Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama
Bu makalede
Özet
Özet
Tubal morphogenesis erkek üreme sistemi dahil olmak üzere pek çok memeli organların gelişimi için temel bir gerekliliktir. epididimis, erkek üreme sisteminin ayrılmaz bir parçası, sperm depolama, olgunlaşması ve ulaşım sorumludur. yetişkin epididimis Wolf kanalı (WD) olarak bilinen basit ve düz embriyonik habercisi gelişir oldukça sarmal tüp. testiste sperm oosit döller edemiyoruz olarak epididimin uygun kıvrılma, erkek doğurganlık için esastır. Ancak, epididimal geliştirme ve sarma sorumlu mekanizma kısmen tüm organ kültürü ve görüntüleme yöntemlerinin eksikliği, belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, biz daha iyi diğer boru şeklindeki organları incelemek için uygulanabilir WD sarma ve geliştirme, sürecini görselleştirmek için bir in vitro kültür sistemi ve tüm montaj immünofloresan protokol açıklar.
Giriş
Erkek üreme sistemi öncelikle testis oluşur, germ hücre gelişimi ve farklılaşmasında ve sperm olgunlaşması, ulaşım ve depolama için gerekli olan karmaşık bir duktal sistemi için site. Epididimis vas deferens ile testis ve germ hücrelerinin 1 post-testiküler gelişim ve olgunlaşma ağırlıklı olarak yer bağlayan bir boru şeklinde bir organdır. Çok sarmal yetişkin fare epididimis basit ve düz habercisi tüp, Wolf kanalı (WD) 1 gelişir. Sperm dişi germ hücrelerinin 2 dölleme kapasitesini elde etmek için epididimin karmaşık ve kangal yapısı esastır. erkek doğurganlık için böyle önemli bir organı şekline geliştirir ve alır ne kadar iyi anlaşılamamıştır. Çeşitli sinyal yolları gibi Wnt 3,4 ve yol 5 sinyal androjen olarak WD gelişiminde rol gösterilmiştir. Bizim son çalışmalar bal ihtiyacını kurmuşturanced Wnt doğum öncesi gelişim 4 sırasında WD sarma için sinyalizasyon. Ancak, ileri çalışmalar epididimal epitel içinde ve interstisyel hücreler ile doğum sonrası epididimal sarma, hücresel farklılaşma ve hücre-hücre iletişimi yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, çeşitli organ sistemlerinin 6 gelişimini ve hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanması / onaylama için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. geniş kullanılmasına rağmen, tahmin gen fonksiyonu açısından hedeflenen fare mutantlar öngörülemeyen fenotip ve bazı modellerde boş mutantlar hiçbir fenotip, genetik ve çevresel faktörlerin etkisiyle, emek yoğun ve dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş fare modelleri önemli kısıtlamalar vardır zaman alıcı fare modellerinin geliştirilmesi süreci. Bu nedenle, sadece genetik olarak modi gelen bulguların önemi yorumlanmasığı fare modelleri, her zaman 6 kolay değildir. Bu kısıtlamalar, bize kontrol kültür koşulları gerçek zamanlı olarak birden fazla sinyalleme yolunu değiştirmek için esneklik sağlar nitro organ kültür sisteminde kullanılarak aşılabilir. Organ kültürü sistemi bütün organların 7 fizyolojisini ve patolojisi ile ilgili vesile oluyor. Böylelikle organın şekil, yapı ve işlev 8 daha iyi anlaşılmasını sağlayan in vivo koşullarında varolduğu Dahası, florofor etiketli antikor ile boyandı Bütün organların görüntüleme, üç boyutlu bir bağlamda ilgi işaretleri görsel olanak sağlamaktadır.
Burada, örneğin WDS ile boru şekilli organ morfojenezi ilgili çeşitli sorulara cevap uygulanabilir fare embriyonik gonadal sırtlar izolasyonu, in vitro kültürü ve WDS'nin bütün montaj immünofloresan görüntüleme yöntemleri tarif etmişlerdir. Bu protokol, biz15.5 gün izole fare embriyonik ürogenital sırtlar coitum (DPC) hamile baraj sonrası ve bir epitel hücre markeri (sitokeratin 8, CK8), bir hücre çoğalması markeri (fosfo-Histon 3, PH3) ve aktif için immün ardından 3 gün boyunca onları kültüre βcatenin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan bakım ve deneysel prosedürler Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yasası, Yeni Güney Galler Hayvan Araştırmaları Yönetmeliği ve bakımı için Avustralya kodu ve Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Kurul kurallarına uygun olarak yapılmış ve teyit edilmiştir bilimsel amaçlarla hayvanların kullanımı. Fareler üzerinde yapılan tüm işlemler Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Zaman Çiftleşme
- Çifti 6-8 haftalık erkek ve gündüz döngüsünün sonuna hemen önce dişi fareler.
- Vajinal fişler varlığı sabah erken (veya 8.00 önceki AM), her gün için dişileri kontrol edin. fişin Gün 0.5 DPC olarak kabul edilir.
- (Erkek olmadan) yeni bir kafes içine vajinal fişi ile kadın aktarın ve fiş tarihini etiket.
Fare Embriyonik Gonadal Ridges 2. izolasyonu
- Fare embryo yalıtmakAşağıda tarif edildiği gibi 15.5 DPC hamile kadınlarda IC gonadal sırtlar bir kaç değişiklik ile, 9'da tarif edildiği gibi.
- Hamile kadın öğleden sonra gebeliğin ertesi gün içine girmek için kabul edilir zaman olarak öğleden önce diseksiyonu yürütmek.
- servikal dislokasyon kullanarak 15.5 DPC hamile kadın Kurban (ya da kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış protokole göre).
- Emici kağıt mendil sırtını fare tutmak ve% 70 etanol ile karın ventral tarafında püskürtün.
- göğüs kafesi sonuna kadar ürogenital açıklık uzanan, forseps ile alt karın cildi (ventral tarafı) kaldırın ve cerrahi makas kullanarak lateral kesi yapmak. karın ortaya çıkarmak için hayvan başına doğru cilt çekin.
- periton boşluğuna maruz cerrahi makas ile karın kaslarını kesin. sadece rahim ağzı üzerinde forseps ile gebe rahim tut ve bir kesim yapmak. Şimdi t tutarak rahim kaldırıno mesane ve periton ekten rahim ayırmak için uterotubal kavşaklarda kesim tarafından takip rahim geniş ligament kesti.
- buz soğukluğunda HBSS (Hank dengeli tuz çözeltisi) ihtiva eden bir 50 ml tüp içine rahim aktarın. Aşırı kan çıkarmak için buz gibi soğuk HBSS ile nazikçe gebe uterusu yıkayın.
- buz HBSS içeren bir Petri kabındaki rahim tutmak ve buz üzerinde tutmak. rahim duvarına kesin ve embriyoların çıkar. buz üzerinde HBSS ile yeni bir Petri kabındaki embriyoların tutun.
- Temiz, steril kağıt mendil alın ve yeni bir Petri kabı üzerine koydu. Kağıt mendil% 70 etanol püskürtün. Yan tarafında, bu kağıt mendil embriyo edin ve Şekil 1 'de noktalı çizgi ile gösterilen bir yönde, steril bir bıçak kullanarak alt karın kesti.
- vertebra sütun iğneleyerek steril sünger kaide üzerinde embriyo sabitleyin.
- Diseksiyon stereomicroscope altında yerleştirin ve dikkatlice ventral orta hat boyunca kesilir. karaciğer ve bağırsakları çıkarın. Fare ürogenital sistem (böbrek, üreter, testis, WD ve vas deferens) artık görünür olmalıdır.
- testis ve WD kesip, ve buz üzerinde, HBSS ile yeni bir Petri kabı tutun. WD ve testis çıkarmak, üretra onun eki yakın vas deferens kesip gubernakulum gelen WD alt kısmının eki kesti.
- Aynı grubun embriyolar (Bu deneysel plan uyarınca değişebilir) dan testisler ve WDS Havuz.
Embriyonik Gonadal Ridges 3. Kültür (Şekil 2)
- % 10 FBS (Fetal Sığır Serumu),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile DMEM / F12 ilave embriyonik gonadal sırtlar kültürlenmesi için hazırlarlar. Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar ortam ısıtın.
- 24-iyi hücre kültür plakası kaynağı başına ortam 300 uL ekleyin.
- taze Petri plaka almak ve üzerinde steril HBSS küçük bir damla koyun. (0,8 bir polikarbonat parça rölyef membran koymak81; onun parlayan yüzeyi HBSS bakan ile HBSS bu damla m).
- Kullanarak temiz forseps (yukarı bakacak şekilde, kendi pürüzlü yüzey üzerine) membran üzerinde iki WDS ve gonadlar koymak ve steril mendil / emici kağıt kullanarak HBSS maksimum miktarını çıkarın. Emici kağıt ile doku dokunmayın; Aksi takdirde, bu dokuya zarar verecektir.
- WDS ne gonadlar ne birbirlerine dokunmadan emin olun. Aksi takdirde, bunlar sonraki kuluçka sırasında birlikte sopa olacak.
- Hava orta arayüzü 300 uL kültür ortamı ve kültürü bunları ihtiva eden 24 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu içinde doku ile membran aktarın. Wigner bir kistik büyüme membranlar sonuçları üzerinde çok fazla kültür ortamı.
- % 5 CO2 varlığında 37 ° C inkübatör inkübe plakası.
- Her gün kültür ortamı değiştirin. pipet ile orta değiştirmek için, iyi ilk gelen orta kaldırmak ve daha sonra önceden ısıtılmış taze ortam 300 mcL ekleyin.
Not:WD morfojenezi farklı sinyal yollarının etkisinin araştırılması için, gerekli konsantrasyonlarda kimyasal aktivatörler ve / veya inhibitörler, kültür ortamına ilave edilebilir. - Kültür 3 gün boyunca dokular. 3 gün içinde, 15.5 DPC embriyo toplanan kıvrıldığı WDS çok dolambaçlı tüpleri (Şekil 3B) dönüşüyor. Wnt inhibitörü IWR1 eklenmesi kıvrılma WD (Şekil 3C) inhibisyonu ile sonuçlanır.
- hasat için bu dokular buz gibi soğuk PBS ile bir Petri kabı alır. Petri plaka içine kültürlü gonad ve WD membran aktarın. Membran PBS üstünde yüzer. PBS içinde lavabo ve gonad ve WD çıkarmak membran basın.
- 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4'lük paraformaldehit (PFA) O / N ile dokuları düzeltildi. Gerekirse, tespitten önce Wigner aydınlık alan görüntüleri çekmek.
4. Tüm Dağı İmmünofloresan
- Yıkama sabit dokular PBS-T (PBS +% 1 ile 3 kezOda sıcaklığında, yavaş sallama, 10 dakika her biri, Triton X-100).
- Yavaş sallanan (~ 30 rpm) ile, 4 ° C'de, etanol (% 25,% 50,% 75 ve% 100), 10 dakika her biri bir kademeli dizi doku kurutmak. Bu adımda, dokular% 75 etanol içinde 4 ° C'de saklanabilir.
- , Etanol değiştirmek 2 dakika süreyle rahatsız dokuları tutmak ve izin vermek için dokular yerleşmek. Mümkün olduğu kadar supernatant çıkar ve daha sonra etanol bir üst konsantrasyonu ekleyin. dokulara zarar görmemesi için, pipet ucu herhangi bir aşamada dokuları temas etmemelidir.
- dehidratasyon sonra yavaş çalkalanarak, 4 ° C'de, etanol (100,% 75,% 50 ve% 25%), 10 dakika, her bir kademeli dizi doku rehidrate.
- yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-T (PBS +% 0.1 Triton X-100), 4 kere, 20 dakika her biri ile dokuların yıkayın.
- Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için dokular bloğun (PBS +% 1 BSA +% 0.2 yağsız kuru süt tozu +% 0.3 Triton X-100).
- afteR bloke edici (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) birincil antikor çözeltisine dokuları transferi ve yumuşak sallanan (~ 30 rpm) ile 4 ° C 'de O / N inkübe edin. Kullanılan birincil antikorlar seyreltileri malzemeler Tablo l'de tarif edilmektedir.
- Sonraki gün, bir hafif sallanan (~ 30 rpm) ile, oda sıcaklığında PBS-MT (PBS +% 2 yağsız kuru süt tozu +% 0.5 Tween-20), 4x, 30 dakika her biri ile dokuların yıkayın.
- hafifçe çalkalanarak, bloke edici tampon içinde 250 (Bu adım, bireysel antikorlar için optimizasyon ihtiyacı) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe Bu yıkama aşamasından sonra, 1 'deki bir seyreltmede ikincil antikor ilave edin.
- Şimdi itibaren ikincil antikorlar ışığa duyarlı fluorophores etiketli olarak ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplı dokuların tutmak.
- dokular hafifçe çalkalanarak, PBS-T (PBS +% 0.1 Tween-20), 30 dakika her biri ile 3 kez yıkanır.
- lekeli dokuları montajı için slaytlar hazırlayın.
- Bunun için, cam kapak fişleri kestive bir elmas kalem kullanarak ince şeritler halinde iki şerit çivi emaye kullanarak cam slayt diğeri üzerinde bir sopa. Bu iki sınırları arasında iki sınırları ve yeri dokuları yapın.
- DAPI içeren montaj orta ekleyin ve bir kapak kayma koymak. slayt bunu düzeltmek için kapak kayma köşelerinde tırnak emaye uygulayın.
Not: Dokular artık görüntüleme için hazır. -20 ° C'de bu slaytları saklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
gelişimi sırasında, WD basit ve düz tüp son derece karmaşık ve sarmal kanal dönüşür, burada önemli değişikliklere uğrar. Yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak, WDS kültür koşulları benzer bir dönüşüm geçirmektedir. Burada 3 gün (Şekil 3) kültürlendi Wigner sonuçları göstermiştir. WD morfolojilerinden rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için, kültür ortamı farklı sinyal yollarını hedef alan inhibitörleri ve aktivatörleri ile takviye edilebilir. Şekil 3C, belli inhibitörü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Organ kültürü sistemi, geleneksel hücre kültürü sistemi üzerinde birçok avantajı vardır. Bu sistem, farklı hücre tipleri arasında, orijinal yapısal ilişkiler ve etkileşimler korur. Bu in vivo sistemlerde taklit ve niş faktörü yoktur hücre kültürü çalışmalarında daha doğru bilgi verir. organ kültürü sistemlerinin kullanılması da bütün hayvan kullanımına kıyasla avantajlara sahiptir. Bunlar bütün hayvan, kolay bakım ve organ kültürü sisteminin bakım, vs Ayrıca kullanarak yüksek maliyeti, çeşitli farmakol...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz bu yazının eleştirel okuma için jinekoloji onkoloji grubu üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Araştırma Konseyi ve Kanser Enstitüsü NSW (PST) fon tarafından desteklenmektedir. MK Newcastle Lisansüstü Araştırma Bursu Üniversitesi bir alıcı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 kuyulu plakalar | Corning, ABD | 3524 | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium: Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) | Sigma, ABD | D8437 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Interpath, Avustralya | SH30034.02 | Kültür ortamında kullanılan %10 FBS |
| L-Glutamin | GE Healthcare Life Sciences, ABD | SH30034.01 | %1 konsantrasyon kullanıldı |
| Penisilin / Streptomisin | Gibco, ABD | 15070-063 | %1 konsantrasyon kullanıldı |
| Whatman Nuclepore Polikarbonat Track-Etch | Whatman, ABD | 110409 | Membran (0.8 & mikro; m) |
| IWR1 | Sigma, ABD | 10161-5mg | 100 ve mikro; M konsantrasyonu kullanılan |
| Paraformaldehit (PFA) | Elektron Mikroskobu Bilimleri, ABD | 15710 | %16 stok, kullanım için PBS'de %4. ZEHİRLİ - eldiven giyin ve lavaboya atılamaz atılamaz |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, ABD | 214-20L PL | Mutlak, miliQ su ile% 25, 50 ve% 75 yapın. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, ABD | 2509-500ml | Çok viskoz, |
| Triton X-100 | Sigma, ABD | T8787-50ml | Çok viskoz, dağıtırken dikkatli |
| olun Di-Sodyum Hidrojen Fosfat | Thermo Scientific Fisher, ABD | 621-500mg | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Sodyum Di-hidrojen Fosfat | Ajax Finechem, ABD | 4745-500g | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Sodyum Klorür | Thermo Scientific Fisher, ABD | 465-500g | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| Cytokeratin8/Troma | I Developmental Studies Hybridoma Bank, ABD (DHSB) | TROMA-I | 1:250 bloke edici tampon |
| aktif ve beta; katenin | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, ABD | D13A1 | 1:200 engelleme tamponu |
| fosfo-Histon 3 | Millipore, MA, ABD | 06-570 | 1:200 engelleme tamponu |
| Alexa488 Keçi anti-tavşan IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ABD | 111-545-047 | 1:250 engelleme tamponunda |
| Alexa594 Keçi anti-sıçan IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ABD | 112-585-072 | 1:250 engelleme tamponunda |
| Gliserol | Thermo Fisher Scientific, ABD | 242-500ml | diğer satıcılardan satın alınabilir |
| n-Propil galate | Sigma, ABD | 2370-2 | |
| - (4-amidinofenil) -1H -indol-6-karboksamidin (DAPI) | Sigma, ABD | D9564-10mg | Nükleik asitleri boyamak için kullanın (DNA) |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Kapak Fişleri (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Kaynaklar
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343(2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
