Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

Summary

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Abstract

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, topluluk üyelerinin mekansal dağılımını ve faaliyetlerini önemli ölçüde değiştirebilen karmaşık deterministik ve stokastik faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Binlerce bakteri topluluğunu paralel olarak hızlı bir şekilde bir araya getirmek ve izlemek için kullanılabilecek bir mikro kollu dizi platformu geliştirdik. Bu protokol, platformun kullanımını vurgular ve platform içindeki dizilerin bir topluluğunda basit, iki üyeli toplulukların gelişimini optik olarak izlemek için kullanımını açıklar. Bu gösteri, Tip VI salgı patojenisitesini incelemek üzere geliştirilen bir dizi mutantın bir parçası olan Pseudomonas aeruginosa'nın iki mutantını kullanıyor. MCherry veya GFP genlerinin kromozomal girdileri, her bir mikrowell içindeki topluluk üyelerinin bolluğunu ve konumunu izlemek için kullanılabilen farklı emisyon dalga boylarına sahip floresan proteinlerin yapılı ifadesini kolaylaştırır. Bu protokol ayrıntılı bir metodu açıklamaktadır.D, bakteri karışımlarını dizinin kuyularına monte etmek ve zaman içindeki tüm üye popülasyonun göreli büyümesini ölçmek için zaman atlamalı floresans görüntüleme ve niceliksel görüntü analizi kullanmak için kullanılmıştır. Mikro platformun tohumlanması ve montajı, dizi içindeki mikrobik toplulukların kantitatif analizi için gerekli görüntüleme prosedürleri ve mikrobik tür alanları arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmak için kullanılabilecek yöntemlerin hepsi tartışılmıştır.

Introduction

Mikrobiyal topluluklar, hem hücre ölümü, bölünme, protein konsantrasyonu, organel sayısı ve mutasyon ¹ ile ilişkili olan ortamın yapısı ve stokastik süreçler gibi belirleyici faktörler tarafından şekillendirilir ¹ . Doğal ortamda, bu etkilerin toplumdaki bileşimi ve etkinliği üzerindeki bireysel etkisini çözümlemek neredeyse imkansız olabilir. Doğal yapılar tarafından örtülmüş ve kimyasal ve biyolojik bir ortamda gömülmüş, topluluk üyelerinin tanımlanması ve doğal çevre içerisinde zaman-zaman dağılımının daha da çözülmesi son derece zorlu bir konudur. Bununla birlikte, son zamanlardaki çabalar, mekânsal organizasyonun t....

Protocol

1. Silicon Microwell-array Fabrikasyon

1. Parylene kaplama
   1. Üreticinin spesifikasyonlarına ve talimatlarına (ayar: buharlaştırıcı set değeri = 160 ° C; fırın ayar noktası = 650 ° C) göre ticari olarak mevcut bir parylene kaplama sistemi kullanılarak silisyum levhalar üzerine 1-1.5 um parylene N arasında birikim yapın.
      NOT: Bir odaya yüklenen yaklaşık 6 gr parylene N, 1-1.5 μm kalınlığında kaplamalar üretir.
2. Fotolitografi
   1. Parylene N kaplı gofretleri 45 s süreyle 3.000 rpm'de yapışma arttırıcı,% 20 heksametildisilazan (HMDS) ve% 80 propilen glikol monometil eter asetat ....

Results

Burada sunulan deney platformu, bakteri topluluklarının yüksek verimli ve yüksek içerikli çalışmaları için tasarlanmıştır. Tasarım, çeşitli büyüklükteki kuyulardan büyüyen binlerce topluluğun aynı anda analiz edilmesini sağlıyor. Bu mikrodellek dizilimi tasarımı ile, nihai topluluk bileşiminin ilk ekim yoğunlukları, iyi boyut ve kimyasal çevre üzerindeki bağımlılığı belirlenebilir. Bu çalışma, mikrodalgalı dizide iki üyeli bir toplumun büyümesini ve topluluk yapısını ve organizasyonunu a.......

Discussion

Bu makale, bakteri topluluğunun gelişiminin yüksek verimli ve yüksek içerikli canlı hücre görüntüleme tabanlı analizini mümkün kılmak için tasarlanmış bir mikrodalkaralı dizi cihazı ve deney protokollerini sundu. Buradaki gösterinin odağı, temas yoluyla aracılık edilen Tip VI sekresyonun topluluk gelişimine etkilerini incelemek iken, diziler esnek olacak şekilde tasarlandı ve geniş bir mikrobik topluluklar mikrobik-mikrop etkileşimleri çalışmasına uyacak şekilde tasarlandı. Buradaki çalışma, yalnızca üyelik bolluğunun v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Parilen N	Özel Kaplama Sistemleri	CAS NO.:1633-22-3
Parilen kaplayıcı	Özel Kaplama Sistemleri	Labcoter 2 Parilen Biriktirme Ünitesi PDS2010
Silikon Gofret	WRS Malzemeleri	100mm çap, 500-550μ m kalınlık, Prime, 10-20 direnç, N/Fos< 100>,
yapışma arttırıcı	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 yapışma arttırıcı
pozitif tonlu fotorezist	Rohm ve Haas Electronics Materials LLC (Dow'a aittir)	Microposit S1818 Pozitif Fotorezist (kod 10018357)
Quintel Kontak Hizalayıcı	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Maske Hizalayıcı
Reaktif İyon Aşındırma	Aracı Oxford Aletler	Plasmalab System 100 Reaktif İyon Aşındırıcı
R2A Et Suyu	TEKnova	R0005
Sığır Serumu Albümin	Sigma	A9647
Çok Modlu Plaka Okuyucu	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Floresan Mikroskop	Nikon	Eclipse Ti-U
Otomatik Aşama	Önceki	ProScan III
CCD kamera	Nikon	DS-QiMc
Sahne üstü çevre kontrol odası	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Fosfat Tamponlu Tuzlu	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agaroz	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 lamel	Nexterion	Yüksek performans #1.5H lameller
Floresan Referans Slaytları	Ted Pella	2273
Fiziksel Stylus Profilometre	KLA Tencor	P-6
laboratuvar mendilleri	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155
ticari yazılım	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Konfokal Mikroskop	Zeiss
filtre küpleri	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)