Yöntem makalesi

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 Temmuz 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, subkutan fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru bir şekilde simüle etmemektedir. Ortotopik fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller teknik olarak özellikle büyük bağırsak gibi içi boş organlarda talep ederler. Güvenilir bir şekilde büyüyen ve metastaz yapan tek tip tümörler üretmek için, standartlaştırılmış tümör hücresi hazırlama teknikleri ve enjeksiyon önemlidir.

Oldukça üniform bir tümör geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen bir ortotopik fare modelinde kolorektal kanser (CRC) geliştirdik. Primer tümörler, 2 boyutlu (2D) hücre dizileri veya 3 boyutlu (3D) organoidlerden gelen tümör hücreleri çekum içine enjekte edilir ve enjekte edilen tümör hücrelerinin metastatik potansiyeline bağlı olarak oldukça metastatik tümörler oluşturur. Ek olarak,CTC'ler düzenli olarak bulunabilir. Burada, 2D hücre çizgilerinin ve 3D organoidlerin yanı sıra primer tümör dokusundan, cerrahi ve enjeksiyon tekniklerinin yanı sıra tümörlü farelerden CTC'lerin izolasyonu ve mevcut sorun giderme ipuçlarından tümör hücresi hazırlama tekniğini açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolorektal kanser (CRC), batı ülkelerinde kanser ölümünün en yaygın nedenlerinden biridir. Primer tümör genellikle rezeke edilebilir olsa 1, uzak metastaz oluşumu önemli ölçüde ölüme götürecek sıklıkla prognozu kötüleştirir ve. 2 , 3 Metastazın biyolojik korelasyonu, tümörden ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleridir (CTC'ler), dolaşımda hayatta kalır, hedef organdaki epitele bağlanır, organı istila eder ve nihayetinde yeni lezyonlara doğru büyür. Dolaşımda bulunan tümör hücreleri prognostik alaka, 5, 6, 7, 8, olduğu bilinmektedir, ancak 4, 9 biyoloji kısmen CRC bunların çok nadir bir sonucu olarak anlaşılmaktadır. 10

Fare modelleri güçlü bir tOol kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek. Klasik, subkütan tümör modelleri, alıcı camlara tümör hücrelerinin subkütan enjeksiyonuyla üretilir; bu, bağışıklık kazandıran (eş merkezli tümör hücreleri kullanılıyorsa) veya immün yetmezlik gösterebilir. Subkütan tümör modelleri ucuzdur ve verileri hızlı bir şekilde üretir; Uç nokta tümör büyümesi kolaylıkla ve invaziv olarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu tür modellerde antitümör aktivite sergileyen yeni bileşiklerin% 88'i klinik araştırmalarda başarısız olur. 11 Bu kısmen insanlarla fare arasındaki farklılıklar nedeniyle; Bununla birlikte, bu başarısızlığın büyük bir kısmı subkutan fare modellerinin düşük prediktif değerinden kaynaklanmaktadır.

Tümör hücrelerinin orijin organına enjekte edildiği ve böylece orijinal mikro ortamda büyüdüğü ortotopik fare modelleri, kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılır. 11 , 12 , 13 , 14 Ortotopik modeller sadece lokal tümör büyüme koşullarını simüle etmekle kalmaz; Ortotopik fare modelleri, tümör büyümesinin anatomik olarak doğru bir yerinin bir sonucu olarak, metastazın gerçekçi simülasyonunu sağlar ve bu nedenle CRC'deki farklı tedavilere 8 , 15 , 16 veya CTC biyolojisini incelemek için kullanılır. 13 , 17

Ortotopik fare modellerinin en büyük dezavantajı, teknik karmaşıklığıdır. Hücrelerin enjekte edileceği organa bağlı olarak, deneyci, tekrarlanabilir tümörleri indükleyene kadar öğrenme eğrisinin oldukça uzundur. Bu, özellikle tümör hücrelerinin bağırsak duvarına enjekte edilmesi gerektiği için kolorektal kanser modelleri için geçerlidir, bu genellikle perforasyon, tümör hücresi sızıntısı veya endoluminal tümör hücre kaybına neden olur. Bu birBu makale, birincil doku numunelerinden, 2D hücre çizgilerinden ve 3D organoid kültüründen hücre hazırlama yöntemini ve bunların farelerin çekumuna enjekte edilmesini amaçlamaktadır. Burada tarif edilen teknik, enjeksiyon için kullanılan hücre hattının tümör biyolojisine bağlı olarak, alıcı farelerde uzak metastazların ve CTC'lerin tekrarlanabilir formasyonuna yol açarak, oldukça tekdüze tümörlere yol açar. 15

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan hayvan deneyleri bağımsız olarak gözden geçirildi ve bir kurumsal ve resmi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından izin verildi ve FELASA ( Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu ) kurallarına göre gerçekleştirildi. Anestezi ve analjezi ya da gerekirse erken ötanazi dahil olmak üzere acıyı en aza indirmek için olası tüm önlemler alındı.

1. Hücrelerin ve Organoidlerin Hazırlanması

NOT: Her bir enjeksiyon için 100.000 hücre ile 20 μL'lik bir hacim kullanın. Sızıntıyı önlemek ve standart enjeksiyon yapılmasını sağlamak için bazal membran matrisini (BMM) kullanın. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için düzenli aralıklarla hücre hattı kimlik doğrulama analizlerini yapın ( örneğin STR profillemesi yoluyla ).

  1. Taze dokulardan primer hücre süspansiyonlarının hazırlanması
    NOT: Steril koşullar altında daima çalışın. Yeni derhal transferHücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için ameliyathaneden buz üzerinde laboratuara rezeke edilen doku gereklidir.
    Hastanın refahı ve optimal tedavisi her zaman öncelik olmalıdır. Bu nedenle, araştırma için doku numuneleri, sonraki patolojik inceleme ve rezeke edilen tümörün evrelemesine müdahale etmeyecek bir şekilde elde edilmelidir. Çoğu durumda, patolojik tanıya müdahale edilmemesi için, eğitimli bir patolog tarafından elde edilen araştırma numunelerinin olması mantıklıdır.
    1. Rezeke edilen örneğin (ideal olarak ~ 1 cm 3 ) steril çıkarılmasından hemen sonra, doku örneğini, önceden 20-30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 50 mL tüp içine yerleştirin. Tüpü buz üzerinde saklayın ve derhal laboratuara nakledin.
    2. Doku bir Petri kabına koyun ve kalan kanları çıkarmak için iki kez PBS ile yıkayın.
    3. Dokuyu küçük parçalar halinde (~ 2-4 mm) bir sca ile kesinLpel ( örneğin # 20 veya # 36 bıçakla).
    4. Tümör dokusunu tek hücreli bir süspansiyona daha da ayırmak için ayrıştırıcıyı üreticinin talimatlarına göre kullanın. Alternatif olarak, enzimatik tümör sindiriminin diğer protokollerini kullanın.
    5. Elde edilen tek hücreli süspansiyonun hücrelerini sayın ( örn. , Bir coulter sayacı veya bir hemocytometer).
    6. Santrifüj (1,500 xg'de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
    7. 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda BMM'deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
  2. Enjeksiyon için hücre hatlarının hazırlanması
    1. Standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) tüm kolorektal kanser hücre çizgilerini büyütün ve ameliyat gününde hazırlayın.
    2. Hücreleri standart hücre kültürü protokollerine göre hasat edin, hücreleri sayın ( örn . Bir coulter sayacı veya hemocytometer'de) ve gerekliliğini hesaplayınEnjekte edilecek hayvan sayısına bağlı olarak tüm enjeksiyonların miktarı.
    3. Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3-5x'i hazırlayın.
    4. Santrifüj (1,500 g'da 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
    5. 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda BMM'deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
  3. Organoit preparasyonu
    NOT: Tüm 3D organoid kültürler, standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) yetiştirilir. Organoid kültürü için ayrıntılı protokoller daha önce yayınlanmıştır. 18 , 19 , 20 Konvansiyonel hücre hatlarına benzer şekilde, enjeksiyon başına 100.000 hücre ile 20 uL BMM hacmi önermekteyiz. Organoidler ameliyat gününde aşağıdaki şekilde hazırlanır:
    1. Aşağıdaki ortamı hazırlayın (aşağıda belirtilenlerGelişmiş DMEM / F12 +% 1 HEPES (1M) +% 1 Glutamin (200 mM) +% 1 Penisilin / Streptomisin.
    2. 15 mL tüpleri 1 mL DMEM / F12 +++ ile önceden doldurun.
    3. Kültür plakasının yüzeyinden organoidleri dikkatlice aspire edin ve 3 ila 5 kuyu içeriğini bir 15 mL tüp içine aktarın.
    4. Organoidleri, genişletilmiş bir cam pipetle aşağı yukarı pipetleyerek dikkatli bir şekilde daha küçük parçalara ayırın.
    5. Tüp 5 mL DMEM / F12 + + + ekleyin, bunu takiben 5 dakika 1000 xg'de santrifüj uygulanır.
    6. Santrifüjden sonra süpernatantı alın, pelleti 600 μL enzimatik ayrışma tamponu içinde tekrar süspansiyon haline getirin ve süspansiyonu bir 6 oyuklu plakalardan birine iyi bir şekilde aktarın.
    7. 1-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra organoidleri çözmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin.
      NOT: Mikroskop ile sindirimi doğrulayın; Tüm hücre kümeleri ayrıştığında tamamlanırD tek hücrelere.
    8. Sindirim işlemini başarıyla tamamladıktan sonra sindirimi durdurmak için 1.4 mL DMEM / F12 +++ ekleyin. Daha sonra sindirilmiş organoidlerin tüm kuyularını 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
    9. Hücreleri sayın ve tüm enjeksiyonlar için gerekli miktarı hesaplayın.
    10. Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3 - 5 katı kadarını hazırlayın
    11. Santrifüj (1,500 xg'de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
    12. BMM'deki hücreleri 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alıp buzda tutun.

2. Ortotopik Fare Modeli

  1. Ameliyat için alıcı hayvanların hazırlanması
    NOT: Alıcılar olarak 6-8 haftalık NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gama, NSG) farelerini kullanın. 21 NSG, olgun B, T ve NK hücrelerinden yoksun en bağışıklığı baskılanmış fareler arasındadır, bunun yanında çoklu bağışıklık sistemi de fazladırtama yaptığı. 21 Onlar güvenilir düşük hücre sayıları enjekte bile tümörleri büyümeye ve uzak metastaz son derece yatkındır. NSG fareleri mükemmel yetiştiricilerdir ve geleneksel spesifik patojen içermeyen (SPF) birimler içerisinde tutulabilirler.
    1. İlk insizyon öncesinde subkutan olarak 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
    2. Genel anestezi için sevofluran'ı% 3-3.5 hacimde kullanın. Parmak çakma refleksi kaybı, yeterli anestezi anlamına gelir.
    3. Korneanın kurutulmasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhemle örtün.
    4. Fareleri küçük bir masanın üzerinde yatay bir konumda tutun.
    5. Karını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin (alternatif olarak kaşıntı kremi kullanılabilir) ve en az 3 kez klorheksidin / iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
    6. Cerrahi alanı steril perdeler ile örtün.
      NOT: Perioperatif antibiyotik kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir.
  2. Orta hat laparotomisi ve çekumun maruziyeti
    1. Alt karın cildinde küçük bir orta hat kesisi (3-5 mm) yapmak için makas kullanın (alternatif olarak kepek kullanılabilir). Forseplerle karın duvar kaslarını kaldırın ve makasla dikkatli bir şekilde kesip karın boşluğunu açın.
    2. Atrofik forseps ile çekumun belirlenmesi ve dikkatli bir şekilde dışa vurulması. Kornere işaret eden karnın üzerindeki çekumun körü kesecek keseğini kafa yuvasına yerleştirin.
    3. Dışa aydınlatıldıktan sonra, çekmeceyi sıcak salin svapları kullanarak nemli tutun.
  3. Ortotopik enjeksiyon, karın kapanması ve postoperatif iyileşme
    1. İntracekal enjeksiyon için, 30 G kanül içeren standart bir 1 mL şırınga kullanın. Bu şırıngayı, bir mikromanipülatöre monte edilen bir mikroenjeksiyon pompasına monte edin.
    2. Çekumatik forseps ile çekumun ucunu dikkatlice tutun ve aşağı doğru vurarak hafifçe pürüzsüz hale getirinD ikinci kez forseps ile sıcak salinle nemlendirildi.
    3. Kanül doğrudan çekumun üzerine yerleştirin.
    4. Görsel kontrol altında binoküler bir cerrahi mikroskop ile aşağıdaki adımları uygulayın.
    5. Çekumun dışarı çekilmiş kısmının her iki ucuna iki atravmatik forseps kullanarak çekumun dikkatli bir şekilde kavranmasını hafifçe gerin ve ardından paralel ve doğrudan yukarıda bulunan kanül üzerine yavaşça çekin. Sızıntıya ve peritoneal yayılıma yol açacağı için tüm bağırsak duvarını perfore etmek (böylece lümen içine hücreleri enjekte etmek) değil, serozayı başlangıçtaki penetrasyonun ötesine perfore etmek için de önemlidir.
      1. Bağırsağı kanüle doğru, bağırsağa doğru götürünüz. Bağırsağı iki forseps arasında tutun ve gerin. Sarsıntıyı azaltmak için cerrahın elleri bir yüzey üzerine oturmalıdır.
    6. Hücreleri seroza enjekte edin (çok ince, şeffaf astar olarak görülüyor.E intramural kan damarları) ve muskularis. Bu nedenle kanül, kan damarlarının üstünde ve yarı saydam zarın altında görsel olarak yerleştirilmelidir.
    7. Kanül bağırsak duvarı içerisindeyken titreme azaltmak için enjeksiyona başlamak için bir ayak anahtarı kullanın.
    8. Kanül yerleştirildikten sonra enjeksiyona başlayın. Pompanın kontrol ünitesinde 1 μL / s ayarla sonuçlanan 20 saniye süreyle kullanın.
      NOT: Hasarlı bir kan damarına veya yakınına yapılan enjeksiyon doğrudan intravasküler yayılım ve uzak metastaz yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
    9. Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, kanülü geriye doğru çekerek dikkatlice çıkarın.
    10. Sızdırılmış hücreleri kirletmek ve böylece suni peritoneal yayılımı önlemek için çekumun altına kuru bir çubuk yerleştirin ve ardından çekumun damıtılmış suyla iyice durulayın.
  4. Karın kapanması ve postoperatif iyileşme
    1. R sonraİçeri çekerken, çekumu hafifçe karın boşluğuna geri verin.
    2. Karın duvarını 6-0 hızlı emilebilen koşu sütürleri ile kapatın.
    3. Cerrahi yara klipsleri ile cildi kapatın.
    4. Fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C'ye ayarlanmış ısıtma haritasına yerleştirin.
    5. Farelerin postoperatif koşullarını 48 saat boyunca yakından izleyin. Sıkıntı yaşarsanız, 12 saatte bir 0.05 mg / kg buprenorfin ile tedavi edin.
    6. Fareler, tümör gelişimine bağlı olarak sıkıntı işaretleri için günde en az bir kez izleyin.

3. Tüm Kan Örneklerinden Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

NOT: Anestezi uygulanmış farelerde transkutanöz kardiyak ponksiyon ile kan alın ve bunu ötanazi izlemelisin. İdeal olarak, 100 μL antikoagülan (Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) veya heparin) ile önceden doldurulmuş bir şırınga içine 1.000 μL kan çekilir. Bir anti-insan-EpCAM (epitel hücre adezyonuMolekül) antikorunu belirtir. Fare modelinde insan epitelyal hücre hatları kullanılıyorsa, bu çok iyi çalışır. Diğer aletler için farklı antikorlar gerekebilir.

  1. CTC zenginleştirmesi:
    1. 15 mL'lik tüpleri 5 mL yoğunluk dereceli ortam ile önceden doldurun ve dikkatli bir şekilde 15 mL tüp içine kan aktarın.
    2. Santrifüjleyin (frensiz 300 xg'de 30 dakika) ve dikkatli bir şekilde üst üst fazı çıkarın.
    3. Geri kalanını yeni bir 15 mL tüp içine boşaltın ve santrifüjleyin (15 dakika, frenli 300 xg).
    4. Mononükleer hücreleri içeren ara fazı kurtarın (gerisini atın) ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
    5. Pelet 200 uL PBS /% 1 EDTA içinde süspansiyon haline getirin ve 4 μL EpCAM antikoru ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
  2. Eleme ve toplama
    1. Aşağıdaki tamponu hazırlayın (aşağıda toplama tamponu olarak anılır): PBS +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / STreptomisin (% 1) +% 0.8 EDTA.
    2. 6 cm'lik steril bir Petri kabında (akışkanın çanakta dağılmasını önleyen) ~ 1 cm'lik bir daire çizmek için bir PAP kalemi kullanın ve bu daire içine tampon toplamanın pipet 700 μL'ini kullanın.
    3. Daire içerisinde 700 mcL toplama tamponuna 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroskop ile hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa, numuneyi farklı yemeklere bölün.
    4. Hücrelerin çökelmesini bekleyin (~ 5 dak).
    5. Lekeli (= EpCAM-pozitif) hücreler için hücre süspansiyonunun damlasını tarayın.
    6. Bir hücre bulundu sonra, mikromanipülatör ile hücreyi seçin ve amaçlanan aşağı akım analizine ( örn. , RNA ekstraksiyon tamponu veya kültür ortamı) bağlı olarak 50 μL tampona koyun.
    7. İstenen aşağı akım analizlerine bağlı olarak, EpCAM negatif hücreleri ve / veya ortamı negatif kontroller olarak izole edin.
    8. Aşağı akım analizleri ile devam edin ( örn. , Hücre kültürü, PCR).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu modelde başarılı ve tekrarlanabilir nesil kolorektal tümörlerin oluşması, hücrelerin dökülmeden veya sızıntı olmadan doğru şekilde enjekte edilmesine bağlıdır. Bu elde edilirse, bu model son derece güvenilirdir ve nadiren yapay periton yayılımı ile sonuçlanır. Tümörlerin büyüme kinetiği ve yayılma şekilleri, kullanılan organoidlerin ve hücrelerin biyolojisine bağlıdır. HCT116 hücreleri güvenilir, bu modelde, karaciğere metastaz 15 birlikte, SW620 hücre formu or...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deri altındaki fare modellerinde klinik olarak kanıtlanmış etkinliklerine rağmen yeni bileşiklerin büyük çoğunluğu klinik araştırmalarda başarısız olur ve kliniğe asla ulaşmazlar. 11, deri altı fare modellerinde bu bariz yetmezliği doğru tümörlerin biyoloji ve büyüme kalıpları doğrudan orijinal organ, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan göre ortotopik fare modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır simüle edilmiştir.

Ortotopik fare modelleri, solid tümörlerin biyolojis...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (We 3548 / 4-1) ve Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü Ortamı ve Bileşenleri
Gelişmiş DMEM F12Canlandırıcı12634010DMEM/ F12 +++ orta
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ orta
Glutamax-I Takviyesi (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ orta
Penisil/ Streptomisin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ orta
DMEMLife Technologies GmbH619650262D hücre hatlarının temel ortamı (DMEM/%10 FCS)
Fetal Buzağı Serumu (FCS)BIOCHROM AGS 01152D hücre hatlarının temel ortamı (DMEM/%10 FCS)
TrypLE Express enzimatik ayrışma tamponuLife Technologies GmbH12604021
Matrigel bazal membran matrisi (BMM, fenol kırmızısı içermez)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu HaliLife Technologies GmbH14190169
Tripsin-EDTA (%0,25, Fenol-Kırmızı)Life Technologies GmbH25200072
6/48 kuyulu kapaklı plakalarCORNING3516/3548
hücre kültürü şişesi 75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
hücre kültürü şişesi 150 cm², 600 mLCorning B.V. Yaşam Bilimleri355001
Eppendorf tüpleri 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL santrifüj tüpleriGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Sayma Slaytları (TC20 Sayma Makinesi için)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pasteur pipetleri (cam, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251bir bunsen brülörü kullanılarak ince bir şekilde çekilir
GentleMACS AyrıştırıcıMiltenyi Primer130-093-235Primer tümör dokusu hazırlığı için
MACSmix Tüp DöndürücüMiltenyi Biotec130-090-753
gentMACS C TüpleriPrimer tümör dokusu hazırlığı içinMiltenyi Biotec130-093-237
Primer tümör dokusu hazırlığı
Falcon 70 ve mikro; primer tümör dokusu hazırlığı içinCorning BV Yaşam Bilimleri352350
Name< / strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Yorumlar< / strong
>Cerrahi Ekipman< / strong>
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co.KG-Medical
oxygenAir Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- oftalmik merhemBayer Vital GmbH10047757
Normal salin% 0.9 (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
1 mL Şırınga (ölü hacim olmadan) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G enjeksiyon iğnesiBECTON DICKINSON304000
selüloz çubuklarLohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson ForsepsFST - Güzel Bilim Araçları11018-12
İris Makas - ToughCutFST - Güzel Bilim Araçları14058-11
Olsen-Hegar İğne TutucuFST - Güzel Bilim Araçları12002-12
AutoClip KitiFST - Güzel Bilim Araçları12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (cerrahi sütür)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Masa Üstü Araştırma Anestezi Makinesi, O2 Yıkama ve Sevofluran Buharlaştırıcı ileParkland ScientificV3000PS/PK
Micro4 Denetleyicili UltraMicro PompaWorld Precision InstrumentsYüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon içinUMP3-4
SYS-Micro4 Kontrol Cihazı için Ayak PedalıPrecision Instruments15867Yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman
Üç eksenli Manuel MikromanipülatörWorld Precision InstrumentsM325yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman
Mikromanipülatör için Manyetik StandWorld Precision InstrumentsYüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon içinM10 ekipmanı M10
Manyetik Stand için Çelik Taban PlakasıDünya Hassas Aletler5479yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman
Sıcak Plaka 062Labotect13854
Isis - Saç tıraş makinesiAESCULAP - Braun-Binoküler
Cerrahi MikroskopParkland ScientificVS-2Z
NameCompanyKatalog NumarasıComments
CTC izolasyonu
EDTARoth8040.1
Yoğunluk gradyanı orta – FicollKök Hücre - Lenforep7801
Alexa Fluor 488 anti-insan CD326 (EpCAM) Antikor klonu 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-fare CD326 (EpCAM) Antikor klonu G8.8BioLegend118210
Petri Kabı, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Floresan Hücre Kültürü MikroskobuLeica
Transferman 4r MikromanipülatörEppendorf
CellTram AirEppendorfaspirasyon pompası mikromanipülatöre bağlı
Dmz Üniversal Mikroelektrot ÇektirmeDagan Corporationtek hücreli aspirasyon için mikro kılcal damarların üretimi için gerekli
Prizma Cam Kılcal DamarlarDagan Corporation
PAP kalemiAbcamab2601
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluLife Technologies GmbH14190169toplama tamponu
Fetal Buzağı Serumu (FCS)BIOCHROM AGS 0115toplama tamponu
Penisilin/Streptomisin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122toplama tamponu
EDTARoth8040.1toplama
tamponuNameCompanyKatalog NumarasıComments
İmmünohistokimya
Saflaştırılmış anti-insan CD326 (EpCAM) antikor klonu 9C4BioLegend324201EpCAM immünohistokimyası (bkz., şekil 2C)
HRP tavşan anti-fare IgGAbcamab97046EpCAM immünohistokimyası (cf, şekil 2C)
tümör dokusu hazırlığı için Biotec için İnsan Tümörü Dissosiyasyon Kiti Miltenyi Biotec 130-095-929 m Hücre Süzgeci GmbH-Buprenorfin ekipmanı World

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T m r H cresi EnjeksiyonuSekal EnjeksiyonYo unluk Gradyan Santrif jlemeCTC zolasyonuCerrahi TeknikT m r Metastaz

İlgili makaleler