Yöntem makalesi

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

DOI:

10.3791/55498

⸱

1 Nisan 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu protein diğerleriyle birlikte hareket eder; bu nedenle, biyolojik süreçleri tam olarak anlamak için bu fonksiyonel birimleri karakterize etmek çok önemlidir. Kütle spektrometresine (AP-MS) bağlı afinite saflaştırması, protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, geleneksel AP-MS çalışmaları protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlar, ancak organizasyonel bilgi kaybolur. Bu sorunu ele almak için, kütle spektrometresi ile karakterizasyonlarından önce afinite ile saflaştırılmış protein komplekslerini çözerek, bir proteinin dahil olabileceği farklı fonksiyonel düzenekleri çözmek için bir strateji geliştirdik. Bir epitop etiketi ve rekabetçi elüsyon kullanılarak bir yem proteininin afinite saflaştırılması yoluyla izole edilen protein kompleksleri, mavi doğal elektroforez yoluyla ayrılır. Kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak korelasyon profili oluşturma yoluyla protein göç profillerinin karşılaştırılması, etkileşen proteinlerin farklı moleküler varlıklara atanmasına izin verir. Bu yöntem, jel filtrasyonu gibi geleneksel kromatografik tekniklerle çözülemeyebilecek yakın moleküler ağırlıklara sahip protein komplekslerini çözebilir. Konvansiyonel AP-GELC-MS/MS'den biraz daha fazla çalışma ile, bu stratejinin birçok durumda protein etkileşimlerini tanımlamak için eş zamanlı olarak protein kompleksi topolojik bilgisi elde etmek için yeterli olabileceğini gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hücrelerde, pek çok protein geçici protein-protein etkileşimleri yoluyla veya stabil protein düzeneklerinin oluşturulması suretiyle işlevleri yerine getirir. Protein etkileşimleri belirlemek tamamen anlaşılması hücresel süreçleri için çok önemlidir. kütle spektrometrisi (AP-MS) ile kombinasyon halinde afinite saflaştırma doğal protein etkileşimlerini tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Son on yılda elde enstrüman yetenekleri önemli gelişmeler bu yaklaşımın son derece güçlü hale getirmiştir. AP-MS deneyler tarafından tespit etkileşimleri yem ve onlardan beslenen arasındaki doğrudan ve dolaylı dernekler bir karışımını içermektedir dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, genellikle proteinler farklı biyolojik rollere sahip olabilir aynı hücresel kapsamında çeşitli kompleksler yer alır ve bu nedenle, AP-MS ile tespit edilir uygulayıcıların farklı protein montajlar veya işlevsel birimlerin bir karışımı temsil edebilir. Türetmek mümkün değildirörneğin topolojik bilgi, basit AP-MS deneyi ile oluşturulan proteinlerin mono- boyutlu listelerden önsel. Ancak, bu teknik, bu derlemeler gidermek için, bir ya da daha fazla yöntem ile birleştirerek protein kompleksleri mimarisini tanımlamak için daha fazla kullanılabilir.

AP-MS yoluyla tespit protein etkileşimleri topoloji çözmek amacıyla, çeşitli stratejiler uygulanmıştır. Bir yaklaşım, yemler 1 ile deneyler önceki turunda tanımlanan avlar iteratif AP-MS deneyler sağlamaktır. çok bilgilendirici olsa da, bu hem deneysel hem de analitik oldukça emek yoğun bir iştir. Kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde protein çapraz bağlanma artan protein kompleksleri, 2, 3, 4, 5 topolojik bilgi elde etmek için kullanılıyor. Ancak, computatioçapraz bağlı peptitlerin nihai analiz yine zor bir görev kalır ve bu nedenle, iş akışında darboğazdır. MS-yarılabilir çapraz-bağlama maddeleri gelişi proteinleri 6, 7 etkileşimde yakın amino asit artıklarının eşleme kolaylaştırmalıdır. Başka bir alternatif önce ortogonal ayırma teknikleri 8, 9 ile afinite saflaştırmasını birleştirmektir. Jel filtrasyonu ya da iyon değişimi ya da sukroz gradyanlı fraksiyonasyonu ile kromatografik ayırma yakın zamanda by-pass karmaşık izolasyon aşaması 10, 11, 12, 13, bir sistem genelinde düzeyde multiprotein komplekslerini tarif kantitatif kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), yaygın olarak uygulanmıştırdoğal protein etkileşimleri, mitokondriyal membran protein kompleksleri 14 kapsayan, genel olarak bu araştırmak. Bu ayırma tekniği de son zamanlarda mitokondriyal kompleksleri 15 üzerinde sadece etiket serbest protein miktarının ve korelasyon profili ile kombinasyon halinde kullanılan 16, 17, aynı zamanda, 19, bütün hücreler 18 diğer protein kompleksleri çözülmesi için. Biz daha sonra doğal fraksiyonasyon yaklaşımları ve kantitatif MS ile afinite saflaştırma kombinasyonu belirli bir protein ihtiva eden birçok protein tertibatları çözmek için yararlı bir strateji sağlamalıdır varsayıldı.

Burada kantitatif kütle sp ardından izole komplekslerinin mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi ile genel epitop bazlı afinite saflaştırmasını eden bir yöntem, tarifectrometry ve protein korelasyon profil, bir protein dahil olabilir birden çok derleme çözmek için. Bu, bir epitop ucuna birleştirilen bir ilgi, bir protein, fizyolojik bolluk yakın elde etmek ve etkili bir yerli sağlamak için endojen mahalden türetilmektedir ifade edilir, fare embriyonik kök hücreleri kullanır karmaşık izolasyonu. Bu yaklaşım, bir protein, geleneksel GELC-MS 20 den daha fazla çalışma gerektiren iken, aralarındaki korelasyon profillerine göre farklı takımlar halinde çözdürerek, yürütmektedir birden çok etkileşimi unravels.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FLAG Affinity Saflaştırma tarafından Yerli Protein Kompleksleri 1. İzolasyonu

  1. hazırlıklar
    1. Hücre peleti çözündürülmesi için bir 37 ° C su banyosu ayarlayın.
    2. 4 ° C'ye kadar bir mikro santrifüj soğutun.
    3. farklı boyutlarda çok sayıda mikro santrifüj tüpleri (1.5 mL, 15 mL) ve buz içinde bir homojenleştirici yerleştirin.
    4. liziz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCI,% 0.1 Nonidet P-40, 1 mM EDTA) içinde 10 ml hazırlamak ve buz içinde tutmak. Hemen önce tampon kullanarak, 10 1 M DTT uL EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri ezilmiş tablet ekleyin.
  2. Antikor-bağlı taneciklerin hazırlanması
    NOT: antikor kaplı boncuklar önceden bir hafta kadar hazırlanmış ve gerektiği kadar buzdolabında saklanabilir. Çoğu tür daha yüksek bir afiniteye sahip olan proteini, tavşan IgG haricinde, alt tipleri immünoglobulin için Protein G, Protein A daha yüksek bir afiniteye sahiptir.
    1. 50 uL protein G-kaplı manyetik boncuklar yıkayın: Transfer 50956., bir mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamurunun L tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 0.5 ml boncuk tekrar.
    2. tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 40 uL boncuk tekrar. 10 ug (1 mg, 10 uL / ​​ml stok çözelti) M2 anti FLAG antikoru ilave edin. Oda sıcaklığında 20 dakika dönme kuluçkalayın.
    3. tüp tarafında boncuk, sıvının toplanması ve çıkarmak için mıknatıs tüp yerleştirin. PBS-% 0.01 Tween-20, 0.5 mL boncuk yıkayın.
    4. tanelerine antikorun çapraz bağlama için, 0.2 M trietanolamin, pH 8.2, 1 mL ile iki kez boncuk yıkayın. Daha sonra, (kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır DMP çözelti) 0.2 M trietanolamin, pH 8.2, 20 mM DMP (dimetil pimelimidat) 1 mL içinde yeniden süspanse boncuklar. 30 dakika için oda sıcaklığında dönme ile inkübe edin.
      5. mıknatıs tüp yerleştirin. Süpernatantı ve 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 0.5 mL içinde yeniden süspanse boncuklar. 15 dakika oda sıcaklığında dönme ile inkübe edin.
  3. PBS-% 0.1 Tween-20, 0.5 mL boncuk 3 kez yıkayın. ihtiyaç duyulana dek geçen yıkama boncuk bırakın.
  • FLAG-bazlı afinite saflaştırma
    NOT: Uzun bir süre tampon olmadan boncuk bırakarak değil dikkatli olun. Tüm tamponlar ve tüpler her zaman buz tutulmalıdır. Aşağıdaki protokol, bir FLAG-etiketli protein 20 endojen seviyelerini sentezleyen 2-5 8 x 10 hücrelerden protein komplekslerinin saflaştırılması (10-20 mg protein lizatı) için optimize edilmiştir.
    1. Bu eriyene kadar 37 ° C'de bir su banyosu içerisinde hücre pelletini çözülme. Banyonun boruyu almak pelet tamamen eriyinceye kadar yavaşça girdap ve hemen buz üzerine, hücre süspansiyonunu içeren tüpün yerleştirin.
    2. buz sıcaklığında lizis tamponu 5 mL ekleyinHücre süspansiyonu ve girdap (DTT ve proteaz inhibitörleri içeren) karıştırın. 10 dakika boyunca buz içinde inkübe edin.
    3. Soğuk Dounce homojenizatör lizat aktarın. (Hiçbir fark edilebilir viskozite kalmayıncaya kadar) sıkı tokmak kullanılarak 20-30 vuruş ile Lyse. Soğuk mikrosantrifüj tüplerine Homojenat aktarın.
    4. 4 ° C'de 15 dakika 18,000 x g'de santrifüjleyin.
    5. Temiz soğuk tüpe temizlenir lizat aktarın. arkasında lizatının 50 mcL bırakın. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi ve saflaşmasını izlemek için lizat 35 uL kısım alın.
    6. Tanelerden PBS-% 0.1 Tween-20 çıkarın. lizat 1 mL boncuk tekrar ve lizat kalanı ile karıştırın. 1-2 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir çark üzerinde inkübe karışımı.
    7. mıknatıslı tüpün tarafında boncuk toplayın. süpernatan, bir 30 uL aliko toplayın ve süpernatant geri kalan atın. IPP150 tamponu (10 mM Tris-HCI pH 8, 15 0.5 mL boncuk tekrar0 mM NaCI, 1 mM EDTA,% 0.1 NP-40), 4-6 kez pipetleme. 1.5 ml soğuk tüpe aktarın.
    8. IPP150 tampon iki kez daha 0.5 mL yıkama tekrarlayın.
    9. Yıkama FLAG doğal elüsyon tamponu (20 mM Bis-Tris, pH 7, 20 mM NaCI,% 0.02 Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminokaproik asit) 0.5 mL ile üç kez boncuklar. Son yıkamadan ile, yeni bir soğuk tüpe boncuk aktarın. İyice tamponu çıkarın.
    10. doğal elüsyon tamponu içinde 200 ug / ml 3x FLAG peptit 100 uL boncuk tekrar. yavaşça döndürülerek 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    11. mıknatıslı boncuklar toplayın ve soğuk yeni bir tüpe süpernatant aktarın.
    12. Tekrarlayın iki kez 1.3.10-1.3.11 adımları tekrarlayın. Tüm taşınan ürünler Havuz.
    13. 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüj ile bir santrifüjlü filtre ünitesinde (10 kDa nominal moleküler ağırlık limitli kesme PES) 'de 25 uL eluatın konsantre edilir. yeni bir soğuk tüpe konsantre edildi eluatın aktarın ve% 50 glyce eklemek% 5 oranında bir nihai konsantrasyon için rolü. Gerekirse konsantre eluat, gece boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

    • 2. Mavi Yerli SAYFA

    1. hazırlıklar
      1. 1x doğal PAGE Anot Tamponu, 1 x doğal PAGE Lacivert Katot Tamponu ve 1 x doğal PAGE Açık Mavi Katot Tampon 1 L hazırlayın.
      2. Bir ön döküm% 3-12 doğal PAGE jel tarak çıkarın ve 1x doğal PAGE Lacivert Katot Tamponu ile kuyular iki kere yıkayın. 1x yerli SAYFA Lacivert Katot Tampon ile kuyu doldurun. koşu tankında jel kurun ama katot (iç) odacık için Lacivert Katot Tampon eklemeyin.
    2. Elektroforetik koşmak
      1. örnek hazırlayın: eluat sırasıyla nihai 1x konsantrasyonları ve% 0.005 uygun 4x doğal numune yükleme tamponunun hacmi ile% 0.5 arasında, G-250 örnek bir katkı konsantre edildi 25 uL.
      2. betwee boş kuyu ayrılan numune ve doğal moleküler ağırlık belirteçleri yükOnları nı. Tüm boş kuyu 1x doğal numune yükleme tamponunun yük 10-20 uL.
      3. örnekleri rahatsız etmemek için dikkatle 1x doğal PAGE Lacivert Katot tamponunun 200 mL 'si ile katot (iç) bölmesini doldurun. 1x doğal PAGE Anot tamponu 550 mL 'si ile anot (dış) bölmesini doldurun.
      4. 30 dakika süre ile 150 V'de jel çalıştırın. , Koşmak Dur bir serolojik pipet ile Lacivert Katot Tampon kaldırmak ve 1x Açık Mavi Katot Tampon ile değiştirin. 60 dakika boyunca koşmak devam edin. Jel C oda sıcaklığında ya da 4 ° 'de çalıştırılabilir; Sıcaklık protein kompleksi yapısı üzerinde bir etkiye sahip olabilir.
    3. Jel boyama
      1. Jel kasetini açın ve kaset plakalardan birini atın. Jel, diğer kaset plakasına bağlı kalır. jel kapsayacak ve hafifçe çalkalanarak 30 dakika inkübe kadar sabitleyici çözeltisi (% 40 metanol,% 2 asetik asit) içeren bir tepsi veya kap içine jel aktarın.
      2. fiksatif solut kaldıriyon ve jel karşılamak için yeterli su ekleyin. Jel ileride kullanmak üzere taranabilir.

    3. kütle spektrometri analizi

    Not: Numunelerin temizliğini sağlamak için mümkünse takip eden tüm aşamalar bir laminar akış içinde yapılmalıdır. Bütün çözeltiler, HPLC dereceli su ile hazırlanmalıdır. analizini gerçekleştirecektir Kütle Spektrometresi laboratuarı ile bu protokolü tartışın.

    1. hazırlıklar
      1. atıkları toplamak için başka 96-plaka üstünde konik dipli, 96 gözlü plaka koyun. Pierce, bir 21 G iğne ile konik tabanlı 96-kuyulu plakanın kuyularına alt.
      2. delikli 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına yıkayın.
        1. delikli plakanın kuyularına% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 200 uL ekleyin. 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı içinde levha istifi inkübe edin.
        2. 1 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin böylece sıvı atık toplama plakası deliklerden geçer. w atınaste sıvı.
        3. Adımları tekrarlayın 3.1.2.1-3.1.2.2 iki kere daha.
        4. 50 mM amonyum bikarbonat, 150 uL ile delinmiş 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına doldurun (taze yapılmış).
      3. Bir santrifüj filtrasyon 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına yıkayın.
        1. artığı toplamak için santrifüj filtrasyon plakasının altında, normal bir 96-çukurlu plaka koyun. santrifüj filtrasyon plakasının her oyuğuna% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 200 uL ekleyin.
        2. 1 dakika için 200 x g'de levha istifini santrifüjleyin. atıkları atın.
        3. Adımları tekrarlayın 3.1.3.1-3.1.3.2 iki kere daha.
    2. Jel eksizyonu ve jel sindirim
      Not: jel eksize iken, tespit ve Protein standartlarının her hizalanmış jel dilimi not edin. protein standartları tüm jel dilimleri yaklaşık moleküler ağırlıkları tahmin etmek için de kullanılabilir.
      1. temiz bir yüzeye cam levha jel yerleştirin. şerit ihtiva dilimle48 özdeş dilimlere (1.5 mm x 5 mm) içine örnek ing. (Jel üstünde son beş dilim hariç) 2-3 küçük parçalar halinde, her dilim kesme ve delikli bir kuyuda her dilim ardışık olarak yerleştirin ve 96 oyuklu plaka yıkanır.
      2. Her bir oyuğa, asetonitril 50 uL ekleyin. 30-60 dakika boyunca çalkalayarak plaka inkübe edin. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın.
      3. Her bir oyuğa, 50 mM amonyum bikarbonat içinde 2 mM TCEP, 200 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallanarak inkübasyona bırakılır. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın.
      4. Her bir oyuğa, 50 mM amonyum bikarbonat içinde iyodoasetamid 4 mM 200 uL ekleyin. Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika çalkalanarak inkübe plakası. Adım 3.1.2.2 gibi santrifüjleme ile sıvı çıkarın.
      5. 50 mM amonyum bikarbonat, 150 uL artı asetonitril 50 uL ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalama ile plaka inkübe edin. Bu yıkama adımı tekrar birtüm mavi renk jel parçalarından çıkarılır edinceye kadar birçok kez s.
      6. Saf asetonitril, 200 uL eklenerek jel parçaları kurutmak ve jel parçaları beyaz opak kadar 20 dakika oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edilir. asetonitril çıkarın.
      7. Her bir oyuğa, soğuk 50 mM amonyum bikarbonat içinde 0.001 mg / tripsin ml (dizileme gradlı) bir 150 uL ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak inkübe plakası. 1 saat sonra, jel parçaları sıvı ile örtülü olduğunu kontrol edin; Bu durumda değilse, 50 mM amonyum bikarbonat başka 50-100 uL ekleyin. 37 ° C'de 2 saat sonra, bir gece boyunca 25 ° C'de sindirim devam edin.
      8. plakaların doğru oryantasyonunu sağlamak, jel içeren plaka altında temiz konik alt plaka yerleştirin. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile peptidleri içeren sıvının toplayın.
      9. santrifüjlü bir buharlaştırıcıda peptitler içeren plaka koyun ve t yerine getirirken sıvının buharlaştırılmasıBir sonraki adımda,.
      10. Jel parçaları,% 50 asetonitril-% 0.25 formik asit, 150 uL ekleyin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalayarak kuluçkalayın.
      11. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile adım 3.2.9 kısmen kurutulmuş plaka içine sıvı toplamak. Bir sonraki adım yerine getirirken peptitler içeren plaka buharlaştırılması devam edin.
      12. Tekrarlayın 3.2.10-3.2.11 adımları tekrarlayın.
      13. Jel parçaları içeren bir plakanın her bir oyuğuna, saf asetonitril 200 uL ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak kuluçkalayın.
      14. 1 dakika için 200 x g'de santrifüj ile peptitler içeren plaka sıvı toplamak.
      15. tüm oyuklarda asetonitril nihai konsantrasyon% 55 üzerinde olduğundan emin olun. Gerekirse, ekstra saf asetonitril ekleyin.
      16. yıkandı, santrifüj, filtrasyon plağına peptit solüsyonları aktarın. peptidleri toplamak için bunun altında temiz bir konik alt plaka koyun. 1 dakika için 200 x g'de levha istifini santrifüjleyin.
      17. evaporçukurlar tamamen kuru hale gelene kadar konik alt plaka içindeki sıvıyı yedi. plaka bir silikon kapak ile kapatıldı ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
      18. kuvvetle 15 dakika boyunca çalkalama ile% 0.5 formik asit 32 uL peptidler yeniden çözülür. 400 mM amonyum bikarbonat 8 uL eklenir ve güçlü bir 15 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. 1 dakika için 200 x g'de plaka santrifüjleyin. bir silikon kapak ile kapatılır ve kütle spektrometrisi analize kadar -20 ° C 'de plaka saklayın.
    3. Kütle spektrometrisi
      NOT: av tüfeği proteomik uyumlu yöntemler kullanılarak yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde peptidleri analiz edin. Veri bağımlı alıcı Bu tür bir analiz için en yaygın olarak kullanılan MS kurulumu LC-tandem ve arka plan gürültü üzerine gereksiz sıralama ve aday seçimi en aza indirerek, etkili peptit tanımlama için optimize edilmelidir. Birinci aşama kütle analizi tarama (MS1) kütle spektrumları, profil modunda kaydedilmelidir. Bu tavsiye olduğunued, tercihen ikinci aşamada kütle analizi (MS2) için iki kat ve üç kat yüklü iyonlar seçmek için kullanılır. , m / z 400-1,600 arasında bir kütle aralığı 8-30 amino asit aralığında en peptidleri belirlemek için uygundur. Burada bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak analiz için bir protokol sağlanır.
      1. Bir nanoLC-MS / MS sistemi otomatik örnekleyici kullanılarak analiz başına 20 ul numune enjekte edilir. C18 kolonu (100 mm id, 2 cm) tuzunun giderilmesi ve bir ters faz üzerinde peptitler konsantre edilir.
      2. 300 nL / dak 4-28% asetonitril /% 0.1 formik asit 30 dakikalık bir doğrusal eğimi kullanılarak bir analitik C18 kolonu (75 um id, 15 cm) üzerinde ayrı peptidler.
      3. Aşağıdaki parametreler ile bir üst 10 veri bağımlı etme yöntemi ile bir kütle spektrometresinde peptidleri analiz: m / z aralığı 380-1,600, m çözünürlüğü 30.000 / z 400, 2 Th izolasyonu genişliği, 45 sn için ± 10 ppm dinamik dışlama otomatik kazanç kontrol hedef MS / MS, maksimum enjeksiyon süresi 1 x MS 10 6 ve 5.000 MS 150 msMS / MS 100 ms.

    4. Veri Analizi

    1. MaxQuant kullanılarak protein tanımlanması ve miktar tayini
      1. kütle spektrometrisi ham verilerden her jel fraksiyonu içinde proteinlerin belirlenmesi ve ölçmek için serbestçe MaxQuant yazılımını kullanın.
        NOT: MaxQuant veri bağımlı edinim av tüfeği proteomik yaklaşımlar tarafından oluşturulan verileri üzerinde çalışır. Mavi doğal jel fraksiyonlardan MS verileri ayrı deneylerde olarak ve tüm jel dilimleri birleştiren bir deney parçaları olarak toplu analiz edilmelidir. stokiyometri hesaplamaları gerçekleştirmek için iBAQ değer kutusunu işaretleyin. MaxQuant kullanılarak veritabanı arama ve protein miktarının belirlenmesi için ayrıntılı protokolleri, 22, 21 olarak tarif edilmektedir.
    2. Perseus kullanarak protein profili analizi
      1. tespit proteinlerin göç profillerini görüntülemek için serbestçe kullanılabilir yazılım Perseus kullanın ve kullanarak bunları karşılaştırmakistatistiksel analiz.
        NOT: Perseus nasıl kullanılacağı konusunda genel belgeler http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials mevcuttur. Bir numune kümesi ek veri olarak kullanılabilir.
      2. Tüm jel fraksiyonları için protein tanımlamaları ve miktar değerleri içeren MaxQuant analizi ile döndürülen proteingroups.txt dosyası yükleyin. Ana kutusu (Şekil 1) yoluyla yoğunluk değerlerini doldurmak. Bir matris sütunlar gibi jel fraksiyonları ile, satır bütün protein tanımlamaları içeren görünür.
      3. Hit tersine karşılık gelen girişleri, sadece filtre satırları açılır menü kategorik sütun göre filtre satır (Şekil 2) seçerek ve olası kirletici tarafından tanımlanan proteinler çıkarın.
      4. Daha sonra, normalize açılır menüden Sum (Şekil 3) Divide seçerek toplam protein yoğunluğunda karşı profili boyunca, her bir protein fraksiyonu yoğunlukları normalize. Yeni matrix görünür.
      5. Görselleştirme açılır menüsünden (Şekil 4) içinde Profil Plot seçerek tüm proteinlerin göç profili araziler görüntüler.
      6. Filtre satırlar açılır menüden geçerli değerlere dayalı Seç Filtre satırları. Gerekli geçerli değerlerin sayısında 1 girin.
      7. Kümelenme / PCA açılır menüden Hiyerarşik kümeleme seçerek tüm mavi yerli jel fraksiyonları arasında belirlenen proteinlerin hiyerarşik kümeleme gerçekleştirin. Sütunlar ağaç kutusu (Şekil 5) kaldırınız. Kesecikleri daha sonra matris (Şekil 6) için Kümelenme sekmede ısı harita içinde görülür.
      8. dendrogram içinde yem protein içeren küme bulun. kümenin diğer parçaları yem ile birlikte göç proteinleri temsil ve bu nedenle aynı kompleksinin potansiyel etkileşim proteinleri / alt birimi vardır.

    figure-protocol-1 r /> Şekil Kahraman veri yükleme penceresinin 1. ekran görüntüsü. Şekil Perseus'a; proteinin belirlenmesi ve ölçümü veri yüklenmesi için adımları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    figure-protocol-2
    Site tarafından tanımlanan hit ve proteinleri, ters kirleticilere karşı gelen girdileri filtreleme için Kahraman penceresinin 2. ekran görüntüsü Şekil. kategorik sütuna göre filtreleme satırları seçme protein girdi türleri seçmek için yeni bir pencere veri setinden elimine edilmesi açılır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    /55498fig3.jpg"/>
    Kahraman normalleştirme penceresinin 3. ekran görüntüsü Şekil. Normalleştirme menüsündeki Divide seçilmesi farklı seçeneklerle yeni bir pencere açar. Sum seçilmesi, tüm fraksiyonlar arasında bu proteinin toplam yoğunluğu her fraksiyonda bir proteinin yoğunluk değeri böler. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    figure-protocol-3
    Perseus göç profili araziler gösteren Şekil 4. ekran görüntüsü. Proteinler, karşılık gelen profil seçmek için profil aşağıdaki matris içinde seçilebilir. Araç çubuğu profillerini düzenleyebilir ve ihracat için kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.


    Perseus hiyerarşik kümeleme penceresinin 5. ekran görüntüsü Şekil. Şekil Manhattan (L1) mesafe metriği ile proteinlerin hiyerarşik kümelenme için ayarları gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    figure-protocol-4
    Perseus'a Şekil 6. Ekran dendrogramını ve protein yoğunlukları ısı haritası yok. Ana panelin sağ taraftaki akışı yapılan her adım ve elde edilen matris gösterir ve herhangi bir adım geri kullanılabilir. iş akışı, aynı zamanda, herhangi bir ara matrisinden dallan. Bu f daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınŞEKIL.

    1. göreceli stokiyometri hesaplanması
      1. yem protein ile birlikte kümelenme göre bir protein kompleksinin alt-birimleri seçip göründükleri profili tepe noktası (ler) sınırlandırır.
      2. Her bir fraksiyonun her bir alt ünitesi için MaxQuant analizi ile döndürülen iBAQ değerleri ayrı ayrı kullanımı ve bu fraksiyon karşılık gelen yem iBAQ değerine göre normalize edilecektir.
      3. Seçilen tepe fraksiyonları arasında yem ve protein kompleksi alt birimleri için normalize iBAQs Konu ve lineer regresyon uygulanmaktadır. Onların normalize iBAQ değerlerinin eğilimleri karşılaştırarak yem karmaşık alt biriminin nispi miktarını hesaplayın.
    2. protein kompleksi büyüklük değerlendirme
      1. Örnek Lane hizalama mavi doğal jel dilimleri için tahmin edilen molekül ağırlıklarını hesaplamak için protein standartlarını kullanarak. Bunlardan, y ekseni jel x ekseni dilimleri ve moleküler ağırlıkları çizilerek doğrusal bir regresyon modeli oluşturur.
        2. bunların tanımlandığı mavi doğal dilim (ler) e göre protein kompleksi (ler) in gözlemlenen moleküler ağırlık aralığı tahmin etmek için modeli kullanın.

    Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Kütle Spektrometresi Afinite arıtma Mavi doğal protein Korelasyon profil iş akışı (ABC-MS), bir strateji, Şekil 7'de tasvir edilmiştir. ilgi konusu bir proteinin yaklaşık yerel protein kompleksleri (bu durumda FLAG) bir epitop etiketine karşı antikorlar kullanılarak afinite saflaştırma ve rekabetçi elüsyon ile izole edilir. kompleksleri BN-PAGE ile çözülür ve bütün jel şeridi 48 bölüme eksize edilir, ve av tüfeği LC-MS / MS için hazırlanmıştır. Kantitatif MS bilgileri mavi doğal ayırma boyunca tespit edilen her bir protein için bir geçiş profili oluşturmak için kullanılır. etkileşen proteinler, üst üste zirveleri ile bir tat karmaşık görüntüleme içindeki göç profillerini oluşturulur. ilgi konusu bir proteinin birden fazla montaj yer alır, birden fazla tepe noktası, kendi göç profilinde görülmektedir alt kompleksleri mavi doğal jel çözme gücü dahilindedir verilmiştir. mig sistematik karşılaştırılmasırasyon profilleri hiyerarşik kümeleme kullanarak profilleme protein korelasyon elde edilebilir. Dendrogramını ve fraksiyonlar için tepe yoğunlukları farklı protein kompleksleri ait proteinler (Şekil 8) etkileşimde tanımlanmasını kolaylaştıran bir ısıyla harita içinde görülür.

    Biz Mta2, kompleks 20 yeniden modelleme nurd kromatin bir çekirdek alt biriminin etkileşim ortakları analiz etmek için bu stratejiyi kullandı. Şekil 9'da gösterildiği gibi, Mta2 göç profili yüksek bolluk gösteren aşağıdaki kütle tepe, 700 kDa ve 1.2 MDA arasındaki belirgin yoğunluklarının iki tepe sergiledi. MTA1 / 3, HDAC1 / 2 ve Mbd3 dahil olmak üzere diğer nurd çekirdek alt birimleri, alt birimler, yani Chd4 bazı piklerin olsa aynı ayırma paternini b Gatad2a ve / Rbbp4 / 7, (Şekil 9A ters bolluk dağılım B). Buna karşılık, Cdk profili2ap1 Wnt gen promoteri 23 nurd kompleks düzelir bir düzenleyici faktör, sadece yüksek kütle zirve (Şekil 9C) görüntülenir ve böylece Sall4 da nurd 20, 24, 25 bağlandığı gösterilmiş olan bir transkripsiyon represör yaptı. Bu nedenle, mavi doğal PAGE ile afinite saflaştırılmış Mta2 ilişkili proteinlerin parçalanması nurd kompleksinin iki farklı şeklini çözmek mümkün oldu.

    ABC-MS de özel protein kişiler bunları atanmaktadır yeni interactors tanımlanmasına izin verir. Bir ısı harita temsil proteinler kümeleri ve fraksiyon yoğunluklarının incelenmesi sayesinde iki nurd p ile çakışan iki göç zirveleri gösteren nurd alt birimleri ve Wdr5 ile Wdr5, MLL metiltransferaz kompleksi 26 bir düzenleyici alt birimi, arasında güçlü bir ilişki tespitWdr5 ve nurd arasında yeni bir etkileşim olduğunu eaks (Şekil 8). Bu, boyut dışlama kromatografisi 20 eş-immünopresipitasyon ve ikili göç ile bu etkileşimi doğruladı.

    Hiyerarşik kümeleme mesafe metrik hesaplaması seçimi kümeleri ve dolayısıyla korelasyon şeklini etkileyecektir. Biz proteinin veya kompleksin mevcut etkileşim bilgisi ile en iyi uyum elde etmek için farklı ölçümlerin denemeler yapmanızı öneririz. Genellikle Manhattan (L1) mesafe metriği 20 ile en iyi sonuçlar elde edilmiştir. Pearson korelasyon veya bir Öklid mesafe ölçümlerini alternatif ayırma teknikleri 10, 11, 12 göre kompleksler belirlenmesi için rapor edilmiştir.

    quanMavi doğal fraksiyonlardan elde edilen titative MS verileri, aynı zamanda protein kompleksleri stokiyometri belirlemek için kullanılabilir. IBAQ (yoğunluk göre mutlak miktar) değeri olarak belirlenen proteinler 27, 28 nispi bolluk bir ölçüsünü sağlar. bir geçiş profili tepe içindeki tüm fraksiyonlarda protein kompleksi üyeleri için iBAQ değerleri göreceli miktarlarını elde etmek için yem proteinin normalize edilir. Belirli bir protein kompleksi üyesi için bir profil zirve boyunca normalize iBAQs yatay bir seyir takip etmeli ve trend değerleri yem proteine ​​göre etkileşim proteinlerin stokiyometrisini yansıtmaktadır. Stokiyometri hesaplamalar daha ayrıntılı bir gösterimi için, 20 bkz.

    figure-results-1
    Şekil 7: Şematik akışı özetleyen ABC-MS strategy. Bu rakam 20 ile modifiye edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    figure-results-2
    Mta2 interactors BN-PAGE migrasyon profilleri Şekil 8. Hiyerarşik kümeleme. Mta2 ilişkili proteinler göç profilleri benzerliğine göre kümelenmiş. Sadece nurd kompleksi içeren ısı-haritasının bir alt (mavi bir kutu içine) gösterilmektedir. Sarı kutu nurd kompleksi ile Wdr5 güçlü bir korelasyon vurgulamaktadır. açıklamalı moleküler ağırlıklar aynı jel içinde Protein standartlarının geçiş mesafeleri tahmin edilmiştir. Bu araştırma, başlangıçta Biyokimya ve Mo için 20 Amerikan Derneği Moleküler ve Hücresel Proteomics yayımlandı lecular Biyoloji. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    figure-results-3
    Nurd alt birimleri ve ilişkili proteinlerin Şekil 9. BN-PAGE göç profili. A) benzer yoğunlukta bir model mevcut Mta2 ve nurd alt birimi. B) ters yoğunluk desenli Mta2 ve nurd alt birimi. Sadece yüksek molekül ağırlıklı nurd bir oluşum halinde, C) Mta2 ve Cdk2ap1. açıklamalı moleküler ağırlıklar Protein standartlarının göç profili tahmin edildi. Bu araştırma, başlangıçta Moleküler ve Hücresel Proteomics 20 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society yayımlandı."_blank> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

    figure-results-4
    Ek veriler: Örnek veri kümesi. bir ABC-MS deneyinde protein tanımlamalar miktar değerleri içeren proteingroups.txt dosyasını MaxQuant türevi. Bu araştırma, başlangıçta Moleküler ve Hücresel Proteomics 20 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society yayımlandı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Burada, protein kompleksleri çözmek için niceliksel kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde mavi ile doğal jel elektroforezi, ardından afinite saflaştırma kullanılmasını tarif eder. Bu yaklaşım, fonksiyonel protein takımlar halinde tek boyutlu protein etkileşim listeleri aydınlatmak için bir yöntem sunmaktadır.

    Bu epitop etiketli proteinlerin kullanımına dayalı bir yöntemi göstermektedir. etiketli proteini eksprese eden bir hücre çizgisi mevcut değildir, ancak alternatif, ilgi konusu proteine ​​karşı antikorlar kullanmak için, doğal rekabet elüsyon elde etmek için uygun bir peptit olması koşuluyla olabilir. Başlatıcı madde ve boncuk miktarı miktarı, hedef proteinin ekspresyon düzeyi ile ilgili olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Normal olarak, başlangıç malzemesi 2-5 8 x 10 hücreleri ile bu protokolü gerçekleştirmek ve bu daha düşük bir ifade seviyesine sahip proteinler için yeterlidir. liziz tamponu bileşimi elde etmek için ampirik olarak seçilmelidiryakın yem çözünürleşmesini tamamlayın. Bu bağlanma, özellikle kromatin veya zar proteinleri, proteinlerin bazı türleri için zor olabilir. Alternatif seçenekler çalışılan protein kompleksi, yüksek tuz veya kromatin bağlayıcı proteinler, 20, 29 için sonikasyon ve / veya nükleaz işlemi kullanılarak stabil olması koşuluyla, tuz miktarı artan içerir. Membran proteinleri durumunda, DD veya digitonin deterjan geçiş 30 tavsiye edilebilir. DNA bağlama proteinleri durumunda, saflaştırma aşaması 20 esnasında benzonaz gibi bir nükleaz dahil etmek yararlıdır. Nükleik asitlerin tamamen çıkarılması tespit etkileşimleri proteinler arasında oluştuğu ve DNA tarafından aracılık olup olmadığını kontrol eder.

    Bu yaklaşımı kullanarak araştırma altındaki kompleksin kararlılığı olduğunda kritik bir unsur dikkate. usul, çok uzun ve preservin kapsayabilirg protein kompleksi gece boyunca karıştırılmıştır. İki kromatin yeniden modelleme kompleksleri (D. Bode ve M. Pardo, veriler gösterilmemiştir) ile iyi bir başarı elde etmiş, fakat bu değerlendirilmelidir. Gerekirse burada afinite arıtma aşaması kısalabilir.

    Bu tür, boyut dışlama kromatografisi gibi doğal fraksiyonasyon izin alternatif teknikler, geniş bir protein kompleksleri karakterize etmek için 50 yıldan fazla bir süredir kullanılmaktadır. Bu, diğerleri mavi doğal PAGE çözünürlüğü boyut dışlama kromatografisi 20, 31, 32, 33 kullanılarak elde edilene göre daha üstün olduğunu göstermiştir. mavi doğal PAGE bir diğer avantajı da pahalıdır kromatografi sistemleri, gerektirmediğini, ancak yerine laboratuvarlarda yaygın protein elektroforetik ekipman kullanır. açısından uygulamalı zaman, bu yöntem geleneksel GELC-MS / MS a daha çok işim içermezpproach veya çevrimdışı kromatografik ayırma. En fraksiyonasyon teknikleri gibi Ancak, onların çözümüne bir sınırı vardır. çok homojen veya kütle ve şekil olarak yakın Kompleksleri mavi doğal PAGE tarafından sunulan çözünürlük ve paylaşılan alt birimleri ile ayrı kompleksleri çözümünde evrensel başarılı olmayabilir aşağıda bildirildiği gibi dolayısıyla protokol ötesinde olabilir. Umut verici bir şekilde, üç alt-birimleri (M Pardo hazırlama yazısı) paylaşan iki çok benzer tetramerik komplekslerin ayrılması başarılı olmuştur.

    kütle spektrometresi giderek duyarlı hale gelmiştir beri spesifik olmayan interactors ve kirletici maddelerin dahi dakika miktarları AP-MS örneklerinde tespit edilebilir. Burada sunulan bir yaklaşım daha yüksek moleküler ağırlıkta yem taşıma zirve noktaları ile çakışmaktadır göç pikleri ile protein almaya odaklanarak afinite saflaştırma arka plan kirlenme gerçek interactors ayrımı da yardımcı olabilirmonomerik protein.

    Birkaç grup, önceki izolasyon 10, 11, 12, 34 ihtiyaç olmaksızın hücresel ölçekte protein kompleksleri tanımlamak için, protein korelasyon profil ardından ayırma tekniği kullanılmıştır. Ancak, bu alt stokiyometrik etkileşimlerini tespit etmek için başarısızlıkla sonuçlanabilir. afinite saflaştırma ile bir zenginleştirme aşamasının dahil edilmesi, bu üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Burada tarif edilen bir yaklaşım, belirli bir protein, aynı hücre kapsamında yer alır birden fazla kompleks protein kompleksleri topoloji keşfetmek ve çözülmesi için genel olarak kullanışlı olmalıdır. strateji, protein kompleksleri gidermek için pahalı kromatografik parçalanma ekipmana sahip olmayabilir laboratuvarlara basit ve elverişlidir.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

    Teşekkürler

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu çalışma Wellcome Trust (WT098051) tarafından finanse edilmiştir.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Protein G DynabeadsYaşam Teknolojileri10003D
    BAYRAK antikoru M2Sigma-AldrichF1804
    Tween-20, protein sınıfı, %10 çözeltiMillipore655206
    Dimetil pimelimidatSigma-Aldrich80490
    0.2 M Trietanolamin tamponu, pH 8.2Sigma-AldrichT0449
    3x BAYRAK peptitSigma-AldrichF4799
    Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
    NativePAGE %3-12 Bis-Tris jelYaşam TeknolojileriBN1001
    20x NativePAGE Çalışan TamponTeknolojileriBN2001
    20x NativePAGE Katot KatkılıYaşam TeknolojileriBN2002
    4x NativePAGE numune yükleme tamponuLife TechnologiesBN2003
    NativeMARKLife TechnologiesLC0725
    NativePAGE %5 G-250 numune katkı maddesi Yaşam TeknolojileriBN2004
    Nunc konik tabanlı 96 oyuklu plaka, polipropilenTermo249944
    Çok Ekranlı HTS 96 kuyulu filtrasyon sistemiThermoMSDVN6550
    Nunc 96 kuyulu kapaklı doğalThermo276002
    TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür)Sigma-Aldrich646547
    İyodoasetamidSigma-AldrichI1149
    Asetonitril, HPLC sınıfıFisher ScientificA/0627/17
    Tripsin, sıralama derecesiRoche11418475001
    MaxQuant (yazılım)NAN.A.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
    Perseus (yazılım)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus
    Yaşam

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
    2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
    3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
    4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
    5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
    6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
    7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
    8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
    9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
    10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
    11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
    12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
    13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
    14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
    15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
    16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340(2013).
    17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
    18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
    19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
    20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
    21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
    22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
    23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
    24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
    25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
    26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
    27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
    28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).
    29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
    30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
    31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
    32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
    33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
    34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Blue Native PAGEProtein Complex ResolutionAffinity PurificationProtein Correlation ProfilingMass Spectrometry AnalysisNative Gel ElectrophoresisCompetitive ElutionProtein Migration ProfilingHierarchical ClusteringSubcomplex Identification

    İlgili makaleler