Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Min Sung Joo; Ja Hyun Koo; Sol-Bi Shin; Hyungshin Yim; Sang Geon Kim

doi:10.3791/55708

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55708

⸱

18 Mayıs 2017

Min Sung Joo¹ , Ja Hyun Koo¹ , Sol-Bi Shin² , Hyungshin Yim² , Sang Geon Kim¹

¹College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, ²College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

Bu makalede

Özet

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Özet

Belirli bölgelerdeki protein fosforilasyonu, konformasyonunu ve diğer moleküllerle olan etkileşimini belirler. Böylece protein fosforilasyonu, hücrenin biyolojik işlevlerini ve özelliklerini etkiler. Günümüzde, fosforilasyon alanlarını keşfetmek için en yaygın yöntem, hızlı ve hassas bir yöntem olan sıvı kromatografi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Bununla birlikte, nispeten kararsız fosfat kısımları sıklıkla sahte-negatif sinyaller üreten parçalanma aşaması esnasında fosfopeptidlerden salınmaktadır. Bu gibi durumlarda , bölgeye yönelik mutantları kullanan geleneksel bir in vitro kinaz tahlili daha doğru olur, ancak bu yöntem zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, peptid rekabetini kullanan alternatif bir yöntem avantajlı olabilir. 5 'adenosin monofosfat aktive protein kinaz (AMPK)' nın konsensüs tanıma motifi ¹ olarak belirlenmiş ve pozisyonel tarama peptit kütüphanesi eşeği kullanılarak onaylanmıştır^2. ay. Böylece, yeni bir substrat için AMPK fosforilasyon bölgeleri peptid rekabet deneyleri ile öngörülebilir ve teyit edilebilir. Bu raporda, AMPK aracılı nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2 (Nrf2) fosforilasyonunu örnekleyerek, in vitro oligopeptidle rekabet eden kinaz tahlili için ayrıntılı adımları ve prosedürleri açıklıyoruz. Fosforilasyon sahasının kimliğini doğrulamak için, bir bölgeye özgü mutant kullanarak ardışık in vitro kinaz deneyi gerçekleştirdik. Genel olarak, peptit rekabet tahlili, çoklu potansiyel fosforilasyon bölgelerini taramak ve fosforilasyon bölgesi mutantları tarafından geçerlilik için siteleri belirlemek için bir yöntem sağlar.

Giriş

Belirli bir tortuda protein fosforilasyonu çok çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sinyalleme ağlarının anlaşılması, spesifik fosforilasyon sahalarının tanımlanmasını gerektirir. Buna ek olarak, fosforilasyon bölgesi protein işlevindeki etkiyi belirler, çünkü bir proteindeki tekli alanlar farklı yapılara ve işlevlere sahiptir. Anahtar bir antioksidan transkripsiyon faktörü olan nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) aktivitesi, farklı bölgelerdeki fosforilasyon yoluyla iki yönlü olarak düzenlenir. Çalışmalarımız, Nrf2'nin fosforilasyonunu katalizleyen kinazlara odaklanmıştır. Nrf2'nin oksidatif meydan okumaya karşı....