Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Summary

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Abstract

fare embriyosu veya embriyonik kök hücrelerin (mESCs) gen mühendisliği bir proteinin fonksiyonunun çalışması için izin verir. Proteinler hücrenin workhorses ve genellikle translasyon sonrası modifikasyonlar ile etkilenebilir, birçok fonksiyonel bölgeye oluşmaktadır. koşullu veya kurucu knock-out (KO) farelerde tüm proteinin azalması dikkate bu işlevsel çeşitliliği ve düzenleme almaz. Bir Mesc hattı ve FLPe rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) için bir yanaşma Alanı ROSA26 (R26) bölgesi içinde yer alan içine yerleştirildiği bir türetilen fare modeli, daha önce bildirilmiştir. Burada, çok alanlı bir proteinin farklı işlevleri moleküler diseksiyon için izin veren bir yapı-fonksiyon yaklaşımı hakkında rapor. Bu amaçla, RMCE uyumlu farelere KO fareleri çapraz olması ve daha sonra RMCE uyumlu KO mESCs izole edilmelidir. Daha sonra, farazi kurtarma yapılarının bir paneli RMCE targeti ile R26 lokusu içine sokulabilirng. Aday kurtarma cDNA'lar kolayca rekombinasyon klonlama kullanarak hedefleme vektörünün RMCE siteler arasında eklenebilir. Daha sonra, KO mESCs bir FLPe yeniden bağlayıcı ifade plazmidi ile kombinasyon halinde Hedefleme vektörü ile transfekte edilmiştir. RMCE ROSA26 yerleştirme siteleri promotör-az neomisin direnç genini yeniden etkinleştirir ve doğru hedefleme olayı seçilmesine izin verir. Bu şekilde,% 100'e yakın yüksek hedefleme verimleri yarı yüksek verimli bir şekilde çok sayıda farazi kurtarma yapıları sokulması için izin elde edilir. Son olarak, R26 odaklı kurtarma yapılarının çok sayıda ebeveyn KO mESCs gözlendi fenotipi kurtarmak etme kabiliyetleri açısından test edilebilir. Bu p120 katenin (p120ctn), fenotipik okuma olarak embriyoit organları (EBS) endoderm farklılaşmasını kullanılarak KO mESCs bir kanıt-temel yapı-fonksiyon çalışma sunulmaktadır. Bu yaklaşım önemli etki alanlarının belirlenmesini, varsayılan alt yolları ve hastalıkla ilişki noktasını sağlayanBelirli bir protein için KO fenotipleri altında yatan mutasyonlar.

Introduction

Memeli genomları yaklaşık 20,000 protein kodlama genleri ihtiva olduğu tahmin edilmektedir. Alternatif yapıştırma ve translasyon sonrası modifikasyonlar, protein repertuarı arttırır. Proteinler, modüler bir yapıya ¹ ve genellikle farklı protein kompleksleri halinde kendi işe ve birden fazla hücresel süreçleri ² katılımlarını izin birden fazla etkileşim bölgeleri içerir. Bir örnek p120ctn adlandırılan, çok fonksiyonlu bir proteindir. p120ctn Ctnnd1 geni tarafından kodlanan ve bir N-terminal ve C-terminal bölgesi tarafından kuşatılır geniş bir merkezi armadillonun tekrar alanı oluşur. p120ctn bir armadillonun ala....

Protocol

fareler üzerinde Tüm deneyler, kurumsal, ulusal ve Avrupa hayvan yönetmeliklere göre gerçekleştirilmiştir.

RMCE uyumlu KO mESCs 1. İzolasyonu

1. Böyle ROSALUC fareler ¹⁰ veya ROSA26-iPSC fareler ²¹ olarak RMCE uyumlu farelere, heterozigot KO fareleri Breed. Her iki RMCE uyumlu farelere karışık 129 / C57BL6 / İsviçre arka plan üzerinde muhafaza edilmiştir.
   NOT: heterozigot KO fareleri geçerek homozigot KO farelerde embriyonik öldürücülüğü aşmak için tavsiye edilir.
2. R26 odağına ^12'de bir RMCE kasetini içeren heterozigot KO fareleri seçmek için PCR kullanın.
3. ....

Results

RMCE uyumlu KO Mesc hatları izole etmek için işlem, Şekil 2'de tasvir edilmiştir. İki ardışık breedings RMCE uyumlu KO blastokistlerle almaları gerekmektedir. İlk olarak, heterozigot KO fareleri RMCE uyumlu, heterozigot KO fareleri elde etmek RMCE uyumlu fare ile kesilmişlerdir. Bu fareler, daha sonra RMCE uyumlu 3,5-DPC, homozigot KO blastosistlerin elde etmek üzere başka heterozigot KO fareleri zamanlı eşleştirmesi için kullanılır. Mendel kalıtım ile tahmin edildiği üz.......

Discussion

Bizim Mesc izolasyon yöntemi kullanıcı dostu ve böyle blastosistindeki mikrocerrahi gibi gelişmiş beceri ve gereçlerine gerektirmez. Böylece, bu teknoloji bilim dünyasında büyük bir oranda erişilebilir. Temel hücre kültürü tecrübesi olan herkes ICM çıkıntılar yaymak ve mESCs hatları kurabilir. Ancak, blastosistindeki yıkama ve taşıma biraz pratik gerektirir. Ağız pipet blastosistler aktarmak için kullanılan ve bir mikropipet, bir mikro tutucu, boru ve bir aspiratör ağız parçasının ²⁸ oluşur. Mikr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Evde			donmuş sperm istek üzerine temin edilebilir
Evde			evde dondurulmuş sperm istek üzerine temin edilebilir
Damar probu	Güzel Bilim Araçları	10160-13	çiftleşme tıkaçlarını kontrol etmek için
M2 ortamı	Sigma-Aldrich	M7167	alikotlar yapar ve -20 ° C'de saklar; C
İnce forseps (Dumont #5 Standart uç Öğrenci forseps)	İnce Bilim Araçları	11251-10	kullanmadan önce %70 EtOH püskürtün (otoklav yapmayın)
23 G iğneler	Fine-ject	8697
1 mL şırıngalar	Soft-ject	6680
60 mm bakteri dereceli plakalar (yıkama için)	Gosselin	BB60-01
Evde		ağız pipeti	tartışmaya bakın
Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler, TgN (DR4)1 Jae suşu)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae fareleri	Jackson Laboratuvarı	3208
Mitomisin C	Sigma-Aldrich	M0503
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS)	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J fareleri	İlaç	ile seçilebilir dört gen ve DR4 MEFS içeren JAX 3208 fareleri neomisin, puromisin, higromisin ve 6-tiyoguanine direnç sağlar
%0.1 Jelatin	Sigma-Aldrich	G1393	0,5 g'ı 500 mL damıtılmış suda çözün, otoklavlayın ve 4 ° C'de saklayın.
Tripsin (% 0.25)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Kimyasal	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP koleksiyonu	LMBP 08870	BCCM/LMBP koleksiyonundan (http://bccm.belspo.be) halka açık
cre-eksize edilmiş pRMCE-DV1	BCCM/LMBP koleksiyonu	LMBP 08195	BCCM/LMBP koleksiyonundan (http://bccm.belspo.be) halka açıktır
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
ısı şoku yetkin DH5 & alfa; bakteri & nbsp;	evde
Ağ Geçidi pDONR221 vektör	Thermo Fisher	12536-017	kanamisin dirençli gen
BP klonaz II karışımı	Thermo Fisher	11789-020
LR klonaz II karışımı	Thermo Fisher	11791-020
Luria Suyu (LB)
Ampisilin
Uygulamalı Biyosistemler 3730XL DNA Analiz Cihazı	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofektamin 2000 transfeksiyon reaktifi	Thermo Fisher	11668027
Lipofektamin LTX transfeksiyon reaktifi	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfeksiyon reaktifi	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vektör	Thermo Fisher	A10462	rekombinasyon uyumlu vektör
fare monoklonal anti-p120ctn antikoru	BD Transdüksiyon Laboratuvarları	610134
fare monoklonal anti-Ecadherin antikoru	BD Transdüksiyon Laboratuvarları	610181
Genel ekipman
Steril diseksiyon aletleri			uterusu incelemek için ince makas ve forsepsler
Steril pipetler: 5 mL, 10 mL ve 25 mL
15 mL ve 50 mL konik santrifüj tüpleri
96 oyuklu kültür plakaları V-şekilli alt ve düz taban)
Kültür kapları: 24 kuyu, 12 kuyu ve 6 kuyu
Çok kanallı pipetler (30, 50, 100 ve 200 &mu pipetlemek için; L)
Steril çok kanallı rezervuarlar
Laminer hava akışına
37 ° C'de bir inkübatöre erişim; %5 CO2
içeren C Ters çevrilmiş bir mikroskoba
erişim Tezgah üstü santrifüje
İletim ışıklı bir stereo mikroskoba erişim
Culture media
MEF Medium			4 & derecede saklanır; C; 37 ° C'de 30 dakika sıcak; Dulbecco'yu kullanmadan önce C
s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)	Gibco	41965-062
% 10 fetal sığır serumu (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamin (2 mM)	Gibco	25030-024 & nbsp;
Sodyum piruvat  (0,4 mM)	Gibco	11360-039
penisilin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomisin (100 & mikro; g / mL)	Gibco	15140-122 & nbsp;
SR tabanlı mESC medium			4 & derecede saklanır; C; 37 ° C'de 30 dakika sıcak; C kullanmadan önce
DMEM / F12	Gibco	31330-038	1: 1 oranında
% 15 nakavt serum replasmanı (SR)	Gibco	10828 & ndash; 028
L-glutamin (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler	Gibco	11140-050
penisilin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomisin (100 & mikro; g / mL)	Gibco	15140-122 & nbsp;
β-merkaptoetanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2.000 U/mL rekombinant fare LIF	(IRC / VIB Protein Servis tesisi)
< güçlü >< em > FBS tabanlı mESC ortamı (SR tabanlı mESC ortamına benzer) < / em >< / güçlü >			4 derecede saklanır; C; 37 ° C'de 30 dakika sıcak; C kullanmadan önce
Nakavt DMEM	Gibco	10829-018
%15 FBS	Hyclone	SH30070.03E
Diferansiyel Ortam			4 ° C'de saklanır; C; 37 ° C'de 30 dakika sıcak; C kullanmadan önce
Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
%15 FBS	Hyclone	SH30070.03E
%5 CD Hibridoma Ortamı(1x) sıvı	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamin	Gibco	25030-024 &
0.4 mM 1-tiogliserol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 & mu; g / mL askorbik asit	Sigma-Aldrich	A-4544 & nbsp;
penisilin (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomisin (100 & mikro; g / mL)	Gibco	15140-122 & nbsp;
<>2i
1 μ M Erk inhibitörü PD0325901	Akson Medchem	Akson 1408
3 μ M Gsk3 inhibitörü CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386