Yöntem makalesi

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

9.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55558

⸱

28 Mart 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Bu makalede

Özet

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

Özet

bakteriyel patojenler engellemek için bir çaba, ana sıklıkla enfeksiyon yerinde besinlerin kullanılabilirliğini sınırlamaktadır. Bu sınırlama düzenleyici faktörler hücresel metabolizmayı ayarlayarak, cevap hangi anahtar metabolitlerin bolluklarını değiştirebilir. Son yıllarda, proteinler ve RNA bir dizi hastalık oluşturma gen ekspresyonunun önemli regülatörleri olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, Cody proteini dallı zincirli amino asitler ve GTP seviyelerine yanıt ve yaygın olarak düşük G + C Gram-pozitif bakteriler ile muhafaza edilir. Staphylococcus aureus küresel regülatör olarak, Cody virülans ve metabolik genlerin onlarca ifadesini kontrol eder. Biz S. aureus Cody, kısmen, potansiyel konak ortamında karşılaşılan besin sınırlayıcı koşullara uyum sağlama çabası içinde olan metabolik durumunu değiştirmek için kullandığı varsayımında. Bu makale kütle spektrumu ile birleştiğinde sıvı kromatografisi kullanılarak S. aureus metabolitleri çıkarılması ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif etmektedirtrometry, bu hipotezi test etmek için geliştirilen bir protokoldür. yöntem ayrıca, sürekli kemostat kültürlerin kullanmadan biyolojik kararlı duruma ve sürekli havalandırma sağlamak gibi titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlayacaktır iyi uygulamaları, vurgulamaktadır. USA200 metisiline duyarlı S. aureus Bağıl UAMS-1 ebeveyn soy izole izogenik codY mutantı aspartat (örneğin, treonin ve izolösin) elde edilen amino asit önemli artışlar sergilemiştir ve (bunların ön azalır, örneğin aspartat ve O-asetilhomoserin ). Bu bulgular, bir RNA seq analizi ile elde edilen transkripsiyon veriler ile iyi bir korelasyon: Cody boş mutantta 10- ve 800-kat arasında up-regüle bu yolların genler idi. transcriptome ve metabolom küresel analizlerini Coupling çevresel veya beslenme stresle karşılaştıklarında bakteri phys içine potansiyel kavrayış sağlayan onların metabolizmasını değiştirebilir nasıl ortaya çıkarabilirbesin tüketme ile ilişkili iological değişiklikler enfeksiyon sırasında yaşadı. Bu bulgular, yeni anti-infektifler ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için yol açabilecektir.

Giriş

Bakteriyel patojenler konak ortamında birçok zorluklarla uğraşmak zorundadır. Bağışıklık hücreleri tarafından doğrudan saldırısına ek olarak, ev sahibi de, bakterinin yaşamda kalması ve çoğaltma üreten beslenme bağışıklık 1, 2 temel besin ayrı tutmaktadır. Bu düşmanca ortamlarda hayatta kalmak için, bakteriyel patojenler virülans faktörleri dağıtın. Bu faktörlerin bazıları bakteriler bağışıklık karşılığına izin; diğer faktörler doku türevi bileşenleri 3, 4, 5, tüketerek eksik besin doldurmak için bakteri sağlayabilir, örneğin hiyaluronidaz, thermonuclease ve lipaz gibi sindirim enzimleri, salgılanan içerir. Gerçekten de, bakteriler virülans, 6 faktörleri 7 üretimine hücrenin fizyolojik durumunu bağlayan düzenleyici sistemleri gelişmiştir, class = "xref"> 8, 9, 10 kadar.

Artan miktarda kanıt vücut metabolizmasını ve virülans bağlayan kritik bir regülatör olarak Cody işaret ediyor. İlk dipeptit permeaz (DPP) gen 11 bir bastıncısı olarak Bacillus subtilis keşfedilmiştir, ancak Cody hemen hemen tüm düşük G + C Gram-pozitif bakteriler 12, 13 tarafından üretildiği bilinmektedir ve düzenler karbon katılan genlerin onlarca azot metabolizması 14, 15, 16, 17, 18, 19. Patojenik türlerde, Cody, en önemli hastalık oluşturma gen 20, 21 bazı ekspresyonunu kontrol,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody ligandların iki sınıf ile bir DNA-bağlama proteini olarak aktive edilir: dallı zincirli amino asitler (BCAAs, izolösin, lösin ve valin [ILV]) ve GTP transkripsiyonu bu besinler bol olduğunda., Cody bastırmaktadır (ya da bazı durumlarda, uyarır). bu besin sınırlı hale geldikçe, Cody aktivitesi aşamalı olarak azalır,-yolları yeniden merkezi metabolizmaya bağlı çeşitli metabolik yollar aracılığıyla öncüleri bir kademeli transkripsiyonel yanıt olarak ortaya çıkan 28, 29, 30.
Kütle spektrometrisi (LC-MS) bağlanmış Tandem sıvı kromatografisi doğru küçük moleküllü hücre içi metabolitler 31 tanımlamak ve miktarını güçlü bir tekniktir. transkripsivonel ile eşleştirilmiş zamanriptome analizi (örneğin, RNA-Dizi), bu analitik akışı çevresel veya beslenme stres yanıt olarak oluşan fizyolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Burada, LC-MS ile Staphylococcus aureus hücreleri ve daha sonra analiz metabolit ekstraksiyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım S. aureus fizyolojisi üzerinde Cody pleiotropik etkilerini göstermek için kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tampon çözeltiler hazırlanması 1.

  1. fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama, ultra saf ile 1x nihai bir konsantrasyona kadar 10 x PBS stok çözelti seyreltilerek (PBS, pH 7.4) (distile ve deiyonize) su.
  2. 2 ml asetonitril içindeki, 2 ml metanol, ultra saf H2O 1 mL ve formik asit 19 uL (0.1 mM son konsantrasyon) birleştirerek söndürme çözeltisi hazırlayın.
  3. LC-MS, aşırı saf su, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, bir çözücü hazırlanır.
  4. asetonitril, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) eklenerek LC-MS solvent B hazırlayın.
    Not: Bütün çözeltiler yüksek saflıkta reaktifler elde edildi (genellikle, yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı) kullanılarak hazırlanmalıdır. Çözümler her deneyden önce taze hazırlanmış ve kullanımdan önce buz üzerinde muhafaza edilmelidir.

Kararlı hal S. aureus Büyüme 2. Kurulması

  1. Streak S. aureuBir dondurulmuş gliserol stokundan triptik agar (TSA) üzerinde izolasyonu için ilgi lar suşları. 16-24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  2. triptik soya suyu (TSB) ya da her bir suşun tek koloniler ile steril cam inkübasyon tüplerde başka bir uygun ortam içinde 4 mL inoküle. eğimli inkübe (~ 70 ° açı) 16-20 saat boyunca 37 ° C'de dakika (rpm) 60 rotasyon dönme ile.
    Not: Hücresel fizyolojisini etkiler, burada aşama 2.2 tarif edilenler de dahil olmak üzere, standart yöntemler kullanıldığında, gece boyuncaki kültürleri oksijen gradyanlar yatkındır. Böylece, (bkz adımlar 2,4-3,2, aşağıda) biyolojik kararlı durum sağlamak için çoklu arka seyreltme stratejisini kullanır.
  3. 600 nm (OD 600) de aşama 2.2 kültürlerin optik yoğunluğunun ölçülmesi için bir spektrofotometre kullanılır. bir optik referans (boş) olarak steril ortamı kullanın. Steril TSB ortamı 0.05 50 mL'lik bir OD 600 bu hücrelerin seyreltin ayrı olarak, 250 mL DeLong şişelerinde (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış).
  4. incukesmek 280 rpm'de çalkalanarak, bir su banyosu içinde 37 ° C 'de kültür.
  5. Her 30 dakika, 600 ölçüm OD almak; Optik yoğunluklar arttıkça, bunların spektrofotometrenin doğrusal nüfuz aralığında kalacak şekilde TSB kültürleri seyreltilmesi için gerekli olabilir.
  6. Adım 2.5 kültürler ~ 0.8-1.0 OD 600 elde zaman, 0.01-0.05 OD'ye 600-37 ° C TSB 50 mL içine alt-kültürü ve tekrar 2.4 ve 2.5 adımları tekrarlayın.

3. Numune Toplama Kur

  1. Uygun bir kap içinde ezilmiş kuru buz dolu bir yatak hazırlayın (örneğin, cam tabak, buz kovası veya soğuk).
  2. kültürlerin optik yoğunlukları arzu edilen hasat noktası yaklaştıkça, ≥5 dakika boyunca 35 mm işlemden geçirilmemiş olan Petri çanağı ve kuru buz üzerinde ön-soğutma çözeltinin söndürülmesi 1 ml.
    NOT: "İstenilen hasat noktası" deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. Örneğin, tek bir m incelemek için olanetabolites aerobik büyüme sırasında, bu durumda ana göstergeleri asetat atılımı ve post-üstel gelişme fazı 32, 33 boyunca asetat yeniden asimilasyon bulunmaktadır. Genel olarak, bu noktada, özel bir gelişme aşamasında (örneğin, üstel faz) içinde olmalıdır. Bu aşamada ilişkili belirli OD600 değerleri farklı bakteriyel suşlara ve büyüme ortamı arasında değişebilir.
  3. Bir kauçuk tıpa içinde (-20 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş) bir paslanmaz çelik filtre hamuru yerleştirin ve bir ev tipi vakum veya vakum pompasına bağlı bir vakum şişesi üstüne yerleştirin.
  4. vakum uygulayın ve üstüne bir karışık selüloz ester zarı (0.22 um gözenek boyutu) yerleştirin.
    NOT: frit eşit bir çapa sahip olan bir filtre kullanımı ve uygun örnek bir filtreden yerine kenar üzerine çekilir emin olmak için bu filtre merkezi kritiktir. Buz soğukluğunda steril H membran ıslatma 2 O yardımcı olabilirbir membran yerleştirmek ile.

4. Örnek Hasat

  1. OD 600 ~ 0.4-0.5 'de, şişeye kültüre 13 mL kaldırmak için serolojik bir pipet kullanın ve filtreye örnek uygulamak.
  2. Numunenin tamamı, filtre edildikten sonra, hemen orta ilişkili metabolitleri yıkamak için buz soğukluğunda PBS ≥5 mL ile filtre yıkayın.
  3. vakum ayırın ve frit filtreyi kaldırmak için steril bir cımbız kullanın. Önceden soğutulmuş söndürme çözeltisi içine filtre (hücre tarafı aşağı) ters çevirin.
    Sıvı metabolik aktiviteyi kontrol altına alınması, hücrelerin hızlı söndürme sağlamak için kaldırılmıştır kısa sürede (saniye içinde, örneğin) hızlı bir şekilde yukarıdaki adımları gerçekleştirmek için önemlidir ve: NOT.
  4. ≥20 dakika boyunca kuru buz üzerinde soğutma çözelti içinde filtre inkübe edin.
  5. Petri kabındaki filtre (hücre tarafı yukarıda) tersine ve t ve hücreler durulama için bir mikropipet kullanarak steril cımbız kullanarako söndürme çözeltisi içine membrana.
  6. ve söndürme çözeltisi içinde hücreler süspansiyon haline yeniden daha sonra 0.1 mm silis boncuklar ~ 100 uL içeren steril 2 ml darbeye dayanıklı tüp hücre süspansiyonu aktarın. kuru buz üzerinde ya da -80 ° C'de bu saklayın.

5. metabolit Ekstraksiyon

  1. ıslak buz üzerinde çözülme örnekler ve döngüler arasındaki kuru buz üzerinde 2 dakika soğutma süreleri ile, 6,000 rpm'de dört 30 s açılışları olan bir homojenleştiricide hücreleri parçalamak.
  2. Maksimum hızda önceden soğutulmuş, soğuk mikrosantrifüj içinde 15 dakika için lizatları netleştirmek (yani ≤4 ° C'de 18.213 x g'de).
  3. Temiz bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
  4. Mikropipet kullanılarak, adım 6'da kalıntı peptit içeriğinin miktarının belirlenmesi için bir mikrosantrifüj tüpüne numunenin çok küçük bir kısmını aktarmak; -80 ° C'de kalan saklayın.
    Not: yedek numune hacmi aşama 6.1'de kullanılan BCA bağlı olarak değişir. BuNumune derhal analiz için ıslak buz üzerinde saklanır ya da -80 ° C'de donduruldu olmalıdır.

6. Bikinkoninik asit (BCA) deneyi

  1. Her bir örnek için kalıntı peptit konsantrasyonunu belirlemek için aşama 5.4 numuneleri kullanılarak, bu kit, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi bir BCA deneyi gerçekleştirmek.

7. LC-MS

  1. LC-MS çözücü B 75 uL, 75 uL S. aureus özü, aşama 1.4'te hazırlanan karıştırın.
  2. Girdap 5 dakika boyunca 13.000 x g'de karıştırın ve sıkma için.
  3. bir sıvı kromatografisi (LC) şişenin içine yüzer maddelerinden 100 uL yerleştirin ve kapağı. hiçbir hava kabarcığı numunede sıkışıp emin olun.
  4. LC-MS otomatik numune alıcı üzerine LC şişeleri yükleyin ve yazılımda çalışan listesini düzenlemek "Çevrimdışı Çalışma Listesi Editör."
    1. "Örnek Adı" doldurun (örn vahşi tip-1), "Örnek pozisyonu" (örneğin, P1-A1), "Yöntem" (örneğin, Formik Acid-Negatif Yöntem) ve "Veri Dosyası" (örneğin, vahşi tip-1) sütun. düğmesi "Kaydet Çalışma Listesi" butonuna tıklayın. "Kütle Spektrometresi Veri Toplama İş İstasyonu" yazılım ve giriş önceden kaydedilmiş Çalışma listesi açın. Sürekli LC-MS ölçümü başlatmak için "Başlat Çalışma Listesi Çalıştır" butonuna tıklayın.
  5. LC sistemi ile TOF spektrometre, bir sütun üzerinde örnekleri Ayrı bir uçuş (TOF) spektrometrenin bir zamana sütun bağlantı ve çift. aşağıdaki gibi, bir mobil faz gradyanı kullanın: 0-2 dak% 85 solvent B; 3-5 dakika, 80% solvent B; 6-7 dk,% 75 çözücü B; 8-9 dk,% 70 çözücü B; 10-11,1 dakika,% 50 çözücü B; 11,1-14 dakika,% 20 çözücü B; ve 14,1-24 dakika,% 5 solvent B; % 85 Çözücü B 10 dakika yeniden dengeleme süresi ve 0.4 ml min-1 bir akış oranı ile sona erer.
  6. Izokratik pompa kullanılarak, aynı anda toplu eksen kalibrasyonu olanak sağlamak için çalışma ile bir referans kütlesi çözeltisi aşılamak.
    NOT: Bu adımStandart TOF spektrometresi kılavuzunda dayanmaktadır.
    1. asetik asit D4 ve heksakis (1H, 1H, 3H-tetrafloropropoksi) referans kütlesi çözeltisi olarak phosphazine gerçek zamanlı kalibrasyonu gerçekleştirmek için karışımını kullanarak. 2.5 ml dak akış hızı ile izokratik pompa -1 infüzyon için kullanılır.

İyon sayar 8. Toplu düzeltme

  1. (1 çoğaltmak, örneğin, vahşi tip) bir toplu düzeltme için bir referans örnek olarak hizmet etmek için herhangi bir örnek belirtin.
  2. Referans numune içindeki tüm metabolitler için iyon sayımı toplamını hesaplar. Tüm numuneler için bu hesaplamayı tekrarlayın.
  3. oranı oluşturmak için, referans numunenin toplam iyon sayımı ile her bir numunenin toplam iyon sayısı bölün.
  4. Her bir metabolit için bir toplu düzeltilmiş iyon sayımı elde etmek için örnek / referans oranı ile bir numune içinde her bir metabolitin iyon sayısı bölün.

9. Peptid Normalleştirme

  1. DHer bir metabolit için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için aşama 6'da BCA analizi peptit konsantrasyonu ile adım 8'de elde edilen her bir numune için seri düzeltilmiş iyon sayım değerlerinin ivide.
    Not: Aşama 9.1'de elde edilen her bir metabolit için normalleştirilmiş, toplu toplu düzeltilmiş iyon sayısı ile doğrudan suşları arasında karşılaştırıldı ve istatistiksel analizi (-test örneğin, bir Mann-Whitney U) tabi tutulabilir. Seçenek olarak ise, bilinen bir metabolit değişmeden ya tedavisi veya genetik arka tarafından ayrışma metabolit nedeniyle değişiklikleri tespit etmek için bir değer olarak kullanılabilir olması. Ekstraksiyon tamponu L-norvalinyl veya gluraric asit, bilinen bir miktarının sisteme duhul edilmesi Örnek işleme 34 boyunca kaybını düzeltmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz zengin, karmaşık ortamda in vitro büyüme sırasında S. aureus hücre içi metabolit havuzları analiz ettik. Prensip kanıtı olarak, karşılaştırıldığında, metisiline duyarlı S. aureus osteomiyelit arasında metabolit profilleri UAMS-1 (vahşi tip [WT]) ve küresel bir transkripsiyonel düzenleyici Cody (Δ codY) 26 eksik izogenik soy izole eder. Protokol aşama 2'de tarif edildiği gibi kararlı durum, WT ve Cody soylarının ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tüm küçük moleküllü metabolitleri merkez metabolik yollardaki ortak kökenli aracılığıyla birbirine bağlanır. üstel büyüme sırasında, bakteriyel hücreler, belirli koşullar altında, fizyolojik durumunun bir görüntü sağlar, biyolojik ve metabolik kararlı halde bulunmaktadır. Cody ilv ve GTP yanıt vererek besin yeterliliğini izler. Ilv ve GTP havuzları damla olarak, Cody aktivitesi büyük olasılıkla artan besin tüketme 30 artan uyum, hedef genlerin ekspresyonunu ayarlama azalır. Bir Cody eksikliği suş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma, bir Kurtuluş Ödülü NIH Pathway (GM 099893 hibe) ve fakülte başlangıç ​​fonları SRB yanı sıra bir Araştırma Projesi Grant (GM 042219 hibe) tarafından kısmen finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayın için çalışmalarını göndermek için karar hiçbir rolü olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme / Ekipman a < / sup>< / güçlü >
DeLong Kültür Şişesi (250 mL)Belco2510-00250
Yan Kol Şişesi, 500 mLPyrex5340
3 delikli Kauçuk Tıpa, #7Fisher14-131E
Paslanmaz Çelik Filtre tutucu / fritVWR89428-936
Petri Kabı, 35 mmCorning430588Doku kültürü ile işlem görmemiş
Karışık selüloz ester membranı, 0.22 & mu; m gözenek boyutuKırlangıç GSWP02500
Darbeye dayanıklı tüpler, 2 mLUSA Scientific1420-9600
Silika Boncuklar, 0,1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Precellys 24 homojenizatörBertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Mikro BCA Protein Test KitiPierce (Thermo Scientific)23235
Cogent Diamond hidrit tip C sütunuAgilent70000-15P-2
Doğru-Kütle Uçuş Süresi (TOF) LC-MS, 6200 SerisiAgilentG6230B
Quat Pompa, 1290 SerisiAgilentG4204A 
Bin Pompası, 1290 SerisiAgilentG4220A 
Valf Tahriki, 1290 SerisiAgilentG1107A 
İzokratik Pompa, 1290 SerisiAgilentG1310B 
TCC, 1290 SerisiAgilentG1316C 
Örnekleyici, 1290 SerisiAgilentG4226A 
Termostat, 1290 SerisiAgilentG1330B 
Kimyasal< / güçlü >
Triptik Soya SuyuBecton Dickinson211825
Difco Agar, GranülBecton Dickinson214530Katı ortam %1,5 [a/h] agar
içerir Fosfat tamponlu salin (pH 7.4) 10xAmbionAM9624Taze olarak ultra saf su
Asetonitrilile 1 katına kadar seyreltinFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MetanolFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; toksik
Formik AsitSigma Aldrich94318Kütle spektrometresi için,% 98
< güçlü > Yazılım< / güçlü >
MassHunterAgilentG3337AA
Bakteriyel SuşTür>SuşGenotip
SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1vahşi tip
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1& Delta; codY::erm
aListelenen kimyasallar ve malzemeler açıklanan yönteme özgüdür ve standart laboratuvar kimyasallarını veya malzemelerini içermez.

Kaynaklar

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767(2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metabolit EkstraksiyonuCodY MutantAspartat AilesiAmino Asit KantifikasyonuBakteriyel MetabolizmaBesin T kenmesi

İlgili makaleler