Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama
Bu makalede
Özet
Özet
Tubal morphogenesis erkek üreme sistemi dahil olmak üzere pek çok memeli organların gelişimi için temel bir gerekliliktir. epididimis, erkek üreme sisteminin ayrılmaz bir parçası, sperm depolama, olgunlaşması ve ulaşım sorumludur. yetişkin epididimis Wolf kanalı (WD) olarak bilinen basit ve düz embriyonik habercisi gelişir oldukça sarmal tüp. testiste sperm oosit döller edemiyoruz olarak epididimin uygun kıvrılma, erkek doğurganlık için esastır. Ancak, epididimal geliştirme ve sarma sorumlu mekanizma kısmen tüm organ kültürü ve görüntüleme yöntemlerinin eksikliği, belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, biz daha iyi diğer boru şeklindeki organları incelemek için uygulanabilir WD sarma ve geliştirme, sürecini görselleştirmek için bir in vitro kültür sistemi ve tüm montaj immünofloresan protokol açıklar.
Giriş
Erkek üreme sistemi öncelikle testis oluşur, germ hücre gelişimi ve farklılaşmasında ve sperm olgunlaşması, ulaşım ve depolama için gerekli olan karmaşık bir duktal sistemi için site. Epididimis vas deferens ile testis ve germ hücrelerinin 1 post-testiküler gelişim ve olgunlaşma ağırlıklı olarak yer bağlayan bir boru şeklinde bir organdır. Çok sarmal yetişkin fare epididimis basit ve düz habercisi tüp, Wolf kanalı (WD) 1 gelişir. Sperm dişi germ hücrelerinin 2 dölleme kapasitesini elde etmek için epididimin karmaşık ve kangal yapısı esastır. erkek doğurganlık için böyle önemli bir organı şekline geliştirir ve alır ne kadar iyi anlaşıl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan bakım ve deneysel prosedürler Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yasası, Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yönetmeliği ve bakımı için Avustralya kodu ve Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Kurul kurallarına uygun olarak yapılmış ve teyit edilmiştir bilimsel amaçlarla hayvanların kullanımı. Fareler üzerinde yapılan tüm işlemler Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Zaman Çiftleşme
- Çifti 6-8 haftalık erkek ve gündüz döngüsünün sonuna hemen önce dişi fareler.
- Vajinal fişler varlığı sabah erken (veya 8.00 önceki AM), her gün için dişileri kontrol edin. fiş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
gelişimi sırasında, WD basit ve düz tüp son derece karmaşık ve sarmal kanal dönüşür, burada önemli değişikliklere uğrar. Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, WDS kültür koşulları benzer bir dönüşüm geçirmektedir. Burada 3 gün (Şekil 3) kültürlendi Wigner sonuçları göstermiştir. WD morfolojilerinden rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için, kültür ortamı farklı sinyal yollarını hedef alan inhibitörleri ve aktivatörleri ile takviye edilebilir. Şekil 3C, belli inhibitörü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Organ kültürü sistemi, geleneksel hücre kültürü sistemi üzerinde birçok avantajı vardır. Bu sistem, farklı hücre tipleri arasında, orijinal yapısal ilişkiler ve etkileşimler korur. Bu in vivo sistemlerde taklit ve niş faktörü yoktur hücre kültürü çalışmalarında daha doğru bilgi verir. organ kültürü sistemlerinin kullanılması da bütün hayvan kullanımına kıyasla avantajlara sahiptir. Bunlar bütün hayvan, kolay bakım ve organ kültürü sisteminin bakım, vs Ayrıca kullanarak yüksek maliyeti, çeşitli farmakol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz bu yazının eleştirel okuma için jinekoloji onkoloji grubu üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Araştırma Konseyi ve Kanser Enstitüsü NSW (PST) fon tarafından desteklenmektedir. MK Newcastle Lisansüstü Araştırma Bursu Üniversitesi bir alıcı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 kuyulu plakalar | Corning, ABD | 3524 | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium: Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) | Sigma, ABD | D8437 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Interpath, Avustralya | SH30034.02 | Kültür ortamında kullanılan %10 FBS |
| L-Glutamin | GE Healthcare Life Sciences, ABD | SH30034.01 | %1 konsantrasyon kullanıldı |
| Penisilin / Streptomisin | Gibco, ABD | 15070-063 | %1 konsantrasyon kullanıldı |
| Whatman Nuclepore Polikarbonat Track-Etch | Whatman, ABD | 110409 | Membran (0.8 & mikro; m) |
| IWR1 | Sigma, ABD | 10161-5mg | 100 ve mikro; M konsantrasyonu kullanılan |
| Paraformaldehit (PFA) | Elektron Mikroskobu Bilimleri, ABD | 15710 | %16 stok, kullanım için PBS'de %4. ZEHİRLİ - eldiven giyin ve lavaboya atılamaz atılamaz |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, ABD | 214-20L PL | Mutlak, miliQ su ile% 25, 50 ve% 75 yapın. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, ABD | 2509-500ml | Çok viskoz, |
| Triton X-100 | Sigma, ABD | T8787-50ml | Çok viskoz, dağıtırken dikkatli |
| olun Di-Sodyum Hidrojen Fosfat | Thermo Scientific Fisher, ABD | 621-500mg | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Sodyum Di-hidrojen Fosfat | Ajax Finechem, ABD | 4745-500g | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Sodyum Klorür | Thermo Scientific Fisher, ABD | 465-500g | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Cytokeratin8/Troma | I Developmental Studies Hybridoma Bank, ABD (DHSB) | TROMA-I | 1:250 bloke edici tampon |
| aktif ve beta; katenin | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, ABD | D13A1 | 1:200 engelleme tamponu |
| fosfo-Histon 3 | Millipore, MA, ABD | 06-570 | 1:200 engelleme tamponu |
| Alexa488 Keçi anti-tavşan IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ABD | 111-545-047 | 1:250 engelleme tamponunda |
| Alexa594 Keçi anti-sıçan IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ABD | 112-585-072 | 1:250 engelleme tamponunda |
| Gliserol | Thermo Fisher Scientific, ABD | 242-500ml | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| n-Propil galate | Sigma, ABD | 2370-2 | |
| - (4-amidinofenil) -1H -indol-6-karboksamidin (DAPI) | Sigma, ABD | D9564-10mg | Nükleik asitleri boyamak için kullanın (DNA) |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Kapak Fişleri (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Kaynaklar
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
