Yöntem makalesi

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

DOI:

10.3791/55464

⸱

17 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğası gereği düzensiz proteinler (IDP) dolayı uzun stabil, ikincil yapı elemanlarının eksikliğinden yapısal biyologlar için bir meydan okuma olmuştur. Hidrojen-Döteryum hızlı zaman ölçeklerinde ölçülen değişimi (HDX) yerel toplulukları geçici konformerlerin karakterizasyonu için izin kısaca doldurulur yapılar ve hidrojen bağlayıcı ağları tespit etmek için özel olarak düzenlenmiştir. kütle spektrometresi için HDX Kenetlendirilmesi yüksek hassasiyet, düşük numune tüketimi ve protein boyutu üzerinde hiçbir kısıtlama dahil olmak üzere birçok önemli avantajlar sunmaktadır. Bu teknik milisaniye zaman ölçeğindeki HDX etiketleme kez izlemek için yeteneği dahil olmak üzere, son birkaç on yıl içinde büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, bir asidik proteaz mikroreaktör muhafaza eden bir mikro-akışkan bir platform üzerine HDX akışını içeren, biz peptid düzeyinde dinamik özellikleri lokalize edebiliyoruz. Bu çalışmada, Zaman Çözümlemeli Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Tresi-MS) HDX wa bağlanmıştau proteininin kalıntı yapısının detaylı bir resmini, hem de hiperfosforilasyon üzerine indüklenen konformasyonel vardiya sağlamak için kullanılır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl içinde, önemli gelişmeler, protein yapısı ve dinamikleri 1, 2, 3, 4 ölçmek için tasarlanmış analitik tekniklerin geliştirilmesi yapılmıştır. X-ışını kristalografisi, protein yapısını belirlemek için başlıca aracı olduğu birlikte, proteinin yüksek konsantrasyonlar gerekmedikçe ve kapsamlı optimizasyon kırılma kalitesi kristalleri üretmek için gereklidir. Bu gibi membran bağlantılı ve doğal olarak düzensiz proteinler olarak kristalize zor olan proteinler, klasik hidrojen döteryum değişimi (HDX) NMR 5 ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Kullanmadan önce tüm ilgili güvenlik bilgi formuna (MSDS) başvurun. poli (metil metakrilat), lazer ablasyonunun (PMMA) tarafından üretilen dumanlar toksik olabilir. lazer gravür çalışan bir havalandırma sistemine bağlı olduğundan emin olun. (Gözlük, yüz maskesi, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolon galoş) mühendislik kontrolleri (çeker ocak, kavuz konteyner) ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı dahil mikroakışkan cihaz bina tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın. Bu mümkün olduğunda, analiz sırasında müdahale kirletici maddelerin azaltılması için ACS derecesi ya da daha yüksek her bir varlık ile, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) seviye ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doğal ve fosfo-tau sindirim profilleri, sırasıyla 77.1 ve 71.7% sekans kapsama hasıl benzerdi. Her bir peptidin Döteryum alım değerleri, bir in-house geliştirilen FORTRAN yazılımı kullanılarak üretilen teorik dağılımların ile gözlenen izotopik dağılımları uydurulması ile belirlendi. En uygun dağılımlar ilişkili döteryum alım değerleri ile birlikte (Şekil 3a) 'da gösterilmiştir. Alım kinetik profiller daha sonra oluşturulacak ve de tek bir üstel ifadelerle tarif edilmişti.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bu proteinlerin son derece ayrıntılı yapılar sağladığı için, X-ışını kristalografisi ve NMR gibi yapısal biyoloji yöntemleri avantajlı olmakla birlikte, bu resimler genellikle statiktir. Geçici türler ve zayıf yapılı alanların karakterizasyonu Bu geleneksel yöntemlerle çalışılan zaman zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu tip sistemlerde dinamik analizler elde etmek için hızlı zaman ölçeklerinde çalışmak önemlidir. Biz başarıyla lokalize peptidik düzeyde iyi çalışılmış IDP içinde oluşan yapısal değişikliklere iliş.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Markus Zweckstetter'e, Dr. Adnan Sljoka tarafından sağlanan katkıda bulunan analiz araçlarıyla NMR çalışmasından tahmin edilen 'yerli' tau topluluğu için pdb koordinat dosyasını sağladığı için minnettarız. Bu çalışmanın finansmanı, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ENGAGE Hibe programı tarafından sağlandı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poli (metil metakrilat) veya PMMAProfesyonel PlastiklerSACR.250CCP8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm
Sigortalı Silika Cam KılcalPolymicro Teknolojileri106815-0018ID: 75 ve mikro; m, OD: 150 ve mikro; m
Metal Kılcal DamarlarMcMaster-Carr28 ga & ndash; 89875K97
30 ga & nbsp; - 89875K99
Florlu Etilen Propilen (FEP) BoruIDEX1477
1548		ID: 0.007 ", OD: 1/16"
Kimlik Numarası: 0.020", OD: 1/16"
Standart Polimer Boru KesiciIDEXA-327 OD boru
Mikro Statik Karıştırma TeeIDEXM-5401/16 "için OD boru
veya
Paslanmaz Çelik Tee, 0.25 & mm DelikValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1C1/16" için
1/16 "için OD boru PEEK Tee OD BoruIDEXP-727
10-32 Dişi - Dişi LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Çift Kanatlı SomunIDEXF-300
Yüksük 1/16 " OD BoruIDEXF-142
100 Serisi Döner AletDremelF013010001
Kesme DiskleriJobmate1/64 "kalınlık
Stereomaster Dijital Zoom MikroskopFisher Scientific12-563-411
HavyaMastercraft58-6301-2
VersaLaserÜniversal Lazer
ŞırıngalarHamilton81220500  &mikro; L kapasiteli
Şırınga PompalarıHarvard Aparatı70-4501
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü > Reaktifler < / güçlü >
NHS ile Aktive Edilen AgarozFisher Scientific26196
Domuz Mide Mukozasından PepsinSigma-AldrichP6887-250MG
Döteryum OksitSigma-Aldrich151882-10X0.6ML
Asetik AsitSigma-Aldrich695092-100ML
HPLC Sınıfı SuFisher ScientificW5-4
Amonyum AsetatSigma-AldrichA7330-500G
Sodyum FosfatFisher ScientificS369-500
Sodyum KlorürFisher ScientificS671-3
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Software/Online Tools
CorelDraw X3Corel
Moleküler Ağırlık HesaplayıcıSürüm 6.49Açık Kaynak MS Aracı
mMassSürüm 5.5.0Açık Kaynak MS Aracı
ExPASy FindPeptİsviçre Biyoinformatik
SigmaPlotSystat YazılımSürümü 11.0
PyMOLSchrö dingerVersiyon 1.5.0.4
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Instruments
QStar Elite Hibrit Q-TOF Kütle SpektrometresiAB SCIEX
1/16" ve 1/8" için Enstitüsü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. B....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Yap AnaliziDo as Gere i Bozulmu ProteinlerTau Proteini Dinami iPeptit D zeyinde HaritalamaMilisaniye Zaman l e iMikroak kan PlatformKonformasyonel De i imler

İlgili makaleler