Method Article

In Vitro Görüntüleme ve floresan etiketli GnRH Analoglarının İlaç Hedefleme Etkinliğinin nicelleştirmesinde

DOI:

10.3791/55529

⸱

March 21st, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seçici etiketli floresan GnRH-I -II ve -III türevleri güvenilir izleme araçları ve bunların hücresel alımı miktarının vardır. Bu yazıda, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli hücre hatlarında Bu GnRH konjugatların alım verimliliğini karşılaştırmak için deneyler getirmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GnRH analogları etkili hedefleme parçaları ve seçici kötü huylu tümör hücrelerinin hangi yüksek ekspres GnRH reseptörleri içine antikanser ajanları teslim edebiliyoruz. Bununla birlikte, GnRH analogları 'hücre içine kabul edilmesine kantitatif analizi ve GnRH-bazlı ilaç verme sistemlerinde incelenmiştir hücre tipleri şu anda sınırlıdır. Daha önce kişiye, seçici olarak etiketli floresan GnRH I-II ve III türevleri, büyük bir tespit edilebilirliğini sağlar ve tekrarlanabilir ve sağlam deneyler için uygun kimyasal özellikleri vardır. Biz de bu etiketli GnRH analogları uygun up-to-date yöntemleri GnRH-tabanlı ilaç dağıtım sistemleri hakkında yeni bilgiler sunabilir bulundu. GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - - GnRH-II ve [Lys 8 (FITC)] - GnRH Bu yazının [D-Lys 6 (FITC)] hücresel alımında ilgili bazı basit ve hızlı deneyler tanıttı EBC-1 (akciğer) üzerine -III, BxPc-3 (pankreas) ve Detroit-562- (yutak) malign tumor hücreleri. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, GnRH-I reseptörlerinin hücre yüzeyi seviyesi de daha önce ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile GnRH tedaviden sonra, bu hücre hatları üzerinde incelenmiştir. GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama ile nicelendirildi. Bu deneylerde, GnRH analoglarının ve hücre türleri arasında önemli farklılıklar arasında küçük farklılıklar gözlendi. hücre çizgileri arasında önemli farklılıklar, hücre yüzeyi GnRH-I reseptörlerinin onların farklı düzeyde ilişkilidir. kişiye deneyler, görselleştirmek ölçmek ve çeşitli yapışık hücre kültürleri üzerinde zamana ve konsantrasyona bağlı bir şekilde GnRH FITC konjugat alımı verimi karşılaştırma pratik yöntemler içerir. Bu sonuçlar verilen hücre kültürü üzerinde GnRH konjugatları ilaç hedefleme verimini tahmin ve GnRH-tabanlı ilaç taşıyıcı sistemlerin incelenmesi daha fazla deneyler için iyi bir temel sunabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptid bazlı hedeflenmiş ilaç taşıyıcı sistemler son birkaç yıldır 1, 2 üzerinde kanser tedavisinde hızlı bir gelişen ve gelecek vaat eden bölgeyi haline gelmiştir. İnsan Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptör tip I (GnRH-IR) öncelikle hipofiz bezi bulunur ama aynı zamanda kendini üreme 3 sorumlu diğer bazı dokularda mevcut mesafesindedir. GnRH-IR üreme sistemi 4, 5 ile ilgili ya da ilgisiz, kanserli dokuların bir dizi olarak ifade edilmektedir. Sağlıklı dokular ile karşılaştırıldığında birçok habis tümör hücreleri üzerindeki GnRH-IR yüksek ifadesi hedeflenmiş tedavinin 5, 6 için bir fırsat sağlar.

Birçok gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) analogları hedefleme parçaları olarak kullanılabilir, son birkaç on yıl içinde geliştirilmiştirf "> 7, 8, 9. Bu peptidler habis tümör hücrelerine yüksek seçicilikle antikanser ajanları vermek için mümkün olan aşırı ifade GnRH-IR 6. tekabül eden konjuge olmayan daha yüksek seçicilik ve daha iyi bir verim ile birkaç GnRH bağlı anti-tümör ilaç serbest ilaç, 8, 9 7 bildirilmiştir.

GnRH peptidlerinin ve bunların reseptörleri ile ilgili önceki yayınların GnRH İR GnRH 10 analogları için farklı seçiciliğe sahip çeşitli konfigürasyonlar varsayabiliriz bildirmiştir. Son derece değişken GnRH İR karmaşık ve çeşitli sinyal yolları doğal ve yapay ligandlar 11 karşı farklı bir aktivite ile donatıldığı şaşırtıcı şekilde bulunmuştur sahiptir. Bu gerçekler GnRH-tabanlı sistemlerin incelenmesi zorlu olun. Öte yandan, y umut verici terapötik potansiyele sahiptir. Radyo işaretli GnRH peptit ile yaptığı deneyler, daha önce burada floresan etiketli GnRH analogları kullanıldı, 12, 13, 14, 15, fakat deneyler rapor edilmiştir de sınırlıdır. Radyoaktif etiket yüksek hassasiyet sağlarken, floresan etiketleme birçok avantaj, örneğin, daha kolay kullanım ve farklı fluorophores counterstain yeteneğine sahiptir. Başarılı bir şekilde ilaç iletimi için kullanılmıştır Üç yaygın GnRH analogları -GnRH-l, [D-Lys 6] -GnRH II ve GnRH-III fakat hedefleme parçaları olarak bu peptidlerin etkinliği [6, D-Lys] olan nadiren, 17 16 karşılaştırdık. Diğer taraftan, farklı kanser hücreleri ve GnRH analogları kullanılmış olan ayrı deneylerden elde edilen sonuçlar farklı.

Bu düşünceler dayanarak ntent ">, bu GnRH peptidler hedef tümör ve ilaç dağıtım potansiyeli üzerinde duruldu ve bu suretle de sentezlenen ve [D-Lys 6 (FITC)] karakterize - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH II ve [Lys 8 (FITC)] - GnRH III peptid birleşikleri 18 Bu analoglar seçmeli olarak Lys ya da D-Lys (peptid-FITC oranı yan zinciri 1 FITC ile etiketlenmiştir: her biri 1. konjuge). Fikir seçici floresan etiketleme bu peptitler hakkında yeni bilgiler sunmak ve onların iyi izleme ve güvenilir ölçümü sağlar ki oldu. bu konjügatlar daha kolay onların tümör hedefleme verimini karşılaştırmak yapmak güvenli kullanım ve güvenilir tespit edilebilirliğini var, ve malign tümör hücrelerinin çok sayıda türde tarama. Biz up-to bu peptid konjugatları ile tarih deneyleri GnRH-ilaç konjugatları hedefleyen yeni kanser gelişimine katkıda ve yeni tedavi tar tanımlamak için yardımcı olabilir umuyoruzde alır.

Mevcut el yazması GnRH-FITC konjugatları ile bazı iyi tekrarlanabilir ve hızlı deneyler gösteriyor. GnRH-R'nin hücre yüzey ifadesi bu nedenle eş zamanlı olarak test edilen hücre hatları üzerinde GnRH-IR, hücre yüzeyi seviyesine araştırıldı GnRH alımı ile ilgili belirleyici bir durumdur. Bu konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile GnRH IR ve GnRH-FITC birleşikleri görsel ve floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul ölçülmüştür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre Kültürleri ve Reaktiflerin hazırlanması 1.

  1. % 10 (h / h) cenin sığır serumu ve antibiyotiklerin (denilen tam ortam) ile desteklenmiş üreticinin tavsiye edilen aracı madde içinde hücre kültürleri, koruyun. 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatöründe hücre kültürü şişesi tutun. ters mikroskop ile hücrelerin çoğalmasını ve konfluent takip (10X faz kontrast objektifi kullanılarak).
  2. Hücreler yeterli konfluent ulaştığında, orta kaldırmak ve 2-3 mL, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile kültür yıkayın. PBS çıkarın ve hücre kültürü 0.5 mL steril% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi eklenmekte ve hücreler (yaklaşık 10 dakika) ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Tripsin durdurmak ve steril bir santrifüj tüpü içine aktarmak için 3-4 ml steril tam orta hücreleri Askıya. oda sıcaklığında 4 dakika boyunca (RT) 150 x g'de santrifüjleyin hücreleri. dikkatle Süpernatantı atın ve p askıya2-3 ml steril komple ortam içinde ellet.
  4. hücre süspansiyonu 100 mcL çıkarın ve ölü hücreleri leke, 100 mL% 0.4 (m / V) tripan mavisi çözüm ile karıştırın. Yük hemasitometre içine bu karışımın 10 uL ve ters mikroskopla yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek.
  5. 4 x 10 4 hücre / ml ihtiva eden steril bir tam ortam ile 10 mL adım 1.3 hazırlanan hücre süspansiyonu gerekli miktarda, seyreltilir.
  6. Ilk cam alt 8-de mikroskopik slayt yedi kuyu içine çukur başına (adım 1.5 hazırlanmış) hücre süspansiyonu 250 mcL ekleyin (10 4 hücre / çukur). GnRH alım yönteminde bu slaytı kullanın.
  7. İkinci 8-de mikroskopik slayt beş kuyu içine çukur başına (adım 1.5 hazırlanmış) hücre süspansiyonu 250 mcL ekleyin (10 4 hücre / çukur). Bu slayt GnRH İR sentezleme yöntemi kullanılacaktır.
  8. Ekle 1 oyuk başına (1.5 adım hazırlandı) ml hücre süspansiyonu (4 x 10 4 hücre / çukur), yedi wel halinde12 oyuklu bir plakanın mi. Bu plaka, GnRH miktar yönteminde kullanılacaktır.
  9. Hücreler iki mikroskobik slaytlar ve plaka üzerinde bağlı olsun. 48 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatöründe inkübe.
  10. Kuluçkadan sonra (10X faz kontrast objektif kullanarak) inverted mikroskop hücreleri kontrol edin. hücreleri sağlıklı ve ekli ise, aşağıdaki adımlarla devam edin.
  11. Üç konjuge 18 her biri dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM GnRH-FITC ile bir stok çözelti hazırlayın. GnRH-I, 16.97 mg / ml [D-Lys 6 (FITC)] - - GnRH II ve 16.47 mg / ml [Lys 8 (16.43 ug / ml [D-Lys 6 (FITC)]: (bu sulandırma konsantrasyonlarını kullanarak FITC)] - GnRH-III) oda sıcaklığında karanlık bir yerde bu stok çözümleri tutun ve birkaç hafta içinde onları kullanın.
  12. 1.7 uL 1.7 mL komple ortam içinde 10 mm GnRH-FITC ile her ana çözeltiden seyreltilir. Bu çözümleri çalkalayın. (THESe medyayı tedavi 10 uM GnRH-FITC vardır.) 1.35 ml tam orta 150 uL üç 10 uM GnRH-FITC tedavi ortamının her seyreltin. hem de bu çözümleri çalkalayın (bu 1 uM GnRH-FITC tedavi orta).
    Not: tedavi ortamı içeren tüm GnRH FITC ışıktan korundu ve bir kaç saat içinde kullanılmalıdır gerekir.
  13. 37 ° C'de altı GnRH-FITC ile muamele ortam (Aşama 1.12 hazırlandı) ve 4 ml komple ortam önceden ısıtın.
  14. 5 mM flüoresan prob çözeltisi 3 uL 5 uM 3 ml PBS (Malzeme Listesi bahsedilen nükleer karşı-) seyreltin. Bu çözelti oda sıcaklığında tutmak ve birkaç saat içinde onu kullanmak, ışıktan korunmalıdır.

2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM)

  1. GnRH uptake yöntemiyle
    1. Adım 1.6 hazırlanan ilk mikroskobik slayt atın ve iyi yedi her birinden tam orta dışarı pipetle. ısıtılmış tam medi 250 uL ekleyinİlk kuyuya um. Bir negatif kontrol olarak kullanın. (1 uM, 3 10 uM 3 kuyu) altı kuyu her birine (1.13) ortam tedavi önceden ısıtılmış GnRH-FITC 250 ul. 5 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
    2. Her kuyucuktan alınan ortam üzerinden pipet ve 250 uL PBS ile yıkama hücreleri. 10 dakika boyunca, her bir kuyunun içine sabitleme çözeltisi (% 10 nötr tamponlu formalin) 250 uL ekleyin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
    3. Her kuyudan sabitleme çözüm pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca, her bir kuyunun içine adım 1.14 hazırlanan 5 uM floresan prob çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
    4. her bir floresan prob çözüm pipet ve dikkatle 250 uL PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Sonunda, her bir kuyunun içine montaj orta 3-4 damla ekleyin. görüntüleme kadar oda sıcaklığında karanlıkta slayt tutun.
  2. GnRH-IR ifade yöntemi
    1. Adım 1.7 hazırlanan ikinci 8-iyi mikroskopik slayt atın ve beş kuyuların her birinden tam orta dışarı pipetle.
    2. İlk kuyuya ısıtılmış tam orta 250 mcL ekleyin, bu kadar olumsuz kumandayı kullanın. çok ikinci kuyuya ısıtılmış tam orta 250 mcL ekleyin ve GnRH tedavisinden önce GnRH-IR ifade incelemek için kullanabilirsiniz.
    3. Önümüzdeki üç kuyulara 250 uL üç ısıtılmış 10 uM GnRH-FITC tedavi medya her ekleyin. GnRH-IR ifade incelemeden önce GnRH-FITC konjugatları ile hücrelerin ön muamele edilmesi için bu kuyu kullanın. 1 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
    4. GnRH tedaviden sonra GnRH-IR ifade incelenmesi ve önceden ısıtılmış tam ortam 250 uL, bu kuyu yıkama için kullanılacak üç kuyu her birinden tedavi ortamı üzerinden Pipet. 250 ekleuL üç kuyu her birine tam orta önceden ısıtılmış. 1 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör slayt inkübe edin.
    5. Beş kuyuların her birinden orta dışarı Pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca, her bir Çözeltinin sabitleme 250 uL ekleyin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
    6. Her kuyudan sabitleme çözüm pipet ve 250 ml PBS ile yıkama hücreleri. 1 saat boyunca, her kuyuya% 5 sığır serum albumin (BSA) Bloklama çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında slayt inkübe edilir.
    7. (: 100 oranı 1) 1 ml PBS içinde GnRH İR birincil antikor 10 uL seyreltilir. Oda sıcaklığında tutun ve birkaç saat içinde tüketin.
    8. Negatif kontrol (ilk sıra) hariç her kuyudan BSA engelleme çözümü Pipet. (Negatif kontrol oyuğu dışında) 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. 250 uL PBS EAC içine adım 2.2.7 hazırlanan GnRH İR primer antikor ihtiva eden ekleme(Negatif kontrol hariç) h kuyu. karanlık bir yerde, 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt inkübe edin.
    9. (: 500 oranı 1) 1.25 mL PBS Alexa 546 etiketli ikincil antikor 2.5 uL seyreltilir.
      NOT: Bu çözelti, oda sıcaklığında tutmak ve birkaç saat içinde onu kullanmak, ışıktan korunmalıdır.
    10. Beş kuyuların her birinden çözümler Pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. her bir kuyunun içine adım 2.2.9 hazırlanan AF 546 etiketli ikincil antikor içeren 250 ml PBS ekleyin. Karanlıkta 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt inkübe edin.
    11. Her kuyudan çözüm pipet ve 250 uL PBS ile hücreleri yıkayın. her bir kuyunun içine adım 1.14 hazırlanan 5 uM floresan prob çözeltisi ihtiva eden 250 ml PBS ilave edin ve oda sıcaklığında, 10 dakika süre ile slayt inkübe edin.
    12. Her kuyudan floresan prob çözüm pipet ve dikkatle 250 uL PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Daha sonra, her bir kuyunun içine montaj medya 3-4 damla ekleyin. Karanlıkta slayt tutunOda sıcaklığında mikroskopik görüntüleme kadar.
  3. Görüntüleme
    1. Görüntü (63X immersiyon yağı hedefi kullanarak) ters konfokal lazer tarama mikroskobu ile hücrelerin
      1. Aşağıdaki uyarma / emisyon dalga boylarında kullanın. GnRH konjugatları: 488/514 nm, Alexa 546 etiketli antikor: 488/546 nm (sadece GnRH-IR ifade yöntemi için kullanılması), Draq5 floresan prob: 633/680 nm.
      2. Negatif kontrol hücreleri kullanılarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Görüntü tedavi hücrelere bu parametreleri (Şekil 3) kullanın. Yeniden ayarlamak analizin başında her mikroskobik slaytta görüntüleme parametreleri. Gerekirse üretici tarafından sağlanan yazılım ile ince ayar ve ihracat görüntüler.

3. floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS)

  1. GnRH miktar yöntemi
    1. Adım 1.8 hazırlanan plaka almak ve ea komple orta dışarı pipetleYedi kuyu Ch. İlk kuyuya ısıtılmış tam ortam 1 ml. Bir negatif kontrol olarak kullanın. Ekle 1 ml altı kuyu içine ortam (1 uM ve 10 uM 3 kuyu 3 kuyu) tedavi etmek ısıtılmış altı her. 5 saat boyunca 37 ° C'de, nemlendirilmiş,% 5 CO2 atmosferi inkübatör plaka inkübe edin.
    2. Her kuyudan orta dışarı pipetle. dikkatli bir şekilde 2 ml PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Her bir kuyu içine tripsin-EDTA çözeltisi 500 ul ekle. Hücreler (yaklaşık 10 dakika) ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe plakası.
    3. Tripsin durdurmak için her bir kuyunun içine tam orta 1 ml. plaka çalkalayın. Bir pipet yardımıyla hafifçe hücreleri Askıya ve FACS tüpleri içine her bir kuyudan süspansiyonu transfer. 4 ° C'de 4 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjleyin tüpler.
    4. tek hamle ile, dikkatlice süpernatantlar dökün. hücreler askıya tekrar yavaşça her FACS tüpü içinde buz soğukluğunda 500 ul PBS ekleyin. sonuna kadar buz üzerinde tüpler tutunDeney.
  2. Analiz ve hesaplama
    1. flow sitometri hücreleri analiz edin. eksitasyon için 488 nm argon lazer dalga boyu kullanımı ve saptama için 530 nm dalga boyu kullanın. Negatif kontrol hücreleri çalıştırarak parametreleri sitometresi akışını ayarlayın. Tedavi hücreleri (Şekil 4A) analiz etmek için bu parametreleri kullanın. Üreticinin yazılımı ile verilerin değerlendirilmesi medyan floresan yoğunluğu (MFI) değerlerinin belirlenmesi ve göreli MFI değerlerini hesaplamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile elde edilen görüntüler, zaman ve konsantrasyona bağlı bir şekilde verilen hücre kültürü üzerinde GnRH FITC konjugat alımından hakkında muhteşem bilgiler sunmaktadır. Bu GnRH-FITC eşlenikleri ile paralel olarak, hücre yüzeyi üzerinde GnRH-IR varlığı da CLSM deneyi ile kanıtlanabilir. Bundan başka, bir uzak-kırmızı bir DNA boyama flüoresan probun kullanarak, GnRH ve GnRH-IR yanında hücre çekirdekleri counterstain mümkündür. konfokal görüntü ölçül...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneyler eleme yapışık seçici olarak etiketlenmiş GnRH analoglarını kullanım tarif in vitro hücre kültürleri. Konfokal mikroskopi ve sitometrisi yöntemleri takip için uygun bir süre ve konsantrasyon bağımlı bir tarzda, bu GnRH-FITC ile konjügatlarının hücreye kabul miktarının olan akar. Bu deneyler aşağıdaki kritik adımlar vardır: 1) steril, sağlıklı hücre kültürü korumak; 2) GnRH peptidler yüksek kalitede olmalıdır; 3) makul konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri takip edilmelidir; 4) tedavi edilm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proje, Ulusal Araştırma Fonu OTKA (K 104045) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EBC-1JCRB Hücre BankasıJCRB0820İnsan akciğer skuamöz hücreli karsinomu
BxPC-3ATCCCRL-1687İnsan pankreas adenokarsinomu
Detroit-562ATCCCCL-138İnsan faringeal karsinomu
RPMI-1640 L-glutamin içeren ortamLonzaBE12-702FBxPC-3 hücreleri için kültür ortamı
Eagle's Minimum Essential OrtaLonzaBE12-611FEBC-1 hücreleri için kültür ortamı ve Detroit-562 hücreleri için% 0.1 sodyum piruvat ile tamamlanmış
Fetal Sığır SerumuEuro KlonECS0180LKültür ortamını tamamlar
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012Kültür ortamını tamamlar (antibiyotikler)
Standart Hat Hücre Kültürü ŞişeleriVWR10062-872Hücreler için tutarlı, steril büyüme ortamı sağlar
Tripsin-EDTA Karışımı LonzaBE17-161E Bağlıhücreleri çıkarın
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)LonzaBE17-516FÇözücü
Dimetil sülfoksitSigma-AldrichD8418-100MLÇözücü
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4Thermo Fisher Scientific15250061Hücreleri saymak için kullanılır
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-Itarafımızdan yapılmıştır- Saflık ve ge; % 98 (HPLC)
[D-Lys6< / sup>(FITC)]-GnRH-IItarafımızdanyapılmıştır-Saflık≥ % 98 (HPLC)
[Lys8< / sup>(FITC)]-GnRH-IIItarafındanyapılmıştır-Saflık≥ % 98 (HPLC)
cam alt 8 oyuklu mikroskobik slaytIbidi80826CLSM deneyinde kullanım
Corning Costar hücre kültürü plakası, 12 kuyuluSigma-AldrichCLS3513-50EAFACS deneyinde kullanım
Sabitleme çözeltisi (%10 nötr tamponlu formalin)Bio-Optica01V60PYapışan hücreleri sabitleyin
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA7906-10GAntikorların spesifik olmayan bağlanmasını önleyin
GnRHR AntikoruProteintech19950-1-APİmmünositokimya reaktifi, insan tip-I GnRH reseptörlerine bağlanır
İkincil Antikor, Alexa Fluor 546 konjugatThermo Fisher ScientificA11035İmmünositokimya reaktifi, birincil antikora bağlanır
Floresan prob çözeltisi (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254Karşı leke çekirdekleri
Floromount Sulu Montaj OrtamıSigma-AldrichF4680-25MLCLSM deneyinde kullanım, floresan korunarak
Ters mikroskopElektro-Optika Ltd. Alfa XDS-2THücre kültürlerinin fenotipini ve birleşimini kontrol edin Ters
konfokal lazer tarama mikroskobuZeissLSM-710CLSM deneyinde kullanım
Akış sitometresiBD BiosciencesBD FACSCaliburFACS deneyinde kullanım

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

Related Articles