Yöntem makalesi

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku'ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

DOI:

10.3791/55818

⸱

30 Haziran 2017

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parakrin sinyal vasıtasıyla vasküler fonksiyonların büyük düzenleyicisi olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT) genişlemesi, obezite sırasında hipertansiyonun gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Hipertrofi ve hiperplazinin derecesi, depo yer, cinsiyet ve mevcut Adiposit Progenitör Hücre (APC) fenotiplerinin türüne bağlıdır. Son 10 yılda APC ve preadipositler izolasyonu için kullanılan teknikler, spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak tek tek hücrelerin tanımlanabileceği doğruluğunu büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, APC ve adipositlerin izolasyonu, özellikle hücrelerin hücre kültürü uygulamaları için muhafaza edilmesi gerekiyorsa, hücrenin kırılganlığından dolayı bir meydan okuma olabilir.

Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma ( MCS), yağ dokusunun ağırlık birimi başına daha fazla canlı APC'yi izole etmek için bir yöntem sağlar. MCS tarafından hasat edilen APC, preapeni genişletmek için in vitro protokoller için kullanılabilirDipositleri ve büyüme faktörü kokteyllerini kullanarak hücreler tarafından tutulan üretken ve adipojenik potansiyelin analizine izin vererek adipositlere ayırdık. Bu deney genişleme sırasında kardiyovasküler hastalığın gelişiminde kilit rol oynayan aortik ve mezenterik PVAT depoları üzerine odaklanmıştır. Bu protokoller, APC'nin tanımlanmış bir popülasyonunu izole etmek, genişletmek ve ayırmak için kullanılan yöntemleri tanımlamaktadır. Bu MCS protokolü, hücrenin sınıflandırılmasına minimum ekipman veya eğitimle ihtiyaç duyulan herhangi bir deneyde izolasyonun kullanılmasını sağlar. Bu teknikler, hücre yüzeyi markörlerinin varlığına dayanan spesifik hücre popülasyonlarının işlevselliğini belirlemek için ileri deneylere yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perivasküler Adipoz Doku (PVAT), kan damarlarına yakın olması nedeniyle damar sistemi fonksiyonu 1'de önemli parakrin sinyal bileşenidir. Bu yağ dokusunun genleşmesi, 2 , 3 mevcut Adiposit Progenitör Hücrelerinin (APC) fenotipine bağlıdır. Primer adipositler kırılgan, yüzen ve aralıklı olduğundan, yağ dokularından hücrelerin izolasyonu zordur. Bazı izolasyon teknikleri aynı zamanda hücrelerin bütünlüğünü koruyan bir protokolün önemini vurgulayan, inflamatuvar protein sentezini arttırarak ve adipogenik gen ekspresyonunu azaltarak hücre fenotipini ve morfolojisini değiştirebilir.

Birincil hücrelerin kültürü ve spesifik preadiposit alt popülasyonları, in vivo büyümeye indirgemeci bir yaklaşım sağlar ve eşdeğer hücresel genetik yapıyı korur 5 , ancak tiYaşlanma, ya da yaşlanma 6 ile bozulma nedeniyle bu hücrelerle beni sınırlıdır. Deri altı ve omental depolar da dahil olmak üzere çeşitli yağ depolardan preadipositler, spesifik anatomik bölgelerden hücrelerin toplanmasının önemini vurgulayan proliferasyon 7'deki farklılıkları da gösterir. PVAT dışı beyaz yağ depolarından öncül hücreler önceki çalışmalar 7 , 8 , 9'da karakterize edilmiştir, ancak PVAT APC fenotipleri hakkında daha az bilgi bilinmektedir.

Burada açıklanan teknikler, morfolojileri, yaşayabilirlikleri ve çoğalması ve farklılaşması potansiyeli üzerinde asgari düzeyde etkisi olan spesifik ve tanımlanmış APC popülasyonlarının analiz edilmesine izin verir. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma (MCS), hücrenin değiştirilmeden boncukların çözünmesi nedeniyle kültür gibi müteakip uygulamalara uygundur. MCS de ekonomiktir ve bir kez antikor koniSantitler standart hale getirildiğinden, akış sitometrisi deneylerine olan ihtiyaç azdır. PVAT öncülleri ile yapılan in vitro çalışmalar, bu primer hücrelerin sahip olabileceği potansiyelin bir görüntüsünü de verebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda açıklanan tüm prosedürler, Michigan Devlet Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından oluşturulan yönergeleri izlemektedir. Tüm tamponlar ve medyalar ışığa karşı korunmalıdır.

1. Tamponların, Ortamların ve Aletlerin Hazırlanması

  1. 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibazik, 5.5 mM glukoz,% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg) Krebs Ringer Bikarbonat Tamponlanmış çözeltiyi (KRBB) hazırlayın. / ML streptomisin, 25 ug / mL amfoterisin B) ve 10 mM HEPES (pH = 7.4). Bu solüsyon steril tutulduğunda ve 4 ° C'de 3 hafta boyunca stabildir.
  2. Kollajenaz Tip 1 Solüsyonu hazırlayın: KRBB'de% 1 sığır Serum Albümini (BSA) içeren 1 mg / mL. Bu solüsyon 37 ° C'de tutulmalı ve 4 saat boyunca stabildir.
  3. Eritrosit Lizis Tamponu Çözeltisi Hazırlayın: 154 mM amonyum klorür, 10 mM potasyum bikarbonat, Ve 0.1 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun.
  4. MCS Engelleme Tamponu Hazırlayın: DMEM / F12 Ortam tabanı,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 5 normal eşek serum, 40 uL / ​​mL F (ab) Parç편 Eşek Anti-Rat IgG. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun.
  5. MCS Tampon Çözeltisi Hazırlayın: Fosfat Tamponlu Tuz (PBS, pH = 7.5),% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun. De-gaz çözeltisi, bir cam kap içerisinde 37 ° C'ye ısıtılarak ve daha sonra 15 saniye süreyle vakum uygulanarak hazırlanır. Kullanılmayan tamponlu mühürlü bırakın.
  6. Dulbecco's-Modifiye Kartal Ortamı (DMEM): F12,% 15 Fetal Buzağı Serumu (FCS),% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg / mL streptomisin, 25 ug / ML amfoterisin B), 44.05 mM sodyum bikarbonat, 100 uM askorbik asit, 33 uM biyotin, 17 uM pantotenat, 2 mM L-glutamin ve 20 mM HEPES. Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.
  7. APC &Lösemi inhibe edici faktör (10 ng / mL), trombosit türevli büyüme faktörü BB (10 ng / mL) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (10 ng / mL) dahil olmak üzere ilave büyüme faktörleri olan Basal Medya 5 ng / mL). Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.
  8. APC İndüksiyon Ortamı hazırlayın:% 10 FBS, 2.5 μg / mL insülin, 0.5 mM 2-izobütil-1-metilaksantin (IBMX), 1 uM deksametazon ve 200 pM T3 (triiodotironin tiroid hormonu) ile APC Ortamı. Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.

2. Adiposit Progenitörlerin İzolasyonu

  1. Sıçan, kurumsal kurallara göre anestezi altına alınız. Sıçanı sırt üstü yatma durumuna getirin. Anestezi derinliğini bir ayak parmak ucu ve bu acı uyarıya refleks tepkisi kaybı ile teyit edin.
    NOT: Bu protokol, intraperitoneal bir enjeksiyon yoluyla 10 haftalık Sprague Dawley sıçanları ve 70 mg / kg pentobarbital kullanmaktadır.
  2. Dikey orta hat kesi wGöğüs bölgesinde sternum boyunca makas ve perineal alana. Karın boşluğuna erişin ve üst mezenterik arteri, küçük mezenterik dirençli damarları (mPVAT) ve torasik aortayı (aPVAT) ortaya çıkarın.
    1. Mezenterya ve aortaya olan tüm bağlantıları kesip hayvanlardan damarları çıkarın. Bir disseksiyon mikroskopu ve PVDF'yi izole etmek için KRBB ile dolu Petri kabı kullanarak PVAT'yi ayırın.
    2. Bu deneyde, bir PVAT olmayan yağ deposunu temsil etmek için gonadal (GON) adipozu toplayın. İzole edilmiş yağ pedlerini KRBB'de buz üzerinde 10 mM HEPES (pH = 7.4) ile yerleştirin.
    3. Biyogüvenlikli bir kaputta yaklaşık 50 mg doku, 1 mL kollajenaz tip I solüsyonu ile 1.7 mL'lik bir tüpe aktarılır ve doku makası ile kıyılır (1-3 mm'lik parçalar).
  3. 1 saat rotisserie inkübatör (veya bir orbital çalkalayıcı ile inkübatör) 37 ° C'de inkübe ederek numuneleri sindirin. Biyogüvenlikli bir davlumbazda sindirilmiş malzemeyi 100 ve 40 Μm hücre süzücüleri 50 mL'lik bir tüp içine yerleştirin. Elde edilen süzüntü, 4 ° C'de 10 dakika, 300 x g'de santrifüjleyin.
    NOT: Buradan itibaren protokoldeki tüm basamaklar, hücreleri steril tutmak için biyogüvenlikli bir başlıkta gerçekleştirilmelidir.
  4. Süpernatantı boşaltın ve 1 mL Eritrosit Lizis Tampon Çözeltisi içindeki SVF hücrelerini içeren topakları tekrar süspansiyon haline getirin ve 1.7 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Işıktan korunan oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 300 x g'de 5 ° C'de 4 ° C'de santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini SVF Basal Media'da tekrar süspanse edin. Trypan Blue Solution ile canlı hücreleri saymak için 20 μL alt numune toplayın.
    NOT: İzole edilebilen SVF hücrelerinin sayısı siteye göre değişir. Mg doku başına hasat edilen ortalama SVF sayısı: aPVAT = 5.0 ± 2.0x103, mPVAT = 1.04 ± 0.62x104, GON = 2.4 ± 1.2x105.

3. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma

Not: APC'yi, tüm adımları 4 ° C'de gerçekleştirerek CD34 ve PDGFRα hücre yüzey markerlerine dayanan SVF'den ayırın.

  1. Hücreleri 300 x g'de 5 dakika döndürün. Süpernatantı boşaltın ve hücre peletini 1 x 10 6 hücre / mL'de MCS Engelleme Tamponuna tekrar süspanse edin ve 20 dakika inkübe edin.
    NOT: 1 x 10 6 - 2 x 10 8 hücre / mL hücre süspansiyonları etkili bir şekilde ayrılabilir.
  2. 5 uL FITC konjuge Fare anti-CD34 (1 μg / 1 x 10 6 hücre) ile 30 dakika süreyle inkübe hücreler ° C. Hücreleri 300 xg ve 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
    1. CD34 + ve CD34 - hücrelerini ayırmak için karanlıkta 4 ° C'de 5 dakika süreyle 4 μL anti-FITC mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu (toplam hacim 100 μL) ile inkübe edin.
  3. Manyetik ayırıcıyı standa takın ve MultiSort (MS) Kolonunu, kolon kanatları öne gelecek şekilde ayırıcıya yerleştirin. 5 mL yerleştirinToplama tüpünü üst boru tutucudaki MS sütununun altına yerleştirin.
  4. MS Sütununu, MCS Tampon Çözeltisi ile durulayarak hazırlayın. Sütun üstüne 500 μL MCS Tamponu uygulayın ve arabellek geçmesine izin verin. Atık suyu atın ve toplama tüpünü değiştirin.
  5. Hazırlanan MS sütununa antikor etiketli hücre süspansiyonu yükleyin. Etiketsiz hücreler içeren akışı toplayın.
  6. MS sütununu 500 μL gazı alınmış MCS Tamponu 3x ile yıkayın. Etiketsiz hücreleri toplayın ve bir önceki aşamadaki akışla birleşin.
  7. MS Sütununu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. MS sütununa 1 mL MCS Tamponu pipetleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerle fraksiyonu hemen sık sık, fakat yavaşça sütun içerisine fazla gaz girmemesi için kolonla birlikte verilen pistonu uygulayarak boşaltın.
    NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. SVF popülasyonundan izole edilmiş ortalama CD34 + APC sayısıMg doku: aPVAT = 2.6 ± 0.43x102, mPVAT = 9.6 ± 1.4x102, GON = 1.3 ± 0.22x103.
  8. Hücreleri 5 dakika 300 × g ve 4 ° C'de döndürün. 10 μL 1: 200 çözelti / 1 x 10 6 hücre tavşan anti-PDGFRα toplanan CD34 + fraksiyonu 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    1. 300 xg ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca hücreleri tekrar santrifüjleyin. Etiketli hücreleri, izole etmek için 3.3-3.7 adımlarını tekrarlayarak 4 uL anti-tavşan IgG mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu ile inkübe edin.
      NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. Mg doku başına CD34 + popülasyondan izole edilen PDGFRα + APC'nin ortalama sayıları: aPVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, ki bu daha önce izole edilen popülasyonun% 0.5-10'udur.

4. Hücre Kültürü ve Adipogenez İndüksiyonu

  1. SVF'yi kültür edinVe APC'yi 6-Well doku kültürü plakalarında bazal medyumda değiştirerek her 2 günde bir değiştirin. 3 seri pasajdan sonra, 8, 24, 48 ve 96 saatte ve 24 oyuklu plakalarda 50,000 hücre / çukurda değerlendirilen çoğalma tahlilleri için siyah 96-oyuklu doku kültürü plakalarını 1x102 hücre / oyuk ile veya Nitel ve nicel adipogenez analizleri için 48-Well doku kültürü plakalarında 10,000 hücre / çukur.
  2. Konfüzyon sonrası 48 saat ve kemik morfojenik protein 4 (3.3 nmol / L) ile endüksiyon öncesi APC bazal medyasını, farklılaşma için 10 olarak belirtildiği gibi ilave edin. Hücreleri inkübe etmek için APC İndüksiyon Ortamını kullanarak 48 saatlik% 100 konfluans (gün 0) sonrasında hücreleri indükleyin.
  3. 48 saat sonra, IBMX ve deksametazon içermeyen APC İndüksiyon ortamında hücreleri muhafaza etmek için medyayı değiştirin; medyanın her 48 saatte bir değiştirilmesi ile 14 gün boyunca.
  4. FACS tarafından onaylanan MCS izolasyonu.
    1. 50 μL (50.000 hücre) alt örnek manyetik olarak ayırınAted hücreler ve FACS çözeltisi ile yıkayın.
    2. Hücreleri santrifüjleyin ve PDGFRα + hücrelerini etiketlemek için, eşek anti-tavşan IgG Dylight 405'in 1: 1000 çözeltisinden 100 uL'ye tekrar süspanse edin. Işıktan ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde 488 nm (FITC) ve 405 nm (Dylight 405) filtreler kullanarak analiz için zaman kadar 200 uL% 2 formaldehid solüsyonuna tekrar süspanse edin.
      NOT: Kültürlenmiş hücrelerin lipid birikimi, lipofilik bir adipogenezis flüoresans tahlilini kullanarak, flüoresanı ölçen bir mikroplate okuyucu kullanılarak ve lipid birikimi için kalibratörler olarak preadipositleri kullanarak niceliksel olarak değerlendirilir. Lipid birikimi ayrıca nitel olarak lipid boyası lekelenmesi ve bir kamera ile donatılmış ters mikroskop üzerinde gerçekleştirilen görüntüleme ile ölçülür ve lipid gözlemlenebilen veya içermeyen toplam hücrelerin yüzdesini oluşturur. 485 nm'de uyarılma ve 572'de emisyon ile flüoresanı ölçebilen herhangi bir plaka okuyucuNm, analiz için olduğu kadar dijital görüntüleri yakalayabilen bir kameraya sahip herhangi bir mikroskop için de uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preadipositlerin proliferatif kapasitesi ve adiposit öncüllerinin adipojenik potansiyeli, in vitro 11'de muhafaza edilen özelliklerdir. İzole SVF'nin ve APC'nin, erkek sıçanlardan aPVAT, mPVAT ve GON'dan in vitro proliferasyonu, kantitatif bir DNA testi kullanılarak kaplamadan 8, 24, 48 ve 96 saat sonra değerlendirildi. Aynı bölgedeki SVF hücrelerine kıyasla 96 saat daha az proliferasyona sahip olan bir PVA'dan alınan APC hariç herhangi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyin odak noktası PVAT depolarından APC'nin izolasyonu, genleşmesi ve adipogenik indüksiyonudur. Burada yüzey işaretleri CD34 ve PDGFRα ifade hücrelerin tanımlanması dayalı APC izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yüzey proteinleri daha önce APC üzerinde yüksek proliferasyon oranları ve çeşitli yağ depoları 14,15'te beyaz veya kahverengi adipositleri ayırma potansiyeli ile tanımlandı. Bu belirteçlere dayalı hücreleri seçerek, seçilen PVAT'de gözlemlenen adiposit fenotipiyle eşleşen çoklu yağ depo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contreras and Watts Laboratuvarları ve Dr. William Raphael. Bu deneyler NHLBI F31 HL128035-01 (doku sindirim protokol standardizasyonu), NHLBI 5R01HL117847-02 ve 2P01HL070687-11A1 (hayvanlar) ve NHLBI 5R01HL117847-02 (hücre izolasyonu ve kültür) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Doku Diseksiyonu
ile El YapımıDiseksiyon Yemekleri
Petri KabıPyrex7740 Cam
Silikon ElastomerDow CorningSylgard 170Kit
Örgülü İpek SütürHarvard Aparatı51-7615SP104
Stereomikroskop MZ6Leica10447254
Stereomaster Mikroskop Fiber Optik Işık KaynağıFisher Scientific12562-36
Vannas MakasGeorge Tiemann & Co160-150
Kıymık ForsepsGeorge Tiemann & Co160-55
Doku MakasıGeorge Tiemann & Co105-400
KRBB Çözeltisi
Sodyum KlorürSigma-Aldrich7647-14-5
Potasyum KlorürSigma-Aldrich7447-40-7
Magnezyum SülfatSigma-Aldrich7487-88-9
Potasyum Fosfat DibazikSigma-Aldrich7758-114
GlikozSigma-Aldrich50-99-7
Antibiyotik / AntimikotikCorning30-004-CI
HEPESCorning25-060-CI
güçlü > Doku Sindirimi< / güçlü >
Kollajenaz Tip 1Worthington BiyokimyasalLS004196
Sığır Serum Albümini (BSA)Fisher Scientific9048-46-8
Kırmızı Kan Hücresi Lizis TamponuBioLegend4203011X Çalışma
Solüsyonu Su BanyosuThermo-Fisher Scientific2876Karşılıklı Çalkalama
Banyosu Biyogüvenlik KabiniThermo-Fisher Scientific1385
Döner İnkübatörDaiggerEF4894C
100 & mikro; m Hücre SüzgeciThermo-Fisher Scientific22-363-549Sarı
40 & mikro; m Hücre SüzgeciThermo-Fisher Scientific22-363-547Mavi
HemositometreCole-ParmerUX-79001-00
Tripan MaviSigma-Aldrich93595
Hücre İzolasyonu
OctoMACS KitiMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 Orta Corning90-090Orta Baz
Fetal Sığır Serumu (FBS)Corning35016CVABD Kökenleri
Normal Eşek SerumuAbCamAB7475
Anti-CD34Santa CruzSC-7324FITC-konjuge
Anti-PDGFR ve alfa;Thermo-Fisher ScientificPA5-17623
Eşek Anti-Tavşan IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 10XCorning46-013-CM1X Çalışma Çözümü
EDTAFisher Scientific15575020
Hücre Kültürü
CO 2 Hücre İnkübatörüThermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i 
6 Kuyulu PlakalarCorning3516TC ile İşlenmiş
48 Kuyulu PlakalarCorning3548TC ile İşlenmiş
96 Kuyulu Plakalar, Siyah DuvarCorning353376TC ile Tedavi Edilmiş
Sodyum BikarbonatSigma-Aldrich144-55-8TC ile Tedavi Edilmiş
Fetal Buzağı Serumu (FCS)Corning35011CVABD Kökenleri
Askorbik AsitSigma-Aldrich50-81-7
BiotinSigma-Aldrich58-85-5
PantotenatSigma-Aldrich137-08-6
L-GlutaminCorning61-030
Kemik Morfojenik Protein 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)PeproTech400-25
Lösemi İnhibitör FaktörPeproTech250-02
Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü BBProspec BioCYT-740
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)PeproTech450-33
İnsülinCorning25-800-CRAUS Çözümü
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
DeksametazonSigma-Aldrich50-02-2
T3 (Triiyodotironin)Sigma-Aldrich6893-023
Hücre Analizi< / güçlü >
CyQUANT Proliferasyon TestiThermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed Floresan Test ReaktifiLonzaPT-7009
Yağ Kırmızı O Lipid Boya ReaktifiSigma-AldrichO1391Çözümde
M1000 Mikroplaka OkuyucuTecan
Eclipse Ters MikroskopNikon
Dijital Görüş DS-Qil KameraNikon
Silikon Kültürü <

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
  2. Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
  3. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  4. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  5. Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  6. Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
  7. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  8. Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
  9. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  10. Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
  11. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  12. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  13. Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
  14. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
  15. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
  16. Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
  17. Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
  18. Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
  19. Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).
  20. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
  21. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  22. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  23. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adiposit Progenit r H crelerStromal Vask ler FraksiyonH cre Geni letme ProtokolleriCD34 Mark r zolasyonuPDGFR Alfa Pozitif H crelerDoku K lt r TeknikleriProliferasyon Analiz Protokolleri

İlgili makaleler