde Protokol

NOT: Bu protokol Arena-Mena ark değiştirilir. 2000 23 ve Sethi ve arkadaşları. 2014 24.

  1. tespit
    1. , Embriyoları içeren oyuklara (aşağıya bakınız) tespit edici birkaç damla pipetleme yavaşça karıştırın ve bunları oturmasına izin verin. fiksatif çözüm çıkarın ve daha sonra sabitleştirici iki ek 180 uL yıkama ile embriyolar karıştırın.
      NOT: iyice nazik pipetleme yukarı ve aşağı birkaç kez yıkama sırasında embriyoların karıştırmak için önemlidir. Bunu yapmamak sinyal gürültü oranı düşürebilirsiniz.
    2. pH 7.0, 10 mM MOPS oluşan% 4 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehid içinde oda sıcaklığında 50 dakika 1 saat süresince ikinci sabitleyici yıkaması (RT) 'de düzeltmek için embriyolar boş,% 0.1 Tween-20 ve yapay seawater (ASW). En iyi sonuçlar için her zaman bu çözüm taze olun. Buna ek olarak, kullanım kolaylığı ve kullanışlılık embriyolar için 96-yuvalı plakalar içinde sabitlenir.
      1. 20 ml sabitleyici kullanım 5 mL% 16 paraformaldehit, 15 ml ASW 200 uL 1 M MOPS pH 7.0, 20 uL Tween-20.
    3. MOPS, 180 uL, oda sıcaklığında 5 kez yıkayın 0.1 M MOPS pH 7.0, 0.5 M NaCI ve Tween-20, en az 5 dakika boyunca ya da embriyolar kadar kuyunun dibine% 0.1 aşağıdakilerden oluşan yıkama tamponu. Yine, iyice hafifçe yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı yıkama tamponu içine embriyolar karıştırmak için önemlidir. 4 ° C'de depolandığında, MOPS yıkama tampon çözeltisi 2 gün için kullanılabilir ° C.
      1. 40 ml MOPS tamponu için 4 mL 1 M MOPS pH 7.0, 4 ml 5 M NaCI, 32 mL DH 2 O ve 40 uL Tween-20 yıkanır.
      2. Sabit embriyolar, 2 gün süreyle 4 o C'de saklanabilir.
        Not: uzun sabit embriyolar depolanması, daha sonra bakteriyel büyümeyi önlemek için yıkama tamponu MOPS,% 0.2 sodyum azit ilave edin.
  2. Ön-hibritleme
    1. MOPS tampon yıkama aspire ve 2 180 mcL: hibridizasyon tampon tampon hafifçe pipetleme birkaç kat çözeltisi içine embriyolar karıştırın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle inkübe yıkama MOPS 1 oranında. Hibridizasyon tamponu% 70 formamit, 0.1 M MOPS pH 7.0, 0.5 M NaCI oluşur, 1 mg / ml BSA ve% 0.1 Tween-20.
      1. 40 ml melezleme tamponu kullanılması 4 mL 1 M MOPS, pH 7.0, 4 ml 5 M NaCI, 4 mL DH 2 O, 0.04 g BSA ve 40 uL Tween-20. , Vorteks ile iyice karıştırın tekrar 28 ml formamid ve vorteks ekleyin.
    2. MOPS yıkama ve melezleştirme tamponları 1 oranında ve 1: 180 uL ekleyin: 2 çıkarın hibridizasyon tampon tampon çözeltisi içine embriyolar karıştırın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle inkübe yıkama MOPS 2 oranında.
    3. hibridizasyon tamponu 150 ul - prob hibridizasyon nazikçe 100 içine embriyolar karıştırın önce. en az 1, 50 ° C de inkübe embriyolarh.
      NOT: gecede embriyolar Hazırlanıyor kabul edilebilir. saatliğine inkübe edilmeden önce, buharlaşmayı önlemek için, bir yapışkan tabaka ile kuyu mühür.
  3. melezleme
    1. prob çözeltisi oluşturmak için yavaşça, hibridizasyon tamponu içinde girdap 0.3 prob ng / ml ve 500 ug / ml maya tRNA - Ayrı bir tüp içinde 0.1 ekleyin. Maya tRNA, anti-sens probunun özel olmayan bağlanmayı azaltmak için prob çözeltisi ilave edilir. Bu, 50 ° C'ye kadar çözeltisi ve aspire hibridizasyon tamponu önceden ısıtın.
    2. Prob çözeltisi 100 uL içine önceden hibridize embriyolar karıştırın bir yapışkan tabaka ile sızdırmaz ve prob bağlı olarak 2 ile 7 gün boyunca 50 ° C'de hibridize (foxq2 prob 2-gün inkübe edilebilir).
      NOT: İnkübasyon süreleri sonda kapalı göre değişir. düşük seviyelerde sentezlendiği bazı genler 7 günlük bir inkübasyon gerektirmez. 96 oyuklu plakalar ADHES halinde buharlaştırma karşı sigorta bir nem kutu yerleştirilebilirive sayfası düzgün mühür başarısız olur.
    3. taze MOPS 180 uL, 50 ° C de 5 kez yıkayın 3 saatlik bir toplam yıkama tamponu. Daha sonra, MOPS uL oda sıcaklığında yıkama tamponu 180 ile 3 kez (15 dakika) yıkanır. yıkama içine embriyolar hafifçe birkaç kez pipetleme her zaman tampon karıştırmak unutmayın.
  4. Antikor Kuluçka
    1. MOPS tampon yıkama aspire ve% 10 normal koyun serumunda ve 5 mg içeren bloke edici tampon içinde 180 uL embriyolar karıştırın / tampon ve gece boyunca oda sıcaklığında en az 45 dakika veya 4 ° C'de inkübe edin yıkama MOPS mL BSA.
    2. bloklama tamponunu çıkarın ve sonra 1 içeren bloke edici tampon içinde embriyolar karıştırın blokaj tamponunda seyreltilmiş alkalin fosfataz-konjuge edilmiş anti-digoksijenin antikoru ile 1500 seyreltme. Buharlaşmayı önlemek için sızdırmaz kılınmış bir plaka, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir. NOT: gecede daha uzun üzerinde antikor bırakmayın.
    3. embriyolar 6 kez yıkayın (5 dk ya da embriyolar damla kadar) MOPS oda sıcaklığında tamponu yıkayın. embriyolar can4 ° C'de gece boyunca saklanır.
  5. In situ gelişmede
    1. 0.1 M Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamizol oluşan taze pH 9.5 tamponu ile oda sıcaklığında embriyolar 3 kere (10 dakika) yıkanır ve% 0.1 Tween-20.
      1. 20 ml pH 9.5 tampon kullanım için 2 mL 1 M Tris pH 9.5, 400 uL 5 M NaCl, 1 mL, 1 M MgCl2, 20 uL Tween-20, 16.6 mi DH 2 O ve 0.0048 gr Levamisole.
    2. ışıktan koruyarak lekeleme tampon maddesi, 37 ° C 'de embriyolar inkübe edin. Lekeleme tampon maddesi,% 10, dimetil formamid oluşur, 4.5 ul / ml 4-Nitro Mavi tetrazolyum klorid (NBT) ve taze yapılmış, pH 9.5 tampon maddesi içinde 3.5 ul / ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) .
      1. lekeleme tampon maddesi ile 1 mL, 100 uL, dimetil formamid, 4.5 mL NBT ve 3.5 uL BCIP kullanın.
    3. MOPS 3 ile 5 kez yıkanarak alkalin fosfataz reaksiyonu durdurun yıkama tamponu. reaksiyon wifoxq2 probu tipik olarak 1 saat 30 dakika sürer inci. Bazı Probes RT ya da 4 ° C'de ya da gece boyunca inkübasyon gerekebilir.
    4. % 70 MOPS yıkama ve% 30 gliserol çözeltisi içine embriyolar karıştırın. gliserol mikroskopi için gerekli bir kırılma indeksine sağlar. Embriyolar birkaç hafta boyunca bu çözelti içinde saklanabilir. buharlaşmasını önlemek için plastik parafin ile plakaları Seal.
  6. Slayt hazırlama ve görüntü yakalama
    1. Bir slayt üzerine şeritler arasındaki küçük boşlukları olan bir üçgen içine çift taraflı bant üç küçük şeritler düzenleyerek bir slayt hazırlayın.
    2. üçgenin merkezinde% 70 MOPS yıkama ve% 30 gliserol çözeltisi içinde embriyo transferine ve bir lamel ile kaplayın.
    3. Örtücü camın kenarları, yaklaşık oje tabakası uygulayarak lamel mühür.
    4. 20X objektif ve ekli kamera ile bir bileşik ışık mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deniz kestanesi embriyo biz 3 farklı Wnt sinyal dalları (Wnt / β-katenin, Wnt / JNK ve Wnt / PKC) 4, 25 etkileşim ön-arka (AP) desenlendirme yöneten bir Wnt sinyal ağı oluşturmak için olduğunu göstermiştir. Bu sinyal olayların en önemli sonuçlarından biri, ilk geniş ifade ön nöroektoderm (ANE) GRN gastrulasyon başında (S. purpuratus 24 hpf) tarafından ön direğin etrafında küçük bir bölgede snrlandrlr olmasıdır. Bu sonuçl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan metodoloji .. Birçok laboratuvar incelemek için erken deniz kestanesi gelişimi sırasında benzer deneyleri kullanan temel gelişimsel mekanizmaları düzenleyen sinyalizasyon iletim yollarını ve GRNs anlamak için omurgalılar daha az genomik ve morfolojik karmaşıklığı ile embriyoları kullanılarak gücünü gösteren bir örnektir diğer hücre kaderi şartname olaylarda yer alan sinyal yolları (örn Notch, Kirpi, TGF β, ve FGF sinyal) 27, 28,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Makaleyi dikkatli bir şekilde okuduğu ve düzenlediği için Dr. Robert Angerer'e teşekkür ederiz. NIH R15HD088272-01'in yanı sıra Mississippi Eyalet Üniversitesi Araştırma ve Geliştirme Ofisi ve Biyolojik Bilimler Bölümü bu proje için RCR'ye destek sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Translasyonel bloke edici morfolino ve / veya ek yeri bloke edici morfolinoGene Tools LLCÖzelleştirilmişDaha fazla bilgi www.gene-tools.com
GliserolInvitrogen15514-011
FITC (dekstran floresein izotiyosiyanat)Invitrogen, Yaşam TeknolojileriD182125 mg / mL stok çözeltisi yapın
Paraformaldehit% 16 çözelti EM Sınıfı Elektron Mikroskopi Bilimleri15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamidSigma Aldrich47671-1L-F
Maya tRNAİnvitrojen15401-029
Normal KeçiSerumu Sigma AldrichG9023-10mL
Alkalin Fosfataz konjuge anti-digoksigenin antikoruRoche11 093 274 910
Tetramisol hidroklorür (levamisol)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureAraştırma Ürünleri Internationall Corp56-40-6
Sodyum KlorürFisher ScientificBP358-10
Magnezyum klorürSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Kloro-3-indolil-fosfatRoche11 383 221 001
4 Nitro mavi tetrazolyum klorür (NBT)Roche11 383 213 001
Dimetil FormamidSigma AldrichD4551-500mL
Potasyum KlorürSigma AldrichP9541-5KG
Sodyum BikarbonatSigma AldrichS5761-500G
Magnezyum SülfatSigma AldrichM7506-2KG
Kalsiyum KlorürSigma AldrichC1016-500G

Kaynaklar

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467(2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434(2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259(2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001(2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cre Kader BelirlemesiEksen Sinyal YolaklarGen D zenleyici A larSinyal letim AnaliziEvrimsel Geli im BiyolojisiEmbriyonik Eksen al malarBasit Organizma ModelleriKompleks Sinyal Etkile imleri
Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.