Yöntem makalesi

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

DOI:

10.3791/55917

⸱

14 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Von Willebrand faktör (VWF) trombosit adezyonu ve endotel hasarı sitelerdeki toplama aracılık eder ve bu faktör VIII dolaşımda taşıyan bir multimeric glikoprotein koagülasyon faktördür. VWF endotel hücreleri tarafından sentezlenir ve de yapısal plazma serbest bırakılır veya Weibel Palade organları (WPBs) adı verilen özel organelleri içinde yanıt Kan durdurucu sargı meydan okuma olarak isteğe bağlı yayın için depolanır. Procoagulant ve proinflamatuar uyaranlara hızla WPB ekzositozu ve VWF yayın teşvik edebilirsiniz. Endotel hücreleri tarafından yayımlanan VWF çoğunluğu plazmada dolaşır; Ancak, VWF bir kısmı endotel hücre yüzeyine demirli. Fizyolojik kesme koşullar altında endotel demirlemiş VWF nidus trombüsü oluşumu temsil edebilir bir VWF-trombosit dize oluşturan trombosit için bağlayabilirsiniz. Bir akış odası sistemi görsel olarak endotel hücreleri VWF sürümünden ve tekrarlanabilir ve VWF aracılı trombüsü oluşumu Patofizyoloji alakalı bir şekilde yakalamak sonraki trombosit gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, endotel hücreleri bir akış odasında kültürlü ve daha sonra secretagogues ile WPB ekzositozu ikna etmek için teşvik vardır. Yıkanmış trombosit sonra aktive endotel üzerinde derin. Trombosit aktif hale gelir ve daha sonra sıvı akış yönü uzun VWF dizelerinde bağlayın. Hücre dışı Histon procoagulant ve proinflamatuar uyarıcı kullanarak, biz endotel hücreleri Histon tedavi tedavi edilmezse endotel hücrelere göre artan VWF-trombosit dize oluşumu gözlenen. Bu iletişim kuralı bir nicel, görsel ve gerçek zamanlı değerlendirme modelleri trombozu ve hemostaz VWF-trombosit etkileşimleri aktivasyon açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tromboz ölüm dünya çapında1 önde gelen nedenidir ve yanıt todysregulated trombosit aktivasyon ve Trombin nesil her iki veinsand arterler içinde gelişebilir. VWF plazma seviyeleri kan pıhtılaşması anahtar bir regülatör, mademki düzeyleri düşük (< % 50) von Willebrand hastalığı (VWD)2 ve yüksek düzeyleri olarak bilinen kanama bozukluğu sonucu (> % 150) Venöz3 riski ile ilişkili olan ve Arteryel4 tromboz.

VWF megakaryocytes ve endotel hücreleri tarafından sentezlenen ve trombosit α-granül ve WPBs, sırasıyla depolanan bir multimeric glikoprotein var. Kan durdurucu sargı meydan okuma, VWF endotel WPBs aktive endotel hücreleri5 veya maruz kollajen damar duvarı6dolaşımdaki trombositler urgan üzerinden yayınlanacak. VWF endotel hücrelere ankraj P-selektin7 ve integrin αvβ38tarafından aracılı olduğu gösterilmiştir. Trombosit α-granül mağazaları sonraki sürümü daha da trombosit-trombosit etkileşimleri trombosit tak oluşumu, koagülasyon cascade ve fibrin yayılması için gerekli iskele için stabilize etmek için yerelleştirilmiş VWF konsantrasyonları artırabilirsiniz Yeminli ifade. VWF trombosit-bağlama etkinliği tarafından multimeric yapısı, daha fazla kan durdurucu sargı aktivite9,10sahip yüksek molekül ağırlığı multimers ile düzenlenmiştir. Dolaşımda, VWF da pıhtılaşma faktör VIII bir taşıyıcı olarak davranır.

Sıvı kesme stres VWF Fizyoloji temel bir düzenleyicisidir. Yamultma stres yokluğunda, VWF küresel bir formda, trombosit glikoprotein IB yapışma11için bağlayıcı etki alanlarını gizlemek bulunmaktadır. Yamultma stres olmadığı durumlarda, bir metalloprotease, bir disintegrin ve metalloprotease ile trombospondin motifi (ADAMTS13), bölünme sitesine maruz kalmaktadır. ADAMTS13 böylece onun kan durdurucu sargı etkinlik12azaltarak multimer boyutu, düzenleyen çıplak ve trombosit dekore edilmiş VWF dizeleri cleaves.

VWF bir Akut Faz proteinidir ve hipoksi13, enfeksiyon14ve proinflamatuar sitokinler, dahil olmak üzere çok sayıda çekim gücü, VWF yayın endotel hücrelerden aracılık gösterilmiştir. Benzer diğer inflamatuar ajanlar, hücre dışı Histon da sistemik VWF sürümde fareler15,16 ve trombosit vitro17,18, aktivasyonu teşvik gösterilmiştir 19. bu lizin farklılıkları olarak Histon alt türü bağımlı olmasını gösterildi ve arginin içerik işlev15etkileyebilir. Lysine açısından zengin (HK) etkisini araştırmak için bir akış odası kurmak için çalışma hedeflerimiz model ve arginin bakımından zengin (HR) Histon alt türlerini ve endotel VWF yayın ve gerçek zamanlı trombosit secretagogues yakalama, potansiyel erken olaylarda iltihap kaynaklı kan pıhtılaşması.

Bu akış odası metodoloji subendothelial kollajen, endotel hücreleri, VWF ve trombosit arasındaki etkileşimler vivo içinde görsel, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir vitro sistemde beyannamedir. VWF-trombosit etkileşimleri WPB salgılanması, trombosit aktivasyon ve VWF proteolizis dahil olmak üzere, düzenleyen yolu tüm yönleriyle gerçek zamanlı değerlendirmesi için sağlar. VWF çalışmalar kontrollü kesme stres koşullarında VWF yayın ve trombosit-bağlama işlevi20, WPB Fizyoloji21ve VWF bölünme zarar VWD mutasyonlar değerlendirmek için ADAMTS135tarafından kullanılmıştır. VWF-trombosit dize oluşumu sonucu iltihabi bir uyarıcı olarak ölçmek için bu yöntemi kullanın: hücre dışı Histon.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmalar araştırma Etik Kurulu, Kraliçe'nin üniversite, Kanada tarafından kabul edildi.

1. endotel hücre stimülasyon

  1. Kollajen-kat 6-iyi doku kültürü plaka.
    1. 24 s önceden, kat 6-iyi doku kültürü plaka kollajen 1 mL ile 37 ° C'de tampon (50 µg/mL sıçan kuyruk kollajen tip 1 ile 0,02 M buzul Asetik asit).
    2. Wells 2 mL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) ile iki kez yıkayın.
      Not: Tabak olabilir kalay folyo sarılı ve hava geçirmez bir plastik torba 4 ° C'de depolanan
  2. Tohum büyüme orta içeren % 10 fetal sığır serum (FBS) 2 mL bir kuyu başına 1 x 106 hücre yoğunluğu, endotel hücreleri. 24 h 37 ° C'de (%5 CO2) için hücreleri kuluçkaya.
    Not: Burada, kan akıbet endotel hücreleri (BOECs) pasajlar 5 ve 15 arasında kullanıldı. BOECs Starke vd içinde başvurulan bir yöntem kullanılarak wildtype VWF sırası ile sağlıklı gönüllü izole edildi 22 bir şekilde bir daha önce Jüpiter23tarafından açıklanan benzer.
  3. Orta 24 h sonra kaldırmak ve HBSS hücrelerle yıkayın.
  4. 1 mL serum-Alerjik orta (en az önemli büyüme orta FBS olmadan) içeren phorbol 12-myristate 13-asetat ekleyin (PMA; 100 nM), unfractionated Histon (UH) ve HK veya İK (25 µg/mL hiç) hücreleri için 2 h 37 ° C'de (%5 CO2) için.
    Not: Bu konsantrasyon Histon Xu et al. tarafından önceki vitro sitotoksisite raporlara dayanarak yapıldı. 24 ve Abrams ve ark. 50 µg/mL kullanılan 25 .
  5. Orta 2 h sonra toplamak ve analiz kadar-20 ° C'de saklayın.

2. VWF Quantification enzim bağlı Immunosorbent Assay (ELISA) tarafından

  1. Mikroplaka arabellek (10 mM dibasic sodyum fosfat ve 145 mM Sodyum Klorür, pH 7.2) içeren 10 µg/mL poliklonal anti-VWF antikor gecede 4 ° C'de kaplama 100 µL ile kat
  2. Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL tabak yıkama (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2).
  3. 1:2 ve 1:4 yıkama arabelleği ile orta ölçekli örnekler sulandırmak ve 1:10 başlayan bir standart eğri normal başvuru plazma kullanmak seyreltme.
  4. Seyreltilmiş örnekleri ve standartları gecede 4 ° C'de 100 µL plaka
  5. Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL plaka yıkayın.
  6. Seyreltilmiş anti-VWF, HRP Birleşik algılama antikor (1.1 µg/µL yıkama arabelleği) plaka 100 µL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  7. Plaka yıkama ve üreticinin yönergelerine göre O boya dihydrochloride (OPD) Reaktif ile 10 min için kuluçkaya.
  8. 100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4 ve okuma 492 plaka nm.

3. katı faz Histon-VWF bağlama tahlil

  1. Bir Mikroplaka % 0.5 sodyum deoxycholate 50 mM karbonat arabelleği (pH 9,6) gecede 4 ° C'de 10 µg/ml sulandırılmış Histon ile kat
  2. Üç kez 250 µL % 0.1 ile desteklenmiş PBS ile tabak yıkama ara 20, 10 dk arasında yıkama için kuluçka.
  3. PBS ile % 0,1 ara 20 ve % 1 sığır serum albümin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için takıma 200 µL ile plaka engellemek.
  4. 3.2 arasındaki adımları yineleyin.
  5. Seri olarak plazma kaynaklı insan VWF/faktör VIII karmaşık 200 mU/mL 25 mU/ml serum fizyolojik arabelleği seyreltik (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2). 100 µL oda sıcaklığında 2 h plaka ekleyin.
  6. 3.2 arasındaki adımları yineleyin.
  7. VWF bağlamaya immobilize Histon 100 µL HRP için oda sıcaklığında 1 h için Birleşik PBS-0.1% ara 20 ve 1:1,000 tavşan poliklonal anti-VWF antikor içeren bir çözüm kullanarak bulmak.
  8. 3.2 arasındaki adımları yineleyin.
  9. 100 µL ile 30 dk OPD reaktif plaka kuluçkaya ve 100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4. Optik yoğunluk itibariyle 492 ölçmek nm.

4. tohum akışı Chambers üzerine endotel hücreleri

  1. Kollajen-kaplama arabelleği (2.1. adımda açıklanan) 0.5 mL radarı-kilit 1 mL şırınga yükleyin.
  2. Şırınga radarı-kilit sonu bir akış odası slayt rezervuar twist.
  3. Pistonu yavaş yavaş tüm lane kaplı ve her depo dolu kadar basın. Her lane için yineleyin ve 24 saat için 37 ° C'de odası kuluçkaya.
  4. Kollajen-kaplama arabellek 200 μL pipet ile Aspire edin. 1 mL HBSS ile başka bir şırınga yüklemek ve dalgıç yavaş yavaş akış odasının her lane yıkamak için tuşuna basın. Yıkama akışı odası karşıt ucunda 200 μL pipet ile Aspire edin. İki kez tekrarlayın.
  5. Yaklaşık 100 µL % 10 büyüme ortamında 3 x 106 hücre/mL endotel hücre (BOEC) çözümünün pipet FBS lane, bir akış odasının içine.
    Not: Endotel hücreleri tohumlama yoğunluğu odası kapasitesini aşıyor. Bu maksimum kanal kapsama sağlamak için. yapışık olmayan hücreleri içinde belgili tanımlık sonraki yıkama adım kaldırılır.
  6. Odası 24 h değişiklik için 37 ° C'de orta radarı-kilit şırınga (aynı derecede içinde adım 4.4) kullanarak her 8-12 h kuluçkaya. Şerit içinde hava kabarcığı yok görünür olduğundan emin olun.

5. insan tam kan trombosit yalıtma

  1. Bir biyolojik Emanet 30 G iğne ile kabine, asit-sitrat dekstroz arabelleği (85 mM TRISODYUM sitrat, 111 mM D-glukoz ve 71 mM sitrik asit, pH 4.5) 300 µL bir katkı maddesi içermeyen 3 mL kan toplama tüp ekleyin.
  2. Tam kan (Anti-trombosit ve non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar yedi gün boyunca ücretsiz) sağlıklı gönüllülerden iz (3 mL üç tüpler), Bernardo ve ark26tarafından Yayınlanan benzer bir iletişim kuralı aşağıdaki toplamak.
  3. İz ile ilişkili ilk doku hasarı spontan trombosit aktivasyon neden olabilir ilk tüp atmak.
  4. Yavaşça vacutainers üç kez kan antikoagülan ile karıştırmak için tersine çevirin.
  5. Vacutainers vasıl 150 x g 24 ° c (oda sıcaklığında) 15 dakika santrifüj kapasitesi.
  6. Ve dikkatle 15 mL konik tüp transfer yavaş yavaş bir pipet ile (süpernatant) trombosit açısından zengin plazma biyolojik Emanet dolabı çıkarın. Her tüp trombosit açısından zengin hacmi potansiyel çapraz-harekete geçirmek önlemek için tek bir konik tüp için transfer.
    Not: Biyolojik Emanet bakteriyel kirlenme ve potansiyel yapay trombosit ve/veya endotel etkinleştirme önlemek için kabine trombosit yalıtım yapılmalıdır.
  7. 24 ° c (oda sıcaklığında) trombosit cips için 10 dk 900 x g, konik tüpler santrifüj kapasitesi.
  8. Pipet ve trombosit-yoksul süpernatant atın.
  9. Pelet dikkatle sitrat-glikoz-sodyum (CGS) arabelleği (13 mM sodyum sitrat, 30 mM D-glukoz ve 120 mM Sodyum Klorür, pH 7,0) 1 mL ile yıkayın.
    Not: Trombosit-ecek gözükmek WISP benzeri oluşumlar CGS arabellek eklendiğinde ve Pelet hafifçe resuspended. Yapılan trombosit aktivasyon tarafından kontamine trombosit değil kolayca resuspend ve biçimsiz görünecektir.
  10. Bir kez tam olarak resuspended, 900 x g 10 min 24 ° c (oda sıcaklığında) için de örnekler santrifüj kapasitesi.
  11. CGS yıkama arabellek kaldırmak ve Pelet Tyrode'nın arabellek (138 mM Sodyum Klorür, 5.5 mM D-glikoz, 12 mM sodyum bikarbonat, 2,9 mM Potasyum klorür ve 0,36 mM dibasic sodyum fosfat, pH 7,4) 3 mL resuspend. Trombosit tam resuspension emin olun ve toplamalardan gözlenir, örnek atmak.
  12. 20 mM DiOC6 hisse senedi çözüm (erime 57.25 mg 5 ml metanol) 1,5 µL 1 µM son bir konsantrasyon için yıkanmış trombosit her 3 mL konik tüp ekleyin.
    Not: DIOC6 etiket trombosit için bu deneyde kullanılan yeşil flüoresan mitokondrial boya var.
  13. Üç 1,5 mL microcentrifuge tüpler yıkanmış trombosit çözümü aliquot 1 mL.
    Not: Bu deneme için gerekli trombosit cilt akışı odası, istenen kesme stres ve deney (adım 6.5) uzunluğu boyutu üzerinde temel alınarak hesaplanır. Sıvı akış için yeterli hacim olması için koşullar değiştikçe bu protokol ayarlanabilir.
  14. 2s tecrit içinde yıkanmış trombosit kullanın.

6. akış aparatı montaj

  1. Steril silikon bir erkek dirsek radarı bağlayıcıyı bir ucunda ve diğer kadın radarı kilit adaptörü (1.6 mm iç çapı) boru 70 cm parçası ekleyin.
  2. 20 mL şırınga için tüp bağlı kadın radarı kilit adaptörü takın.
  3. 6.1 ve 6.2 iki kez üç özdeş şırınga-boru bağlantıları oluşturmak için adımları yineleyin.
  4. Bir şırınga pompa sıvı akış oluşturmak için kullanın. Giriş şırınga pompa içine aşağıdaki ayarları: iç çapı şırınga ve akış hızı.
    Not: 20 mL şırınga bir 19.55 mm iç çapında. Akış hızı temel alınarak istenen kesme hızı/makaslama stres ve akış odası boyutları hesaplanır. 1 dyn/cm2 (içinde gözlenen düşük Venöz kesme), elde etmek için mevcut çalışmada kullanılan akış odası için bir akış hızı 9,37 µL/dk gereklidir. Histon Venöz tromboz için bağlama kanıt yüzünden orta Venöz bükme 4,45 dyn/cm2 seçilir. Bu da tampon su benzer bir viskozite vardır varsayımına dayanır. Akış hızı sonra çeşitli akış odası boyutları için akış hızı-ebilmek bulunmak vasýl hesaplamakta kullanılan 41.7 µL/dak denklemler için eşittir:
    1. Pompa enjektör pompa üzerinde düğme seçeneğini kullanarak sıvı geri ayarlayın.
  5. Enjektör pompa tüp bağlı üç şırınga yük ve şırıngalar ve itici etrafına köşeli ayraçlar sıkıca güvenli.
  6. Erkek dirsek radarı ikinci 20 cm biteviye-in steril silikon tüp her iki ucuna iliştirin.
  7. Bir dirsek radarı körelmenin 18'lik iğne için bağlayın.
  8. İki kez, akış odası için şerit üç üç özdeş Intake Sistemleri oluşturma tekrarlayın.
    Not: Yeniden önce distile su ve ardından % 10 çamaşır suyu ile silikon tüp ve yapma yıkanabilir. Bu akış odaları yeniden kullanmak için tavsiye edilmez.

7. mikroskop ayarları

  1. Tam otomatik bir sahne ile donatılmış bir iplik disk mikroskop kullanın. Aydınlatma ile 405, 458, 491, 543 ve 633 nm lazer çizgiler sağlar bir lazer denize indirmek gerçekleştirin. 20 X amacı ile tüm görüntüleri yakalamak. Analiz yazılımı (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) ile tüm parametreleri ayarlayın.
  2. Kanal ayarları seçin (emisyon filtre: 520/35), 491, uyarma ile nm, Alım için. Tam dinamik veri aralığı elde etmek için şarj kuplajlı cihaz 150, 200 MS, bir çekim hızı ile bir elektron çarparak kazanç için çarparak elektron ayarlayın.
    Not: Bir yeşil flüoresan boya, DiOC6, dalga boyu maxima ile trombosit etiketli (uyarma, 482 nm; emisyon, 504 nm).
  3. 491 nm lazer güç % 20 için ayarlayın.
  4. Tüm şerit üç Merkezi işaretlemek ve z aralığı için 1 mikron ve 0.5 mikron adım boyu için seçin. Her 10 saat Puanlar (Yani, süre) ve bir yansımasını yakalamak için görüntüleri (Yani, aralığı) arasındaki süre seçin s; "60 saat puan" slayt seçin. Şerit üç görüntüleri yakalama ve bunları bir belirlenen deneme klasöre kaydetmek için mikroskop ayarlayın.
    Not: akış odası şerit üç olduğundan, çekim için üç pozisyon arasında geçiş yapmak mikroskop gerekir.

8. VWF-trombosit dize oluşumu

  1. Kültür orta akış odasından (Adım 4) kaldırmak adım 4.4 olduğu gibi aynı tekniği kullanarak.
  2. Her iki histamin (25 µM), PMA 100 µL ekleyin (100 nM), UH, HK veya 15 dakika oda sıcaklığında ve ortam O2co2BOEC monolayer uyarmak için (aynı derecede içinde adım 1.4) serum serbest ortamda seyreltilmiş HR (25 µg/mL hiç).
    Not: VWF yayımı için değil gerekli olmasa da, bu uyarımı 37 ° C de performans VWF ekzositozu27artıracaktır.
  3. Bunu üç sağlamak akışı odası ayrı şerit deneysel bir denetimi olarak işlenmemiş kalır.
  4. 1 mL şırınga kullanarak orta kaldırmak ve 100-200 µL endotel monolayer kapalı secretagogues yıkamak için PBS, onun yerine.
  5. Akış odası yer odasında güvenliğini sağlamak için vasküler küçük resimleri kullanma bir slayt stand üzerine monte.
  6. Kullanılabilir erkek radarı konektörü (şırınga için bağlı) 70 cm boru ucundaki akışı odası rezervuarı iliştirin. İki diğer akış odası şerit için yineleyin.
  7. PBS yıkama kaldırmak için şırınga pompa başlatın. Karşıt akışı odası rezervuar içine pipet ek PBS şerit kuru çalıştırmayın emin olmak için.
  8. Akış sistemi eşdeğer akışı için tüm üç yolları gözlemlemek ve şırınga pompa duraklayın.
  9. Albümdeki her lane, deneyler arasında kabaca aynı bölgede orta hakkında yakalamak için bir alan seçin.
    Not: mikroskop çalışan kişi deneysel koşullar kör. Bu adım mikroskop trombosit akışı önce odaklanmıştır sağlar (7. adıma bakın).
  10. Bir kadın radarı coupler eklemek 5 mL şırınga ve daha sonra ücretsiz erkek radarı konektörü (adım 6,8) ve yıkanmış trombosit solüsyon (Adım 5.13) içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp körelmenin iğneyi daldırın. Yavaş yavaş yok hava kabarcıkları sistemi içinde emin olmak için tüp ile trombosit çözüme çizin.
  11. 5 mL şırınga kaldırmak ve erkek radarı akışı odası açık rezervuarı ekleyebilirsiniz. Üç şerit için yineleyin.
  12. Enjektör pompa yeniden başlatın ve karanlıkta 10 min için adım 7 mikroskop ve iletişim kuralı ayarlarını kullanma trombosit akışı sırasında esir alma imge.
  13. 10 dk sonra radarı akışı odası rezervuar üzerinde emme boru bağlantısını kesmek ve rezervuar üzerinde endotel monolayer akışını korumak için PBS ile doldurun.

9. VWF-trombosit dize miktar

Not: PBS, sürekli akış VWF-trombosit dize uzama görüntü analizi için korumak için gereklidir. Akışı kesilmesi küresel hale VWF neden olur ve VWF-trombosit dize miktar zarar. Bu görüntü yakalama sırasında her rezervuar PBS ile kontör için esastır. Bu adımı sırasında hücre daralma veya dekolmanı gözlem yapılırsa HBSS PBS değiştirebilirsiniz.

  1. İlk lane ile başlayan slaytın orta etrafında bir 20 X objektif lens kullanarak çakışma olmadan slayt başına 10 resim yakalama. Her lane için bu işlemi yineleyin.
    Not: su depoları çevreleyen alanları çalkantılı kesme stres nedeniyle kaçınılmalıdır.
  2. Görüntü işleme yazılımı kullanarak, parlaklığı ayarlamak yanında tıkırtı "görüntü,"Ayarlama"ve" Parlaklık/Kontrast."" Yapıştırılan trombosit-ebilmek var olmak görüş için yeterince iyi miktar kadar kaydırma çubuğunu sürükleyin.
  3. Üç veya daha fazla hizalanmış trombosit resimdeki gözlendiğinde VWF-trombosit dize kaydedin. Görüntüdeki tüm VWF-trombosit dizeleri saymak. Tüm 10 resimler için yineleyin ve deneme için ortalama.
    Not: miktar gerçekleştiren kişi için deneysel koşullar kör. Bu bağımsız çalışmalar8,28,29tarafından onaylandıktan gibi VWF için ortak leke gerekli değildir.
  4. Denemenin en az her salgılatıcı değerlendirmek için üç kez tekrarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrudan VWF yayın endotel hücrelerden Histon etkisini değerlendirmek için için 2 h serum-Alerjik orta içeren PMA (pozitif kontrolü), UH, İK ve HK Konfluent BOECs biz maruz. Biz HK indüklenen VWF protein (VWF:Ag) işlem görmüş endotel hücreleri (şekil 1) orta logosuna 2 kat artış gösterdi. BOECs Ah ve İK ile teşvik zaman ilginçtir, orada daha az VWF:Ag orta tedavi edilmemiş durumda algılandı. Histon için doğrudan30VWF bağlayabilirsiniz ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VWF-trombosit fizyolojik alaka VWF fizyon proteaz ADAMTS13 huzurunda onların hızlı dağılması nedeniyle tartışmalı kalır dizeleri, onlar trombosit alımı VWF tarafından bir sitede bir ölçülebilir vitro model olarak hizmet Histon düzeyleri5artışlar yerelleştirilmiş bir trombüsü varlığı şeklinde. Ayrıca, trombotik trombositopenik purpura (TTP) olarak - veya inflamatuar microenvironments - ADAMTS13 etkinlik-böyle eksik patolojiler içinde ADAMTS13 etkinliği inhibe VWF trombosit dizeleri viv...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alison Michels Frederick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu dan Kanada kurumları, Sağlık Araştırma (CIHR) bir alıcı var. Laura L. Swystun alıcının CIHR bursu var. David Lillicrap bir Kanada araştırma sandalyede moleküler hemostaz alıcı olduğunu. Bu çalışmada kısmen grant (paspas-97849) çalışan bir CIHR tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Buzağı-timus fraksiyone olmayan histonlar (UH)Worthington BiyokimyasalHLYSerumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)
Buzağı-timus lizin açısından zengin histonlar (HK)Sigma-AldrichH5505Serumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)
Buzağı-timus arginin açısından zengin histonlar (HR)Sigma-AldrichH4830Serumla azaltılmış ortamda sulandırıldı (5 mg / mL)
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)Sigma-AldrichP8139DMSO'da Yeniden Oluşturuldu (20 mM)
HistaminSigma-AldrichH7125-1GSuda Sulandırıldı (50 mg / mL)
3,3 'Diheksiloksakarbosiyanin İyodür (DiOC6)İnvitrojenD273Metanol (20 mM) içinde sulandırıldı
VWF ELISA
için Tavşan Anti-VWF Kaplama Antikoru DAKO A0082Tavşan Anti-VWF Tespit Antikoru, HRP konjugeDAKOP0026VWF ELISA ve histon-VWF bağlanma testi için
Nunc MaxiSorp düz tabanlı 96 kuyulu mikroplakalareBioscience44-2404-21Histon-VWF bağlama testi için
Immulon 4 HBX Düz Tabanlı Mikrotitre 96 Kuyulu PlakalarVWF ELISA
Humate-PCSL BehringN / A için Thermo Scientific3855Plazmadan türetilmiş insan von Willebrand faktör/faktör VIII kompleksi
Normal Referans PlazmaBioLogicCCNRP-05ELISA standart eğrisi
O-Fenilendiamin dihidroklorür (OPD) reaktifiSigma-AldrichP8287ThermoFisher Scientific aracılığıyla temin edilebilen eşdeğer ürün (Katalog Numarası: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Kültür ve başlangıç için BOEC
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin (HBSS)tohumlanmasıThermoFisher Scientific14025092
Sıçan kuyruğu Kollajen Tip 1Corning354236
Gibco Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıThermoFisher Bilimsel31985070Endotel hücre stimülasyonları için
METAMORF Mikroskopi Otomasyonu ve Görüntü Analiz YazılımıMoleküler CihazlarN/A
BD Vacutainer Kan Alma Tüpleri, KatkısızBD Biosciences366703
µ-Slide III 0.1 (akış odaları)IbidiBu ürünün üretimi durdurulmuştur. µ-Slide VI 0.1 (#80661) veya 0.4 (# 80601) kullanmanızı ve 4.45 dyn/cm2'lik bir kesme gerilimini korumak için gereken akış hızını ve trombosit hacmini yeniden hesaplamanızı öneririz
Silikon Boru 1.6 mm İç Çap: 5 m, sterilizeIbidi10842
Luer Kilit Konektörü Dişi: doğal Polipropilen, sterilizeIbidi10825
Dirsek Luer Konnektör Erkek: beyaz Polipropilen, sterilizeIbidi10802
Körelmiş 18G İğneBD Biosciences305180
20 mL şırıngalarBD Biosciences302830
Şırınga PompasıNew Era Pompa Sistemleri A.Ş. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum WaveFX- 4X1 eğirme diski mikroskobuQuorum TechnologiesN/A
Görüntü İşleme YazılımıImageJN/A
Hassasiyeti VWF için .

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

VWF trombosit Zincir Olu umuEndotelyal H cre K lt rTrombosit Perf zyonuSekretagog Stim lasyonuVWF Sal n mTrombosit Ba lanmasMikroskobik G r nt lemeHiston Stim lasyonuTromboz Modeli

İlgili makaleler