Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout'larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
CRISPR / Cas9 genom mühendisliği sistemi, az çaba sarf ederek hassas genom düzenlemesine izin vererek biyolojiye devrim yarattı. Spesifikliği kazandıran tek bir rehber RNA (sgRNA) yardımıyla Cas9 proteini, her iki DNA zincirini hedeflenen lokusta parçalamaktadır. DNA kopması homolog olmayan bitiş katılma (NHEJ) veya homoloji yönelimli onarım (HDR) tetikleyebilir. HDR, daha büyük ve daha hassas pertürbasyonlara izin verirken, NHEJ, çerçeve kayması mutasyonlarına yol açan küçük delesyonlar veya eklemeler başlatabilir. Burada, çökertilmiş hücre hatlarının üretilmesi için protokolleri, kurulu CRISPR / Cas9 yöntemlerini downstream seçim / tarama için iki seçenek ile birleştirerek sunuyoruz. NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seleksiyondan bağımsız taramayı kullanır; burada, protein üretiminin nokta imünoblotuyla yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği yerdir. HDR yaklaşımı ilgi geni boyunca uzanan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Sağlanan HDR şablonuyla birlikte bu yöntem silme gerçekleştirebilirEklenebilen seçilebilir direnç işaretleyicisinin yardımıyla, onlarca kb arasında değişir. Her bir yöntemin uygun uygulamaları ve avantajları tartışılmıştır.
Giriş
Kararlı genetik değişiklikler, verimlilik ve süre bakımından değişken olabilen geçici hücresel pertürbasyon yöntemlerine göre bir avantaj sağlar. Genomik düzenleme, çinko parmak nükleazları 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN'ler) 6 , 7 , 8 , 9 gibi hedefe spesifik nükleazların gelişimi nedeniyle son yıllarda giderek yaygınla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. İstenilen Silinme Çevresindeki Homoloji Bölgelerinin Belirlenmesi
NOT: Yalnızca seçim temelli düzenleme kullanılıyorsa gereklidir.
- HDR şablonunda homoloji kolları olarak görev yapacak istenen silme yerinin her iki tarafında başlangıçta 1.5-2 kb olan iki bölge seçin ( Şekil 1A ). Klonlamayı kolaylaştırmak için her iki zincirde (GGTCTC) BsaI tanıma sitelerinden yoksun bölgeler belirleyin. BsaI siteleri kaçınılmazsa alternatif bir IIs kısıtlama enzimi (BsmBI, SapI, BbsI) kullanın ve alıcı plazmitteki karşılık gelen siteleri (pUC19-BsaI), direnç markörü verici plasmidini (pGolden-Neo veya pGolden-Hy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ELAVL1 nakavt hatlarının üretilmesi için sağlam bir antikor mevcuttu, bu nedenle tek sgRNA'lar ( Şekil 1A , solda) kullanılarak düzenleme, ardından nokta immünoblot uygulandı. Elde edilen klonlarda verimlilikleri karşılaştırmak ve hedef etkileri dışarıda bırakmak için bağımsız olarak üç sgRNA transfekte edildi. Hücre lizatlarını, iki nitroselüloz zar üzerine klonal popülasyondan toplayıp blotladıktan sonra lekeler hem ELAVL1 hem de PUM2 için (normalizasy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CRISPR / Cas9 sistemi, diğer geçici manipülasyon yöntemlerine daha tutarlı bir alternatif sağlayan stabil genomik modifikasyonların verimli bir şekilde oluşturulmasına izin vermiştir. Burada, memeli hücre hatlarında CRISPR / Cas9 gen nakavtın hızlı tanımlanması için iki yöntem sunduk. Her iki yöntem de çok az hücresel malzeme gerektirir, bu nedenle test, klonal kültüre ait erken safhalarda yapılabilir, zamandan ve reaktiflerden tasarruf edilebilir. Her iki yöntemin verimliliğini artırmak için verimliliklerin sekansa ve .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Teşekkürler
Yazarlar, deneysel yardım için Gissell Sanchez, Megan Lee ve Jason Estep'i ve reaktifleri paylaşmak için Weifeng Gu ve Xuemei Chen'i onaylamak istiyorlar.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yetkili E. coli hücreleri | |||
| plazmid hazırlama kiti | |||
| pSpCas9(BB) plazmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, sgRNA'ların klonlanması |
| BbsI enzimi | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, sgRNA'ların klonlanması |
| T7 DNA ligaz | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, sgRNA'ların klonlanması |
| Tango Tamponu | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, sgRNA'ların klonlanması |
| PlazmidSafe eksonükleaz | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, sgRNA'ların klonlanması |
| Q5 sıcak başlangıç yüksek kaliteli polimeraz | NEB | M0494A | HA amplifikasyonu |
| pUC19-BsaI | Modifiye pUC19 plazmidi, mevcut BsaI bölgesini mutasyona uğrattı ve BamHI/EcoRI sindiriminden sonra dışa bakan iki BsaI bölgesi yerleştirildi | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Direnç kaseti |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Direnç kaseti |
| BsaI enzimi | NEB | R3535S | Homoloji kolu yapısı |
| T7 DNA ligaz | NEB | M0318L | |
| PlazmidSafe eksonükleaz | Epicentre | E3105K | |
| Kürdan | bakteriyel PCR | ||
| Taq polimeraz | bakteri kolonisi PCR | ||
| HEK293 insan hücreleri | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penisilin-Strep (isteğe bağlı) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 kuyulu plakalar | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfeksiyon Reaktifi | Mirus | MIR2300 | sadece lipofeksiyon için |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | sadece lipofeksiyon için |
| G418 (Neomisin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Higromisin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 kuyulu plakalar | ThermoFisher | 12556008 | |
| Pasif Lizis Tamponu, 5x | Promega | ||
| 1x SDS yükleme tamponu | tarifi protokolde açıklanmıştır | ||
| Nitroselüloz Membran | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | tarifi protokolde açıklanmıştır | ||
| Susuz süt | |||
| HRP konjuge ikincil antikorlar için | SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Substrat | ThermoFisher | 34075 |
| Quantabio | 95091-025 | ||
Kaynaklar
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
