Yöntem makalesi

HER2 için iletişim kuralı balık bir çapraz bağlama, Formalin ücretsiz doku sabitleştirici Cryo-koruma ve Formalin fiksasyon avantajları birleştirmek için kullanma

DOI:

10.3791/55885

⸱

25 Aralık 2017

 ,  ,  ,  , 
1Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology, Medical University Graz, 2Institute of Pathology, Medical University Graz, 3Research and Development, Qiagen GmbH

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresans in-situ hibridizasyon (balık), histopatoloji ve moleküler teşhis tedavi kişiselleştirilmiş tıp yelpazesi için birlikte genellikle gereklidir. Balık görüntülenmeden önce izin veren yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve balık analizleri aynı örnek buna ek olarak bir sonrası fiksasyon adım tarafından bir roman çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin morfolojik değerlendirme Morfoloji mükemmel onun korunması nedeniyle yıllardır kanser teşhis için altın standart olmuştur. Kişiselleştirilmiş tıp tek tek adapte ve hedeflenen tedavilerin kombine morfolojik ve moleküler analitik teknolojileri ve tanılama tarafından etkin karakterize bireysel hastalıklar için giderek sağlar. Aynı FFPE örnekten morfolojik ve moleküler deneyleri performansını formalin kimyasal değişiklik nedeniyle olumsuz etki nedeniyle zorlu ve proteinler ve nükleik asitler ilişkilendirerek. Bir çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici son zamanlarda geliştirilmiş Yani her iki gereksinimleri yerine getirmek için Morfoloji gibi FFPE ve biomolecules gibi cryo-koruma korumak için. Balık, histopatoloji ve Moleküler Diagnostik birlikte genellikle gereklidir, biz balık dokular ile bu yeni sabitleştirici tedavi protokollerinde uygulanabilirliği test. İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) bu formalin sonrası fiksasyonu sigara-çapraz-bağlantı, formalin ücretsiz histolojik kesitler ve parafin gömülü (NCFPE) meme kanseri oluşturulan doku eşdeğer sonuçlar FFPE doku sahip kişilere bulduk Balık analizi. Bu protokolü nasıl ilk olarak geliştirilen ve FFPE doku için doğrulanmış bir balık tahlil NCFPE dokular için histolojik kesitler bir basit sonrası fiksasyon adım kullanılabileceğini açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kişiselleştirilmiş tıp giderek morfolojik ve moleküler doku analizleri içeren çok parametreli testlere dayanmaktadır. Dokuların formalin fiksasyon altın standart olarak mükemmel morfolojik kalite1,2sağlar. Ancak, formalin kaynaklı kimyasal modifikasyon ve proteinler ve nükleik asitler3,4,5 olumsuz cross-linking moleküler analizi6ile etkilemektedir. Bu moleküler değişiklikler kalitesi proteinler ve nükleik asitler sınırlamak ve Gen dizisi eserler7 veya Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) düşük duyarlılık neden olabilir-deneyleri8dayalı. Her ne kadar büyük çabaları moleküler testler FFPE doku için optimize etmek için alınmıştır, cryo-koruma dokuların formalin fiksasyon, doku örnekleri farklı koruma yordamları için bölmek gerekli olduğunun genel üstün mevcuttur. Cryo-koruma moleküler analizleri, bir sigara-çapraz-bağlantı, ihtiyacını önlemek için sabitleştirici, formalin ücretsiz PAXgene doku geliştirilmiştir. Piyasada bulunan bu sistem bir fiksasyon ve farklı alkoller, Asetik asit ve çözünür bir organik bileşik içeren bir istikrar çözüm oluşur. Nükleik asitler, proteinler (phospo) ve Morfoloji uygun korunması çeşitli çalışmalar6,9,10,11,12,13' te gösterildi.

Kanser teşhis belirli bir uygulamada kromozom değişikliği, translokasyonlar, submicroscopic silme ve Arttırımlar 14gibi geniş kapsamlı algılama balıktır. Örneğin, invaziv meme kanser tümörleri yüzde yirmisi insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) amplifikasyon göstermek kötü prognoz18 ile ilişkili olan gen15,16,17, ,19. Meme kanseri balık tarafından HER2 overexpression ve amplifikasyon statüsünde belirlenmesi hastalar tedavi anti-HER2-yönetmen için seçmek için gerektiği ve Federal uyuşturucu Derneği (FDA tarafından) (http://www.fda.gov/ listelenen bir tanı arkadaşıdır MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Balık tabanlı arkadaşı tanılama geniş bir uygulama sağlık bakım sağlamak amacıyla deneyleri geliştirilmiş olup FFPE dokular için onayladı.

Bir önceki çalışmada, NCFPE doku FFPE doku için onaylanmış olan balık deneyleri için kullanılamaz gösterdi. Ancak, farklı yazı fiksasyon işlemler gösterdi ki %4 arabelleğe alınmış formaldehit ile NCFPE dokuların dizi fiksasyon kez 18 h veya daha uzun NCFPE doku bölüm sonrası zaman testin Bu FFPE dokular14ile eşdeğer sonuçlar elde.

Bu çalışmada detaylı bir protokol sağlar ve çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku fiksasyon ve 24 h %4 etkisini HER2 balık ve RNA kalitesi aynı birincil doku örnekten için kullanılan bölümleri üzerinde formaldehit sonrası tespit arabelleğe gösterilmektedir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Floresans in situ hibridizasyon (balık) ve gömülü parafin sabit formalin (FFPE) ve çapraz bağlantı-RNA analizi için adımları gösteren diyagram, sabit parafin formalin-ücretsiz (NCFPE) dokularda gömülü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma tıbbi Graz Üniversitesi (referans numarası 20-066), Etik Komitesi tarafından kabul edildi Avusturya. Hastaların yazılı onay vermişti sonra doku örnekleri cerrahi olarak rezeke birincil invaziv meme kanserlerinin iki tane elde edilmiştir.

1. doku fiksasyon

Not: alışkanlığı doku ya % 10 formalin çözüm pH 6.8 pH 7.2 CEN/TS göre için arabelleğe alınmış (% 4'lük birim kesir için karşılık gelen) % 3.7 formaldehit kitle bir kısmını içeren olarak tanımlanan standart tamponlu formalin çözüm (SBFS), ile gerçekleştirilen 16827-1:2015 veya çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku fiksasyon sistemi (alternatif fiksasyon çözüm olarak da bilinir) oluşan bir sabitleştirici ve sabitleyici çözüm, oda sıcaklığında (RT).

  1. Meme kanseri doku örnekleri steril neşter ile iki yarısı her 4 mm kalınlığında yeterli doku miktarı sağlamak için kesti. En büyük boyutu 4 x 15 x 15 mm NCFPE veya SBFS doku fiksasyon için kullanın.
  2. Tümör numune her yarı bir standart doku kaset yerleştirin ve SBFS veya bir birim hacim oranı (v/v) 4 parça sabitleştirici ve bir kısım doku (4 mL/1 g doku (ideal olarak 10 mL/1 g)) başına ile 24 h için alternatif fiksasyon çözüm daldırın.
  3. Alternatif olarak sabit örnekleri 2-72 h için sabitleyici çözüm içine kapsayıcısını açarken, doku kaset 180 ° dönüş ve bu batış aktarmak.
  4. SBFS-sabit örnekleri ile doku kaset 250 mL % 70 etanol RT rezidüel SBFS kaldırmak için 30 dk için yerleştirin.
    Not: Bu adımı çapraz bağlama Fiksajlar biomolecules korunması için yararlı özellikleri yok edecek olan otomatik doku işlemci sabitleştirici tedavi örnekleri çapraz bağlama SBFS kirlenmesini önlemek önemlidir.
    Dikkat: SBFS tehlikeli bir çözümdür, cilt tahrişi, ciddi göz hasara neden olur, alerjik cilt reaksiyon neden olabilir, genetik kusurların neden şüpheleniliyor, kanser, solunum tahriş, organlarda uyuşukluk ve nedenleri hasar neden olabilir. Alternatif sabitleştirici toksik Solunduğunda, Cilt ile temasında ve yutulduğunda gözler ve cilt, Cilt ile temasında inhalasyon yoluyla çok ciddi geri dönüşü olmayan etkileri tehlikesi rahatsız edici ve yutulması halinde. Her iki fiksasyon çözümleri için inhalasyon ve fiziksel temas kaçınılmalıdır. Uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz ve yüz koruma giymek. Bir duman mahallede çalışıyorum.
  5. Doku işleme, katıştırma ve doku (Bölüm 2 ve 3) kesit için devam edin.

2. doku işleme ve katıştırma

  1. Doku kaset sabit doku örnekleri ile kademeli su kaybı % 70 (2 x 15 dk), % 80'i (30 dk), (60 dk) % 90 ve % 99 (2 x 60 dk) etanol, Ksilen (2 x 60 dk) tarafından takip gerçekleştirin. O zaman bir otomatik doku işlemci (4 x 45 min) parafin ile sızmak.
  2. Forseps kullanarak, susuz ve parafin sızmış örnekleri yer (alternatif olarak ve SBFS Sabit) metal kalıplar içinde.
  3. Örnekleri katıştır (sertleşme noktası 56-58 ° C) 5-10 mL erimiş parafin parafin katıştırma kullanarak işaretleme.
  4. 30 dk-5 ° C'de kalıp soğutma bir plaka üzerine yerleştirin.
  5. Parafin gömülü doku blok kalıpları yeniden elde etmek.
  6. Elde edilen blok depolamak (alternatif olarak sabit parafin gömülü (NCFPE) ve SBFS-sabit parafin gömülü (FFPE)) kullanımı kadar 4 ° C'de karanlıkta.

3. doku kesit ve slayt hazırlama balık için

Not: slaytlar NCFPE bölümleri ile SBFS içinde 24 saat önce balık yordamı için sonrası sabit iken FFPE bölümler doğrudan balık için kullanılır.

  1. Bir tek kullanımlık bıçak microtome yerleştirin ve microtome 10 µm için ayarlayın.
  2. Soğutma plaka ilk blok alın ve araç yerleştirin.
  3. Hatta bir yüzey elde kadar blok döşeme. Temiz bir fırça kullanarak microtome ve 3 µm. için atma ilk 2-3 bölümden ayarlayın.
  4. NCFPE ve FFPE blok 3 µm bölümleri kesilmiş ve bir soğuk su banyosu (ultrasaf su) koyun.
    Not: üst üste gelen çekirdek olmadan daha iyi fotoğraflar elde etmek için burada manufacturer´s talimatlarında tavsiye edildiği gibi 3-5 µm yerine 2 µm bölümlerin görüntüleri gösterilir.
  5. İyi boya fırçası ve kaplamalı mikroskop slayt üzerine iğne doku bölümleri yapışma için kayan her bölümle almak.
  6. Bu slayt (40 ° C) sıcak Dalma su banyosu ve tamamen streç bölümü izin.
  7. Bölümüne geri koymak slayt dikkatlice slayt dışarı su çekerek ve kırışıklıkları önlemek.
  8. Tüm bölümleri 1 h için oda sıcaklığında, Kuru izin.
  9. Slaytlar için 30 dk içinde parafin eritmek için bir kuluçka 70 ° C'de ısı.
  10. Slaytları yatay bir cam kavanoz boyama koymak.
  11. Rehydrate kademeli RT boyama kavanozlara adlı bölümler dolu 250 mL ile her aşağıdaki sıvılar: % 100 Ksilen 2 x 15 dk, % 96 etanol 2 x 15 dk, % 90 etanol 2 dk, % 80'i etanol 2 dk, % 70 etanol 2 dk, % 50 etanol 2 dk ve distile su 2 x 10 dak.
    Dikkat: deparaffinization ve sıvı duman mahallede adımları izleyerek, toksik volatilized çözücüler nefes değil.
    Not: bölüm ve doku bağlı olarak farklı kuluçka kez önceden test etmek gerekli olabilir.

4. sonrası fiksasyonu NCFPE örnekler

  1. NCFPE slaytlar sonrası fiksasyonu RT. yerde duman kukuIeta kavanoza 24 h 24 h sonrası fiksasyon adımı sırasında SBFS ile dolu bir yeni boyama kavanoza koyarak onları gerçekleştirmek.
  2. Kaldır aşırı SBFS fosfat ile yıkama tarafından serum (3 x 10 dk) arabelleğe alınmış ve distile su (2 x 10 dk).

5. Floresans in situ hibridizasyon (balık)

Not: Burada balık üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan HER2/CEN17 çift Renk sondasını kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Hibridizasyon ve adımları yıkama sırasında kuru için doku bölümleri izin vermez. İzin DNA prob ve 4', ışığa daha uzun süre maruz için 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain çözümleri. Bu adımları izleyerek karanlıkta lightproof kapsayıcılar kullanılarak. Yaş ve örnek malzeme fiksasyon adımında, bağlı olarak artırmak ya da azaltmak denaturing ve sıcaklıklar daha iyi hibridizasyon sonuçları elde etmek için yıkayın.

  1. Isı ön arıtma çözüm bir 98 ° C su banyosunda sitrik 250 mL içeren bir boyama kavanoz yerleştirin.
  2. Ve sonrası sabit NCFPE kavanozun içine slaytlar ve 15dk için kuluçkaya rehydrated FFPE yerleştirin.
Kavanoz boyama başına birden fazla altı slayt kullanmayın.
  • RT yeni boyama kavanozda, slaytlar 3 min için distile suda yıkayın.
  • Proteolizis için bir sıcaklık kontrollü hibridizasyon sistemi içine slaytlar 37 ° C'de yer.
    1. Hemen, dropwise-hazır-için-kullanımı Pepsin çözüm (2 mg/ml) uygulaması (~ damla başına 30 µl) doku bölümler tamamen kaplı kadar için. 9 dk. 37 ° C'de için hibridizasyon sisteminde kuluçkaya.
      Not: 5-15 dk bir kuluçka zaman önerilir. Proteolizis optimum süre önceden tespit.
    2. Slaytları yıkama arabellek SSC içeren bir kavanoza koyun ve 5 min için kuluçkaya.
    3. 1 dk. için distile su slaytları RT. durulama
    4. Dehidratasyon bölümleri aşağıdaki dereceli alkoller gerçekleştirmek: % 50, % 70, % 90 ve % 100 her 1 dk. hava kuru bölümleri.
    5. Hibridizasyon, pipet 10 µL HER2/CEN17 inceleyebilirsek üzerine kurutulmuş doku bölümleri için her örnek bir coverslip ile kapak ve kauçuk çimento ile kapatın.
      Not: 22 x 22 mm doku alan 10 µL inceleyebilirsek önerilir. Probe nazik bir ısınma pipetting işlemini kolaylaştırır. Bubbles ve sonda uzun pozlama ışık kaçının.
    6. Sonda ve numune DNA için 10 dk. 75 ° C'de hibridizasyon sisteminde işbirliği tabiatını.
    7. Hibridizasyon sistemi için 37 ° C ve gecede melezlemek.
    8. Dikkatli bir şekilde kauçuk çimento sonrası hibridizasyon ve algılama için Forseps ile çıkarın.
    9. Boyama kavanoz içeren 37 ° C önceden ısınmış 1 x yıkama için bir tampon A 5 dk. Kaldır slaytları coverslips kuluçkaya.
    10. Yıkama kullanarak slaytlar önceden 1 x yıkama arabellek A 37 ° C'de 5 min için iki kez ısındı
    11. % 70, % 90 ve % 100 etanol, 1 dk slaytları kurutmak.
    12. Hava örneklerinde kuru ve ışıktan korumak.
    13. 30 µL uygulamak için boyama, DAPI-çözüm kabarcıklar kaçınarak melezleşmiştir alanına. Bir coverslip bölümlerle kapsar.
    14. Işıktan korunan 15dk için kuluçkaya.
    15. Dikkatli bir şekilde aşırı DAPI-çözüm filtre kağıtları arasında slayt yavaşça basarak çıkarın.
    16. 2-8 ° C'de slaytları karanlıkta tarafından confocal mikroskobu 2 hafta kadar değerlendirme için depolama.

    • 6. confocal görüntüleme ve balık slayt tarama

    1. Confocal görüntüleme ve 40 x ile donatılmış bir confocal dijital tarayıcı slaytlarda tarama gerçekleştirmek / 1.2 NA amaç, dört bant filtreler (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) ve bir 5.5Mpx, 16 bit, soğutmalı bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) kamera.
    2. Yeşil için filtreler ile görüntüleri elde (uyarma: 503 nm, emisyon: 528 nm) ve turuncu (uyarma: 547 nm, emisyon: 572 nm) kanalları.

    7. yorumu

    Not: HER2/CEN17 sonda bir kırmızı fluorochrome etiketli CEN17 sonda belirli Kromozom 17 Alfa uydu centromeric bölge için (D17Z1) ve bir yeşil fluorochrome etiketli HER2 sonda belirli HER2 gen (sonda yer 17q12) için bir karışımıdır. Bu bir HER2:CEN17 oranı ≥2.0 ile güçlendirilmiş17olarak attı, ancak tümör numuneler HER2:CEN17 oranı ≤2.0 çekirdek başı ile normal, attı.

    1. Açık kaynak CaseViewer 2.120ile görüntülerin kalitesi analizi gerçekleştirin.
      1. Bir patolog tarafından tanımlanan Karsinomu invaziv bileşeni iki değişik bölgelerinde bulunan en az 20 hücre değerlendirmek. Açıkça ayırt de dağıtılmış çekirdeği sayım alanı içinde yer almaktadır. Doku bölgeleri sınır ve retrakte veya sıkılmış alanları sayım odasından hariç.

    8. RNA kalite

    1. RNA çıkarma
      1. Tüm aletler ve araçlar RNAse ücretsiz olduğundan emin olun. RNAse kaldırma çözüm kullanın.
      2. 10-20 adım kadar 3,8 protokol sonrası bir microtome kullanarak NCFPE veya FFPE örnekleri (5 mikron kalınlığında) bölümlerini kes.
      3. RNA NCFPE--dan hulâsa RNA yalıtım kullanarak örnekleri Kiti (malzemeler tablo bakınız). RNA FFPE örnekleri FFPE RNA izolasyon kit kullanarak ayıklayabilirsiniz.
        Not: RNA'ın çıkarma çapraz bağlama Fiksajlar fiksasyon yöntemi için uyarlanmış bir yalıtım yöntemini gerektiriyor. Herhangi bir diğer RNA izolasyon yöntemi (Trizol, RNeasy FFPE, NCFPE numune vb) kullanmayın.
      4. RNA konsantrasyon ve saflık bir Spektrofotometre kullanarak belirler. 260 Absorbans oranı nm ve 280 nm (A260/280)-meli var olmak ~ 2.0.
      5. İzole RNA-70 ° C'de daha fazla çözümleme kadar saklayın.
    2. Gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR gerçekleştirmek farklı uzunlukları8,9amplicons oluşturmak için primerler kullanılarak.
      1. CDNA ters transkripsiyon kiti manufacturer´s talimatlara göre cDNA sentezi için kullanın. 500 ng RNA her örneğinin kullanın. CDNA-20 ° c kadar daha fazla kullanılmasını saklayın.
      2. PCR ana mix manufacturer´s talimatlara göre hazırlayın.
      3. Triplicates 384-iyi tepki plaka ana PCR karışımında pipette. 4 ekleyin 1:16 µL seyreltilmiş cDNA (PCR şablonu). PCR manufacturer´s talimatlara göre gerçekleştirin.
        Not: aşağıdaki astar insan GAPDH için kullanıldı: ileri GAPDH: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH ters: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ ve 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. PCR makineye uygulanabilir bir yazılım kullanarak sonuçları çözümleyebilirsiniz. Spesifik olmayan ürünler eğrisi analizi21erime dayalı dışlanması gerekir.

    Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Balık HER2 belirlenmesi:

    HER2-balık sinyal yoğunluklarını FFPE ve NCFPE benzer (Şekil 2) vardır. Her iki durumda da en hücreleri kırmızı sinyal (CEN17 referans gen) karşılaştırıldığında yeşil sinyal (güçlendirilmiş HER2 gen locus gösterge) açık bir fazlalığı göster. Bu nedenle, bu hasta trastuzumab, bir anti-HER2 hedefli tedavi yanıt bekleniyor anlamına gelir bir güçlendirilmiş HER2 gen durumunda gösterir. FFPE numune pozitif kontrol olarak görev yaptı. İç başvuru ve HER2 gene amplifikasyon için negatif kontrol olarak gözlenen neoplastik olmayan hücrelerdeki (hem FFPE ve NCFPE) sinyalleri hizmet. Her analiz serisi için bilinen gene amplifikasyon durumuna sahip en az bir bölüm için hibridizasyon reaksiyon pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır.

    RNA Kalite:

    İki farklı durumlarda ilgili FFPE ve NCFPE örnek gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR istihdam ederek RNA kalite farklılıkları gösterir. Elde edilen sonuçlar göstermek için farklı amplicon uzunlukları farklı amplifikasyon verimliliği (yani, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) GAPDH mRNA. FFPE örneklerinden elde edilen tüm Ct (döngüsü eşik) değerler NCFPE gelen bu yüksekti. Bu fark daha belirgin bir kimyasal değişiklik düşündüren FFPE dokulardan izole mRNA alt PCR amplificability gösterir. Ayrıca, daha yüksek Ct uzun kısa amplicons karşılaştırıldığında için bir gösterge mRNA parçalanma için değerlerdir. Buna karşılık, farklı amplicon uzunlukları Ct değer yamaçları gösterir daha FFPE mRNA parçalanmanın NCFPE doku (şekil 3) belirgin.

    figure-results-1
    Şekil 2: HER2 balık temsilcisi sonuçlarını ilgili formalin parafin sabit için gömülü (FFPE) ve çapraz bağlama, formalin ücretsiz sabit parafin gömülü (NCFPE) doku bölümler. Aynı FFPE (A) ve NCFPE (B) doku karşılık gelen örnekleri gösterilir. Nerede iki yeşil (HER2) ve iki kırmızı (CEN17) sinyal bekleniyor, normal Interphase hücreleri aksine (C), güçlendirilmiş HER2 gen locus hücrelerle yeşil sinyalleri (HER2) birden çok kopyasını gösteren (D). FFPE ve sonrası sabit NCFPE bölümler (A, B) HER2 amplifikasyon durum aynıydı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    figure-results-2
    Şekil 3: RNA kalite kontrol için kullanılan gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR tahlil sonuçlarını. Y ekseni: Ct (döngüsü eşik) değerleri GAPDH gen için farklı amplicon yüksekliği gösterilir (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) x ekseni üzerinde. mRNA FFPE ve iki farklı meme kanseri doku örneği paralel ve cDNA kopya etmek için PCR işlenen NCFPE izole edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Sonuçlar iki önemli bulgular göstermektedir. İlk olarak, bir basit 24 h SBFS sonrası fiksasyon adım NCFPE dokulardan kesilmiş bölümlerin analizlerde (Ayrıca bkz: başvuru14) Balık deneyleri FFPE dokular için onaylı kullanarak balık FFPE sahip kişilere eşdeğer sonuçları elde etmek yeterlidir. Bu iletişim kuralının ilk olarak geliştirilen ve FFPE için kapsamlı yeniden doğrulaması için gerek kalmadan (örneğin, çapraz bağlı doku öncesi hibridizasyon koşullarını optimize ederek) onaylı balık deneyleri kullanmanın avantajı vardır. Balık Protokolü tam olarak üretici talimatlarında açıklandığı gibi kullanılabilir.

    Açıkça üretici tarafından önerilen bu Protokolü (örneğin doku bölüm çapı ve kuluçka dönemleri deparaffinization adımlar) sonucu önceki uyarlamaları, açıklanan manufacturer´s yönergeleri gelen küçük değişiklikler farklı doku türlerine ve fiksasyon yöntemleri kullanımı nedeniyle.

    18-24 h da bir gün analiz süresini uzatır ancak aynı günlük iş akışı olarak FFPE doku (şekil 1) için geliştirilen bir kimyasal reaksiyon süresi gerektirdiğinden sonrası fiksasyon önemli adımdır. SBFS doku 1 mm saat22 ' ye bağlı olarak doku türü23,242 h 5 mm başına ortalama bir oranda nüfuz bildirilmektedir. Sadece sonrası fiksasyon takmaktan daha 18 h FFPE bölümlerine NCFPE özelliklerini değiştirebilir gözlem kimyasal reaksiyon zamanı değil sabitleştirici penetrasyonu istenen sonuçları1 ulaşmak için kritik olduğunu gösterir ,14.

    İkinci olarak, biomolecules iyi korunmuş olarak sonrası fiksasyon için kullanılmaz kalan NCFPE doku daha da moleküler analizi için kullanılabilir. Bu gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (şekil 3) tarafından sunuldu. Tahlil daha hassas ve electropherogram elde edilen RIN değer (RNA bütünlük numarası) mRNA parafin gömülü doku8izole için RNA kalite (yani, kimyasal modifikasyon ve parçalanma) ile ilgili olarak daha özel. Bağımsız gruplar RNA ek olarak, DNA ve proteinler NCFPE izole kalitesini FFPE doku 8,9dan, daha iyi olduğunu göstermiştir bu yana kalite kontrol için gerçek zamanlı PCR bu çalışmada sınırlı idi 13.

    Aşağıdaki gibi uygun olan yerlerde sunulan Protokolü (örneğin, SBFS tarifi, fiksasyon şartları, RNA kalite kontrol, doğrulama), CEN teknik özellikleri için In vitro diagnostics (IVD), önceden analitik işlemleri için gereksinimleri hangi son zamanlarda serbest bırakılmış Avrupa Komitesi, standardizasyon (CEN tarafından) (örneğin CEN/TS 16827-RNA izolasyonu için 1:2015 FFPE dokulara gelen ISO 15189 standardına anlamına gelir).

    Bu belirli sabitleştirici sınırlı bir yöntemdir. Biomolecules ve çapraz bağlama, formalin ücretsiz sabitleştirici kullanarak Morfoloji iyi korunması çeşitli çalışmalarda sunulan rağmen temelde araştırma ama rutin tıbbi uygulamalar içinde kullanılır. FFPE malzeme için en iyi duruma getirilmiş tüm iletişim kuralları ile çapraz bağlama Fiksajlar sabit malzeme için kullanılabilir olarak altın standart SBFS yerine başka bir sabitleştirici tarafından fiksasyon doğrulama çalışmaları çeşitli gerektirecek bir nedenidir. Diğer doku fiksasyon yöntemleri bu balık iletişim kuralı için test değil.

    Bu el yazması açıklanan basit sonrası fiksasyon adım onaylı IVD deneyleri için FFPE ve NCFPE doku kullanmanın avantajı vardır.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    D.G. QIAGEN tarafından istihdam ve hisse senedi seçenekleri veya bağ holdinglerin şirket emeklilik planı vardır. Bu el yazması sunulan veriler ortak bir çaba QIAGEN ve PreAnalytiX tarafından geliştirilen PAXgene doku sistem bakın. QIAGEN Biospecimen araştırma ve Biobanking teknolojileri için genel olarak finanse edilen Christian Doppler laboratuvar sanayi ortağıdır. Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması ve hiçbir rakip mali çıkarlarının var.

    Teşekkürler

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Tıp Üniversitesi Graz için kendi uzmanlık patolojinin Enstitüsü, Moleküler Patoloji Laboratuvarı takım teşekkür ediyoruz ve destek. Ayrıca, biz Iris Kufferath ve Daniela Pabst teknik destek için Bernadette Rieger ve Sylvia HER2 servis taleplerini işlemek için Eidenhammer yanı sıra Kinga Szurian (patolog) ve Tamas Regényi (3DHISTEC) teşekkür ederim. Biz Penelope Kungl el yazması proofreading için teşekkür ederim. Bu eser mali Christian Doppler Araştırma Fonu, Avusturya Federal Bilim Bakanlığı, araştırma ve Ekonomi ve Ulusal Vakfı araştırma, teknoloji ve geliştirme için desteklenmiştir.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Almanyawww.sav-lp.deFN-200L-4-1Doku sabitleyici
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Kanadawww.simport.comM-498Doku örnekleri için etiketleme, fiksasyon ve parafin gömme sağlayan saklama cihazı.
    Qiagen GmbH, Hilden Almanyawww.qiagen.com765112Doku örneklerinin toplanması, fiksasyonu ve stabilizasyonu için: PAXgene Tissue FIX ve PAXgene Tissue STABILIZER içeren 10 Önceden Doldurulmuş Reaktif Kabı.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com813150Kimyasal fiksasyondan parafin infiltrasyonuna kadar biyolojik örneklerin işlenmesi
    Merck Millipore, Münih, Almanyawww.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.htmlMC1009834000Doku örneklerinin dehidrasyonu
    VWR Chemicals, Darmstadt, Almanyahttps://at.vwr.com10293EPDoku örneklerinin dehidrasyonu
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Viyana, Avusturyawww.herba-chemosan.at2549662 32Doku işleme cihazında kullanılan parafin
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Viyana, Avusturyawww.LeicaBiosystems.com39602004Parafin gömme ortamı
    Sanova Diagnostik, Viyana, Avusturyawww.sanova.at5229Histoloji
    için dokular için parafin gömme aletiHistocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Avusturyawww.histocom.infoM 910010Bu cihaz, biyoloji ve tıpta özellikle karmaşık parafin kesit alma teknikleri için kullanılır. Mikrotomu yalnızca vasıflı veya özel olarak eğitilmiş personel çalıştırmalıdır, yani numuneyi sıkıştırmalı, kırpmalı, kesitleri ayırmalı ve cihazdan bölümleri çıkarmalıdır.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Danimarkawww.chem.agilent.comK802021-2Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinin montajı için tasarlanmış kaplamalı cam slaytlar.
    Qiagen GmbH, Hilden Almanyawww.qiagen.com73504Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinden toplam RNA'nın saflaştırılması için
    Qiagen GmbH, Hilden Almanyawww.qiagen.com765134PAXgen ile sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinden toplam RNA'nın saflaştırılması için
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Almanyawww.zytovision.comZ-2015-200Meme kanseri örnekleri gibi katı malign neoplazmlarda sıklıkla gözlenen ERBB2 (diğer adıyla HER2) gen amplifikasyonunun tespiti için.
    3DHISTEC, Budapeşte, Macaristanwww.3dhistech.com40x/1.2 NA objektif, Dört bantlı filtreler (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filtreler ve 5.5Mpx, 16 bit, soğutmalı bilimsel CMOS (Tamamlayıcı Metal Oksit Yarı İletken) kamera ile donatılmış doku slaytlarını taramak için dijital cihaz.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com4368814Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti, 2 & mikroya kadar kantitatif dönüşüm için gerekli tüm bileşenleri içerir; g toplam RNA'dan tek sarmallı cDNA'ya tek bir 20 & mikro; L reaksiyonu.
    ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com 4367659PCR Master Mix, polimeraz, nükleotidler ve SYBR Green ile amplikonların nicelikleştirilmesi için kullanılır.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DEwww.thermofisher.comSer. Nr. F239Nükleik asit miktar tayini için spektrofotometre.
    QuantStudio 7 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemiwww.thermofisher.com4485701PCR makinesi,
    Vysis/Abbott Laboratuvarları. Abbott Park, Illinois, ABDwww.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#ordere.g. (ThermoBrite) 07J91-020Yerinde denatürasyon/hibridizasyon prosedürleri için sıcaklık kontrollü slayt işleme sistemi.

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714(2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    apraz Ba lamayan Tespit EdiciFormalin Sonras TespitNCFPE DokuFFPE Dokun Situ HibridizasyonRNA Kalite AnaliziKonfokal MikroskopiProteoliz Ad mDehidrasyon Serisi

    İlgili makaleler