Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini
Bu makalede
Özet
Özet
genomun replikasyonu, DNA kopyalama doğruluğunu sağlayan bir yüksek ölçüde düzenlenmiş bir işlemde, hücre döngüsünün S fazında oluşur. Her genomik bölge çoğaltma birden kökenleri eşzamanlı aktivasyonu yoluyla S fazında belirgin bir anda çoğaltılır. çoğaltma (İş Tanımı) Zaman birçok genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkilidir ve mutasyon oranları ve kanser ile bağlantılıdır. Sağlıkta ve hastalıkta, çoğaltma programın tam genomik görünümü kavramak önemli bir gelecek hedefi ve mücadeledir.
, Memeli hücrelerinin genomu geniş Tanımı eşleştirmek için basit bir yaklaşım: Bu makalede ayrıntılı olarak (CNR-İş Tanımı burada denir) yöntemini "Çoğaltma genomik Zaman haritalama için S / G1 Kopya sayısı Oranı" açıklar. yöntem S fazı hücreleri ve G1 faz hücreleri arasındaki kopya sayısı farklılıklara dayanmaktadır. CNR-tor yöntemi 6 adımda gerçekleştirilir: propidyum iyodür (PI) hücre ve boyama hazırlanması 1.; 2. Sorting G1 ve sıralama floresan aktive hücre kullanılarak S fazı hücreleri (FACS); 3. DNA saflaştırılması; 4. Sonication; 5. Kütüphane hazırlık ve sıralama; ve 6. Biyoinformatik analizi. CNR-Şartname yöntemi ayrıntılı çoğaltma haritalarda sonuçlanan hızlı ve kolay bir yaklaşımdır.
Giriş
Memeli DNA replikasyonu, hücre döngüsü sırasında tam olarak bir kez her kromozomun tam çoğaltma sağlamak için sıkıca düzenlenir. Çoğaltma oldukça düzenlenmiş sıraya göre gerçekleşir - Birden fazla büyük genomik bölgeler (~ Mb) diğer genomik bölgelerde orta ya da geç S fazı (orta ve geç kopyalayan etki) daha sonra çoğaltmak ise 1 (erken etki kopyalayan) S fazına başında çoğaltırlar. Genomun 50%, kanser dönüşüm 5 içinde farklılaşması 3, 4 sırasında ve daha az bir ölçüde, dokular 2 arasındaki ToR'u bilgileri - genomunun en% 30 ise, tüm d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Şartname sadece büyüyor, eşitlenmemiş hücreler üzerinde ölçülebilir. Genellikle S fazında ~ 1 x 10 5 hücre neden olur 2 x 10 6 hızlı büyüyen hücreler, (oran sınırlayıcı adım) - prosedür en az 1 ile başlamalıdır. Iki ya da üç kez tekrarlanmış kullanılarak her bir deney için tavsiye edilir. CNR-ToR'un tüm süreci bir hafta içinde tamamlanabilir - iki gün bir veya iki gün sıralama için gerekli olan ve ek bir gün ilk veri analizi için gerekli olan, kütüphane hazırlanmasına kadar tüm adımlar adanmış olmalıdır.
Kültür hücreleri 1. Koleksiyonu
NOT: protokolü (yaklaşık 2 içeren - 5 x 10
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik Tanımı harita fare embriyonik fibroblastlar için Şekil 3 (MEF'ler) 'de gösterilmiştir. gösterir çünkü bu rakam analiz sürecini gösteren bireysel pencereler (adım 8.3) için normalize S / G1 oranı olan noktalar, yanı sıra kübik yumuşatma ve enterpolasyon (adım 8.5) sonucunda oluşan çizgidir.
i) erken aynı anda (TO = sabit Tanımı bölgeler) çoğaltmak bir megabase sırasına göre büyük bölgeler (), orta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CNR-Tanımı (Rhind N. ve Gilbert DM 20 tarafından incelenmiştir) S FACS ve G1 aşamaları ile ayrılabilir bir ökaryotik proliferatif hücre popülasyonu ilke olarak gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen yöntem, insan ve fare gibi ~ 3 Gb bir genom boyutuna sahip memeli hücrelerine ayarlanmıştır. (Hücre hazırlama ve dizileme derinliğinde) CNR-tor protokol küçük değişiklikler ökaryotlarda için ayarlamak için, ihtiyaç vardır. bu hız sınırlayıcı bir adımdır çünkü Dikkat S fazı hücrelerinin yeterli mikt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Biz rakamları oluşturmada yardım için Oriya Vardi teşekkür ederiz. BS grubunda çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 567/10) ve Grant (# 281306) Başlangıç Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PBS | BI (Biyolojik Endüstriler) | 02-023-1A | |
| Tripsin-EDTA | BI (Biyolojik Endüstriler) | 03-052-1B | |
| 15 mL konik tüp | Corning | 430790 | |
| 5 mL Polistiren yuvarlak Hücre süzgeç kapaklı alt tüp | BD-Falcon | 352235 | |
| Etanol | Gadot | 64-17-5 | |
| RNAse-A 10 mg / mL | Sigma | R4875 | |
| Propidiom iyodür 1 mg / mL | Sigma | P4170 | |
| Parafilm | Parafilm PM-996 | ||
| 1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tüpleri ve nbsp; | Eppendorf | 22431021 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| 1.7 mL MaxyClear tüp | Axygen | MCT-175-C | |
| Manyetik Boncuklar - Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ultrasonikatör | Covaris | M serisi & nbsp; -530092 | |
| 50 & mikro; L microTUBE AFA Fiber Vidalı Kapak 6 x 16 mm | Covaris | 520096 | |
| Qubit florometre | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyet (HS) Test Kiti | Invitrogen | Q32854 | |
| Elektroforez 2200 Teyp istasyonu sistemi | Agilent | D1000 ScreenTape | |
| Sıralama - Illumina NextSeq sistemi | Illumina | SY-415-1001 | |
| DNA saflaştırması için Dneasy kiti | Qiagen | 69504 | |
| PureProteom Manyetik Stand | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 | |
| FACS sıralayıcı | BD | FACSARIA III | |
| FACS yazılımı | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Kaynaklar
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
