Seçici etiketli floresan GnRH-I -II ve -III türevleri güvenilir izleme araçları ve bunların hücresel alımı miktarının vardır. Bu yazıda, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli hücre hatlarında Bu GnRH konjugatların alım verimliliğini karşılaştırmak için deneyler getirmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro Görüntüleme ve floresan etiketli GnRH Analoglarının İlaç Hedefleme Etkinliğinin nicelleştirmesinde
Bu makalede
Özet
Özet
GnRH analogları etkili hedefleme parçaları ve seçici kötü huylu tümör hücrelerinin hangi yüksek ekspres GnRH reseptörleri içine antikanser ajanları teslim edebiliyoruz. Bununla birlikte, GnRH analogları 'hücre içine kabul edilmesine kantitatif analizi ve GnRH-bazlı ilaç verme sistemlerinde incelenmiştir hücre tipleri şu anda sınırlıdır. Daha önce kişiye, seçici olarak etiketli floresan GnRH I-II ve III türevleri, büyük bir tespit edilebilirliğini sağlar ve tekrarlanabilir ve sağlam deneyler için uygun kimyasal özellikleri vardır. Biz de bu etiketli GnRH analogları uygun up-to-date yöntemleri GnRH-tabanlı ilaç dağıtım sistemleri hakkında yeni bilgiler sunabilir bulundu. GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - - GnRH-II ve [Lys 8 (FITC)] - GnRH Bu yazının [D-Lys 6 (FITC)] hücresel alımında ilgili bazı basit ve hızlı deneyler tanıttı EBC-1 (akciğer) üzerine -III, BxPc-3 (pankreas) ve Detroit-562- (yutak) malign tumor hücreleri. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, GnRH-I reseptörlerinin hücre yüzeyi seviyesi de daha önce ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile GnRH tedaviden sonra, bu hücre hatları üzerinde incelenmiştir. GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama ile nicelendirildi. Bu deneylerde, GnRH analoglarının ve hücre türleri arasında önemli farklılıklar arasında küçük farklılıklar gözlendi. hücre çizgileri arasında önemli farklılıklar, hücre yüzeyi GnRH-I reseptörlerinin onların farklı düzeyde ilişkilidir. kişiye deneyler, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli yapışık hücre kültürleri üzerinde zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde GnRH FITC konjugat alımı verimi karşılaştırma pratik yöntemler içerir. Bu sonuçlar verilen hücre kültürü üzerinde GnRH konjugatları ilaç hedefleme verimini tahmin ve GnRH-tabanlı ilaç taşıyıcı sistemlerin incelenmesi daha fazla deneyler için iyi bir temel sunabilir.
Giriş
Peptid bazlı hedeflenmiş ilaç taşıyıcı sistemler son birkaç yıldır 1, 2 üzerinde kanser tedavisinde hızlı bir gelişen ve gelecek vaat eden bölgeyi haline gelmiştir. İnsan Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptör tip I (GnRH-IR) öncelikle hipofiz bezi bulunur ama aynı zamanda kendini üreme 3 sorumlu diğer bazı dokularda mevcut mesafesindedir. GnRH-IR üreme sistemi 4, 5 ile ilgili ya da ilgisiz, kanserli dokuların bir dizi olarak ifade edilmektedir. Sağlıklı dokular ile karşılaştırıldığında birçok habis tümör hücreleri üzer....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hücre Kültürleri ve Reaktiflerin hazırlanması 1.
- % 10 (h / h) cenin sığır serumu ve antibiyotiklerin (denilen tam ortam) ile desteklenmiş üreticinin tavsiye edilen aracı madde içinde hücre kültürleri, koruyun. 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatöründe hücre kültürü şişesi tutun. ters mikroskop ile hücrelerin çoğalmasını ve konfluent takip (10X faz kontrast objektifi kullanılarak).
- Hücreler yeterli konfluent ulaştığında, orta kaldırmak ve 2-3 mL, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile kültür yıkayın. PBS çıkarın ve hücre kültürü 0.5 mL steril% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi eklenmekte ve hücreler (yaklaşık 10 dakika) ayrı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile elde edilen görüntüler, zaman ve konsantrasyona bağlı bir şekilde verilen hücre kültürü üzerinde GnRH FITC konjugat alımından hakkında muhteşem bilgiler sunmaktadır. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, hücre yüzeyi üzerinde GnRH-IR varlığı da CLSM deneyi ile kanıtlanabilir. Bundan başka, bir uzak-kırmızı bir DNA boyama flüoresan probun kullanarak, GnRH ve GnRH-IR yanında hücre çekirdekleri counterstain mümkündür. konfokal görüntü ölçül.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deneyler eleme yapışık seçici olarak etiketlenmiş GnRH analoglarını kullanım tarif in vitro hücre kültürleri. Konfokal mikroskopi ve sitometrisi yöntemleri takip için uygun bir süre ve konsantrasyon bağımlı bir tarzda, bu GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul miktarının olan akar. Bu deneyler aşağıdaki kritik adımlar vardır: 1) steril, sağlıklı hücre kültürü korumak; 2) GnRH peptidler yüksek kalitede olmalıdır; 3) makul konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri takip edilmelidir; 4) tedavi edilm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Proje, Ulusal Araştırma Fonu OTKA (K 104045) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| EBC-1 | JCRB Hücre Bankası | JCRB0820 | İnsan akciğer skuamöz hücreli karsinomu |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | İnsan pankreas adenokarsinomu |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | İnsan faringeal karsinomu |
| RPMI-1640 L-glutamin içeren ortam | Lonza | BE12-702F | BxPC-3 hücreleri için kültür ortamı |
| Eagle's Minimum Essential Orta | Lonza | BE12-611F | EBC-1 hücreleri için kültür ortamı ve Detroit-562 hücreleri için% 0.1 sodyum piruvat ile tamamlanmış |
| Fetal Sığır Serumu | Euro Klon | ECS0180L | Kültür ortamını tamamlar |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Kültür ortamını tamamlar (antibiyotikler) |
| Standart Hat Hücre Kültürü Şişeleri | VWR | 10062-872 | Hücreler için tutarlı, steril büyüme ortamı sağlar |
| Tripsin-EDTA Karışımı | Lonza | BE17-161E Bağlı | hücreleri çıkarın |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Lonza | BE17-516F | Çözücü |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Çözücü |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Hücreleri saymak için kullanılır |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | tarafımızdan yapılmıştır | - | Saflık ve ge; % 98 (HPLC) |
| [D-Lys6< / sup>(FITC)]-GnRH-II | tarafımızdan | yapılmıştır-Saflık | ≥ % 98 (HPLC) |
| [Lys8< / sup>(FITC)]-GnRH-III | tarafından | yapılmıştır-Saflık | ≥ % 98 (HPLC) |
| cam alt 8 oyuklu mikroskobik slayt | Ibidi | 80826 | CLSM deneyinde kullanım |
| Corning Costar hücre kültürü plakası, 12 kuyulu | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | FACS deneyinde kullanım |
| Sabitleme çözeltisi (%10 nötr tamponlu formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Yapışan hücreleri sabitleyin |
| Sığır Serumu Albümini | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önleyin |
| GnRHR Antikoru | Proteintech | 19950-1-AP | İmmünositokimya reaktifi, insan tip-I GnRH reseptörlerine bağlanır |
| İkincil Antikor, Alexa Fluor 546 konjugat | Thermo Fisher Scientific | A11035 | İmmünositokimya reaktifi, birincil antikora bağlanır |
| Floresan prob çözeltisi (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Karşı leke çekirdekleri |
| Floromount Sulu Montaj Ortamı | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | CLSM deneyinde kullanım, floresan korunarak |
| Ters mikroskop | Elektro-Optika Ltd. | Alfa XDS-2T | Hücre kültürlerinin fenotipini ve birleşimini kontrol edin Ters |
| konfokal lazer tarama mikroskobu | Zeiss | LSM-710 | CLSM deneyinde kullanım |
| Akış sitometresi | BD Biosciences | BD FACSCalibur | FACS deneyinde kullanım |
Kaynaklar
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
