Yöntem makalesi

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

DOI:

10.3791/55634

⸱

10 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser, kök hücre kaynaklı bir hastalıktır ve bu hücrelerin ortadan kaldırılması önemli bir terapötik hedeftir. Kanser Kök Hücrelerinin (CSC) zayıf yönlerinin çözülmesi ve uygun moleküler hedeflerin belirlenmesi, hücre çizgileri ve ex vivo tümör dokusu gibi heterojen örneklerde spesifik ayrımcılığa izin veren yöntemlere dayanmaktadır. Akış sitometrisi / FACS, tek hücreli seviyede biyolojik numuneleri çok parametrik olarak incelemek için güçlü bir teknolojidir ve aşağı akım analizleri için canlı hücrelerin geri kazanılması için seçilen yöntemdir. CD44 ve CD133 gibi yüzey markörlerinin yanı sıra aldehit dehidrogenaz enzimatik aktivitesinin saptanması, FACS tarafından tümör numunelerinden CSC'lerin tanımlanması ve sınıflandırılması için sıklıkla kullanılmaktadır. Metodolojik detaylarda burada açıklanan tamamlayıcı bir yaklaşım, genellikle yan popülasyon (SP) olarak adlandırılan farklı floresan-dim hücrelerinin bir popülasyonunu tanımlayan ABC ilaç taşıyıcıları ile fonksiyonel boya ekstrüzyonunu kullanmaktadır. SPKanser hücreleri kanonik kök hücre özellikleri sergiler ve boya ekstrüzyon ilaç taşıyıcısını (en sık ABCBl / P-glikoprotein / MDR1 / CD243 ve ABCG2 / Bcrp1 / CD338) inhibe eden ajanlar kullanılarak yok edilebilir ve işlevsel olarak teyit edilebilir. Üstelik SP testi, yüzey antijenlerinin boyanması, aldehid dehidrogenaz tespiti ve ölü hücre ayrımcılığı ( örneğin , 7-AAD veya propidyum iyodür (PI)) gibi diğer akış sitometrik değerlendirmeleriyle uyumludur. Bu nedenle, mekanik olarak fenotipik bir parametreden ziyade işlevsel olan CSC tanımlama, izolasyon ve alt karakterizasyon için değerli ve geniş bir şekilde uygulanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Başlangıçta tetikleyici boya olarak Hoechst 33342 ile yapılmış olsa da, burada, mor renkli bir lazer kaynağı ile donatılmış herhangi bir akış sitometresinde çözülebilen daha yeni olan Violet boya dayalı SP fenotipine odaklanırız.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer kanser terapilerinin etkinliği, hastalığın genetik ve moleküler anlayışındaki gelişen ilerlemeler ve terapötik antikorlar ve küçük molekül inhibitörleri gibi hedefli ilaçların ortaya çıkması nedeniyle son on yılda önemli ölçüde iyileşmiştir. Aksine, metastatik ve tekrarlayan hastalık halen tedavi edilemez durumdadır ve morbidite ve mortalite bu klinik ortamlarda yüksek kalmaya devam etmektedir. CSC'ler tümörler içinde ayrı bir alt popülasyonu temsil eder ve klonojenisite / tümöre özdeşlik, çoklu ilaç direnci ve asimetrik hücre bölünmesi 1 , 2 gibi kanonik kök hücre özellikleri ile donatılırlar. Böylelikle, KKSler metastatik ilerlemeyi ve tümör heterojenliğini yönlendirmekle kalmaz aynı zamanda hastayı nüksetmeye yatkınlaştırmak için tedavi sırasında da devam eder. Terapötik CSC eliminasyonu, hastalık tekrarını önlemek ve kanserin uzun süreli iyileşmesine izin vermek için önemli tıbbi bir ihtiyaçtır 3 .

Koruma açığının tanımlanması ve CSC'lerin ortadan kaldırılması için stratejilerin aydınlatılması, sonraki ekspresyon profillemesi ve / veya fonksiyonel inceleme için biyolojik numunelerden arındırılmalarına izin veren yöntemlere bağlıdır. Bunun gibi yöntemler, bu hücrelere özgü yüzey, hücre içi veya işlevsel belirteçlere dayanır. CSC'ye spesifik yüzey işaretleyiciler arasında CD44, CD133, CD24 ve CD90 bulunur ve bunlarla sınırlı olmamak üzere meme kanseri ve kolon kanseri de dahil olmak üzere çeşitli tümör varlıklarındaki CSC popülasyonlarını tanımlamak için kullanılırlar. Bir başka markör olan aldehit dehidrogenaz (ALDH), hücre içi lokalizasyonu gösterir ve enzimatik dönüşümü ışık üreten ilgili bir substrat sağlayarak fonksiyonel olarak tespit edilebilir. Bu testi kullanarak CSC popülasyonları çeşitli tümör varlıklarında da tespit edilmiştir 5 . Tamamlayıcı bir yöntem, genelde SP analizi olarak anılır ve burada m olarak tasvir edilir. Etodolojik detay, 6 , 7 , 8 floresan-loş gövde benzeri hücrelerin küçük popülasyonlarını tanımlamak için ABC ilaç taşıyıcıları tarafından aktif boya akışı kullanmaktadır. Bunu sağlamak için belirli bir numune, pasif difüzyon yoluyla tüm hücrelere giren ve bağlanma için nükleer ve mitokondriyal DNA'yı hedefleyen bir lipofilik DNA bağlama floroforunun mevcudiyetinde inkübe edilir. ABC ilâç taşıyıcısı ifadesi bulunmayan CSC'ler boya biriktirerek parlak floresans oluştururken, CSC aktif olarak flüoresansı düşüren boyayı sıkıştırır. İlaç taşıyıcı aktivitesinin farmakolojik olarak inhibisyonu, SP fenotipini ortadan kaldırır ve işlevsel olarak teyit eder ve kontrol amaçlı kullanılmalıdır. SP özelliklerini sergileyen CSC popülasyonları diğerlerinin yanı sıra yumurtalık kanseri 9 , 10 , prostat kanseri 11 ,> 12, meme kanseri 13 , akciğer kanseri 14 , endometriyal kanser 15 , gliom 16 , 17 ve kemik sarkomu 18 . Önemli bir şekilde, spesifik bir tümör hücresi ayrımcılık stratejisi (bazı konakçı hücre popülasyonları da SP özellikleri sergileyebilir) gibi birincil materyal ilave zorluklar ortaya koymasına rağmen, SP testi hem kanser hücre hatları hem de primer tümör dokusu ile uyumludur .

En çok bilinen iki SP taşıyıcı ilaç taşıyıcısı ABCBl / P-glikoprotein / MDRl / CD243 ve ABCG2 / Bcrpl / CD338 8,9,21; Bununla birlikte, diğer ilaç taşıyıcıları SP fenotipinin de bir moleküler belirleyicisi olabilir ( örn. , ABCB5) 22 . ABCB1Verapamil ile etkin bir şekilde bloke edilebilirken, ABCG2'nin aktivitesi fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 ile özel olarak kaldırılabilir. SP analizinin belirli bir gücü, diğer lekelenmelerle ( örneğin , yüzey markörleri ve ALDH) birlikte kullanılabilmesi ve canlı hücre geri kazanımının, bu nedenle aşağı akışlı fonksiyonel araştırmalarla uyumlu olmasını sağlamasıdır. Dahası, SP algılama CSC popülasyonları 9 , 23 arasında ABC ilaç taşıyıcılarının yüksek korunması nedeniyle genel olarak uygulanabilir.

Başlangıçta, SP algılama, tetikleyici bir boya 24 olarak Hoechst 33342 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu boya mükemmel bir çözünürlük sağlar, ancak ultraviyole lazer uyarımını gerektirir; Dolayısıyla uygulanabilirliği doğal olarak ileri teknoloji akış sitometri aletleri ile sınırlıdır. DyeCycle Violet (DCV) 25'in ortaya çıkışı yeni avenu açtı.Sp analizleri için geliştirilmiş ve ultraviyole lazer kaynağı olmayan standart akış sitometrik enstrümanlarına (DCV-SP hücrelerini çözmek için mor bir lazer kaynağı yeterlidir) uygulanabilirliğini genişletmiştir. Önemlisi, Hoechst 33342 ve DCV, ortak pompa özgüllüklerini paylaşır, bu da boyanın aynı hücre popülasyonlarını tanımlaması gerektiğini gösterir.

Burada, bağımsız laboratuvarlarda hızlı ve kolay üreme için DCV'ye dayalı SP analizinin ayrıntılı bir deneysel protokolünü sunuyoruz. Yazıyı, bu yararlı hücre biyolojik yönteminin optimizasyonuna ve standardizasyonuna katkıda bulunması gereken CSC araştırmacıları için bir kaynak olarak algılıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, standart Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu yönergelerine tamamen uygundur. Burada gösterilen protokol kullanılarak insan veya hayvan dokusu araştırılırsa, araştırmacılar kendi kurumlarının veya ülkelerinin ilgili inceleme kurullarından onay almakla yükümlüdürler.

Dikkat: Biyolojik örneklerin güvenli bir şekilde taşınması için standart önlemler bu protokol için geçerlidir. Buna eldiven ve laboratuvar ceketi giymeyi ve mümkün olduğunda biyogüvenlik kabini altında çalışmayı da kapsar.

1. Hücrelerin Hazırlanması

  1. Kanser hücre dizileri
    1. Uygun bir insan veya fare kanseri hücre hattını, 10-30 mL uygun ortamda ( örn. ,% 10 ( h / h ) FBS, 2 mM L-glutamin ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş RPMI 1640) 37 ° C'de kültürleyin ve hasat edin % 0.05 tripsin-EDTA veya başka bir de-att ile sindirimi kullanarak alt konfluenttaki hücreler ( yani % 70-90)Renklendirme prosedürü. Hücre sayısını belirleyin ve bir sayım odası ve tripan mavisi boyaması kullanarak canlılığı kontrol edin. Canlı hücrelerin fraksiyonu% 85'i aşmalıdır.
      NOT: SP bölmelerini barındıran insan kanser hücre dizilerinin örnekleri MCF7 / HTB-22 ve SKBR3 / HTB-30 (göğüs kanseri), A2780 ve SKOV-3 / HTB-77 (yumurtalık kanseri) ve A549 (akciğer kanseri) 26'yı içerir.
  2. Ex vivo tümör dokusu
    1. Yeni bir cerrahi tümör örneği alın veya alternatif olarak, nakledilebilen veya genetik olarak tasarlanmış fare tümörü modelinden tümör dokusunu toplayın. 200-1000 mg dokuyu alın ve mekanik ayrıştırma ( örn. , Makas veya bisturi kullanarak) ve enzimatik sindirime ( örn. , Bir kollajenaz / dispase / DNaz kokteyl kullanarak) tek bir hücre süspansiyonu üretin.
    2. Numuneyi 70 μm'lik bir kesme süzgeci ile süzün. Hücre sayısını belirleyin ve bir sayma odası ve trypan bl kullanarak canlılığı kontrol edinUe boyama.
      NOT: Sindirim kokteylleri sıklıkla 200 μg / mL kollajenaz P, 0.8 U / mL dispaz ve 25 ug / mL DNase I içerir ve inkübasyon süreleri tipik olarak 20 - 50 dakika arasında değişir. İdeal olarak, doku parçalanması, araştırılan doku için optimize edilmiş bir protokole göre gerçekleştirilir 27,28,29.

2. Test Örnekleri

  1. Hücre konsantrasyonunu, taze kültür ortamında 1 x 10 6 hücre / mL'ye ayarlayın (boya ekstrüzyonu aktif bir enerji tüketen işlem olduğundan, besin maddesi içeren bir araç önemlidir). Son olarak, 1 mL numuneyi sıradan bir akış sitometrisi / FACS yuvarlak tabanlı tüpe ('test' etiketli) aktarın.
    NOT: En iyi sonuç için, hücre konsantrasyonunun titrasyona tabi tutulması gerekebilir (örneğin 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 10 6 hücre / mL) fakat daha düşük bir hücre konsantrasyonu genelDaha yüksek çözünürlük 19 verir. Sadece maksimum sayıda SP hücresi bulunacağı uygulamaların sınıflandırılması için hücre yoğunluğunu 1 x 107 hücre / mL'ye yükseltmek önerilir.
  2. Numuneye 10 uM DCV ekleyin ve hafifçe vorteksleme veya 3-5x yeniden süspansiyon ile iyice karıştırın. İnhibisyon kontrollerine geçin.
    NOT: Optimal sonuçlar, tetikleyici boyanın titrasyonuna (örneğin 2,5; 5; 10; 20 μM) bağlı olabilir, ancak daha yüksek bir boya konsantrasyonu genellikle daha yüksek bir çözünürlük 19 verir.

3. İnhibisyon Kontrolleri

  1. Boya içeren hücre süspansiyonundan 250 μL yeni bir akış sitometresi / FACS yuvarlak tabanlı tüp ('kontrol' etiketli) aktarın. Verapamil veya 50 μM FTC ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
    NOT: Verapamil ve FTC, SP analizinde en iyi bilinen inhibitörlerdir, ancak farklı efflux pompa özelliklerine sahiptirlerY: Verapamil, ABCB1 ve ABCB5 de dahil olmak üzere birçok ABC ilaç taşıyıcısını inhibe ederken, FTC ABCG2 6 , 19 için spesifiktir. Tek bir numunenin SP durumu bilinmiyorsa, ayrı tüplerde verapamil ve FTC'nin kullanılması önerilir.

4. Boyama

  1. Hem 'test' hem de "kontrol" tüplerini kaplayın ve 15 dakikada karıştırmayla yavaş yavaş karanlıkta 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. SP hücrelerindeki boya ekstrüzyonunun çoğu ilk 45 dakikada gerçekleşir, ancak SP olmayan hücrelerdeki boya birikimi (çözünürlüğe katkıda bulunur) yalnızca 75-90 dakika sonra maksimumdır19.
  2. Boyama tamamlandıktan sonra, hücreleri 3-4 mL buz soğukluğunda PBS içinde yıkayın ve 100 ul (PBS) hacmindeki pelleti tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreleri karanlıkta tutun ve buz üzerinde soğutun ve ek belirteçlerin boyanmasına devam edin. Alternatif olarak, doğrudan akış sitometrisierimesi görülmüştür.

5. Diğer İşaretçiler İçin Maliyetlendirme

  1. DCV lekeli hücrelere fluorokrom-konjuge antikorlar istenen bir panel ekleyin, iyice karıştırın ve hücreleri 4 ° C'de 20-30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin. Hücreleri 3-4 mL buz soğukluğundaki PBS'de yıkayın ve ölü hücre ayrımcılığına geçin.
    NOT: DCV ile kolayca uyumlu ve neredeyse tazminat gerektirmeyen antikor formatları arasında PerCP veya PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 ve BV786 bulunur . DCV ile uyumlu ancak telafi gerektirebilecek formatlar arasında FITC, Alexa Fluor 488, PE ve BV650 bulunur. DCV ile hemen hemen uyumlu olmayan formatlar BV421, V450 ve V500'ü içerir.
  2. DCV lekeli hücrelere, belirli üreticinin önerdiği konsantrasyonda 7-AAD (veya PI) ekleyin ve örnekleri karanlıkta 5-10 dakika inkübe edin. Örnekleri 70 μm'lik kesme süzgeçleri yoluyla filtreleyin ve akış sitometrik analizlere geçin.

6. Akış Sitometrik Analizi

NOT: Lekeleme işlemi sırasında ilgili akış sitometrini açmanız önerilir, böylece her şey örnek hazırlanır hazırlanır ayarlanır. Buna, sistem performans takibi ve tank dolum gibi standart bakım prosedürleri dahildir.

  1. Akış sitometresindeki hücreleri elde edin ve bunları iki değişkenli FSC / SSC nokta arsa üzerinde (Şekil 1B) kaplatın. FSC'nin farklı sinyallerini ( yani yükseklik, genişlik, alan) karşılaştırarak çiftler ve agregaları hariç tutun (Şekil 1C).
    1. Ölü bir hücre işaretçisi dahil edilmişse canlı hücre fraksiyonuna geçin ( ör . 7-AAD-negatif) ( Şekil 1D ). 'Mavi' ve 'kırmızı' DCV emisyonu için iki değişkenli nokta arsa üzerinde canlı tekli hücreleri görselleştirin. Bu amaçla, y ekseni üzerinde ( örneğin , 450/50) 'mavi' floresans kanalını ve 'Kırmızı 'floresans kanalı ( örn. , 525/50).
    2. Her iki kanalı doğrusal moda geçirin ve SP, sol alt çeyrekte arsa tarafına yerleşecek şekilde dedektör voltajlarını buna göre ayarlayın. Tersine, SP olmayan hücre döngüsü dağılımını (G1 ve G2) yansıtan arsa sağ üst çeyrekte bulur. SP'yi kaplatın ve edinimi durdurun ( Şekil 1E ).
      NOT: DCV tanımlı SP hücreleri, mor bir lazer uyarma kaynağı ( yani , 405 nm lazer hattı) ile donatılmış akış sitometrik aletler kullanılarak tespit edilebilir. SP analizinden spesifik olan, yayılan floresansın lineer modda ve iki değişkenli nokta arsa üzerinde görüntülenen iki ayrı kanalda ölçülmesidir. DCV'nin 'mavi' emisyonu yaklaşık 450 nm'de ölçülür ( örn. , Bir 450/40 standart filtre ile) ve DCV'nin 'kırmızı' emisyonu yaklaşık 510 - 585 nm'de ölçülür ( örn. , Bir 510/50, bir 525/50 veya 585/15 filtre) 19 . Analizin özel kimyası nedeniyle, SP ve non-SP hücreleri arasındaki ayrım genelde 'kırmızı' floresan kanalı 19'da daha yüksektir.
  2. Engelleme kontrollerini yükleyin ve verileri alın. SP hücreleri şimdi ortadan kayboldu ya da büyük oranda azaltıldı ( Şekil 1F ). Gerekirse, bu verilere dayalı olarak SP kapısını rafine edin.
  3. SP hücreleri tarafından yüzey markörü ekspresyonunu araştırmak için DCV'nin 'kırmızı' floresanını x ekseni üzerine bırakın ve logaritmik modda ( örn . APC) y ekseni üzerinde ilgili bir flüoresan kanalı gösterin. Dedektör voltajlarını buna göre ayarlayın ve araştırılan markör (ler) için pozitif boyanan SP hücrelerinin fraksiyonunu ( Şekil 1G ) kaplatın. SP hücreleri tarafından belirli bir işaretleyicinin birlikte ekspresyonu, arsa 30'un sol üst kadranda ilgili bir sinyal verir.
  4. KaydetmekSP hücrelerini veri ve / veya sıralayabilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A2780 hücrelerinin temsili bir SP analizi, daha önce% 1'den daha az hücrenin muhasebeleştirilmesi için bir SP'yi barındırdığı gösterilen bir insan yumurtalık kanseri hücre hattının sağlanmasıdır 9 . Hücreler,% 10 ( h / h ) FBS, 2 mM L-glutamin ve 1 x penisilin / streptomis ile takviye edilmiş RPMI 1640 içinde 37 ° C'de kültürlendi ve% 0.05'lik tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak% 85 konfluansa hasat edildi. Hücreler PBS içinde yıkandı ve 70 um kesme süzg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanserin klinik yönetimindeki ilerleme, CSC'leri hedef alan tedavi yöntemlerinin gelişimine bağlıdır. CSC'lerin biyolojik numunelerden güvenilir şekilde izole edilmesine izin veren yöntemler, uygun hedeflerin belirlenmesini hızlandıracak ve bu nedenle bu çabanın kritik önemi altındadır. SP analizi, ABC ilaç taşıyıcılarını ifade eden CSC popülasyonlarını tanımlamak için kurulmuş ve değerli bir tekniktir ve DCV'nin uygulanması, standart akış sitometrik araçlarına uygulanabilirliğini genişletmiştir. Mekaniksel ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yoktur. Yazının hazırlanmasına yazarın da katkısı yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maximilian Boesch, Avusturya Bilim Fonu FWF (hibe numarası J-3807) bir Erwin Schrödinger Kardeşliği tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Vybrant DyeCycleViolet Thermo Fisher ScientificV35003Kullanıma hazır
Verapamil hidroklorürSigma-AldrichV4629Etanol
Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054DMSO
7-AAD (veya propidyum iyodür - PI)BioLegend420403 Kullanıma hazır
Standart hücre kültürü reaktifleri (örn., orta, FBS, L-glutamin, antibiyotikler, PBS, tripsin-EDTA, etc.)Farklı tedarikçiler
İlgilenilen numune/hücreler (örn., insan veya murin kanseri hücre hattı, insan veya murin tümör dokusu)Farklı tedarikçiler
Akış sitometrik cihazı (FACS; analizör veya hücre sıralayıcı)Farklı tedarikçilerMenekşe lazer kaynağı gerekli
FACS tüpleri (yuvarlak tabanlı)Farklı tedarikçilerKapaklı tüpler
önerilir 70 ve mikro; m kesme süzgeçleriFarklı tedarikçilerİsteğe bağlı ancak önerilen
Sindirim enzimi karışımı (örn., kollajenaz/dispas/Dnase)Farklı tedarikçilerSadece doku ayrışması ile ilgilidir
İlgilenilen yüzey belirteçlerine karşı flurokrom konjuge antikorlarFarklı tedarikçilerOpsiyonel
ALDEFLUOR KitiSTEMCELL Teknolojileri01700Opsiyonel
içinde çözün içinde çözün

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
  2. Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
  3. Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
  4. Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
  5. Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
  6. Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
  7. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  8. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  9. Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
  11. Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
  12. Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
  13. Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
  14. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  15. Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
  16. Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
  17. Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
  18. Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
  19. Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389(2016).
  20. Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
  21. Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
  22. Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
  23. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  24. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  25. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  26. Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
  27. Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532(2015).
  28. Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633(2011).
  29. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088(2014).
  30. Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
  31. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  32. Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiBoya Ekstr zyonuABC Ta y c larMenek e Boya DeneyiH cre Safla t rmaY zey Belirte leriAldehit DehidrogenazGen Ekspresyon Profili Olu turma

İlgili makaleler