Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme
Bu makalede
Özet
Özet
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) miktarının biyomoleküler katlama ve bağlama etkileşimleri yöneten termodinamik parametreler için bir güçlü bir tekniktir. Bu bilgiler yeni ilaç bileşikler tasarımda önemlidir. Ancak, birçok pharmaceutically ilgili ligandlar DSC analizleri içinde kullanılan yüksek sıcaklıklarda kimyasal olarak kararsız vardır. Ligandlar ve termal olarak dönüştürülür ürünleri konsantrasyonları Kalorimetresi hücre içinde sürekli değişiyor çünkü böylece, bağlama etkileşimleri ölçme meydan okuyor. Burada, thermolabile ligandlar ve DSC dönüştürme işlemleri hızla katlama, bağlama ve ligand termodinamik ve Kinetik bilgi almak için bir iletişim kuralı'nı mevcut. DNA aptamer thermolabile ligand kokain bağlar MN4 için bizim yöntem uygulamış. Thermolabile ligand dönüştürme için hesapları yeni bir küresel uygun analiz kullanarak, tam bir katlama ve bağlama parametreler kümesi elde DSC deneyler bir çifti. Buna ek olarak, gösterdiğimiz oranı sabit thermolabile ligand dönüşüm için yalnızca bir ek DSC veri kümesi ile temin edilebilir. Biomolecule, yavaş katlanır, yavaş bağlama ve thermolabile ligand hızlı tükenmesi geri dönüşü olmayan toplama dahil olmak üzere belirlenmesi ve birkaç daha karmaşık senaryo verileri analiz etmek için yönergeler sunulmaktadır.
Giriş
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) quantitating biyomoleküler bağlama ve katlama etkileşimleri1,2,3için güçlü bir yöntem olduğunu. DSC gücü onun yetenek bağlama ve mekanizmaları katlama aydınlatmak ve karşılık gelen termodinamik parametreler2,3verim için içerir. Ayrıca, DSC çözüm fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilebilir ve etiketleme biomolecule veya ligand, örneğin, fluorophores, spin-etiketleri veya nükleer izotoplar4gerektirmez. Araç biomolecule ligand de denatüre için ge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. numune hazırlama
- İstenen biomolecule13arındırmak.
Not: 2 M NaCl üç kez deiyonize su 3 kDa molekül ağırlığı kesme membran ile santrifüj filtre kullanarak üç tur ardından karşı değiş tokuş sonra bu protokolü kullanır satın kokain bağlama DNA aptamer MN4. - Sentez ve arındırmak veya istenen thermolabile ligand13satın alın.
Not: MN4 thermolabile ligand kokain bağlar. MN4 da bir negatif kontrol ligand thermolability deneysel bu sıcaklıklarda kullanılır kinin bağlar. - Arabellekleri arıtılmış biomolecule diyaliz ve ligandlar (20 mM sodyum fosfat ve 140 mM NaCl tampon, pH 7.4, MN4 ve burada ku....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Thermolabile ligand DSC için temsilcisi veri şekil 1' de gösterilir. Thermolabile ligand bağlı pik yüksekliği ve pozisyon gittikçe vardiya bu ilişkisiz biomolecule doğru thermolabile ligand her inceden inceye gözden geçirmek ile (Şekil 1a) tükenmiş gibi. Ücretsiz denatürasyon profil thermolabile ligand dönüşüm (Şekil 1b) son nokta için bir başvuru olarak kullanılır. Veri kinin için bağlı MN4 için bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Değişiklikler ve sorun giderme
Şekil 1 ve Şekil 2 kullanılan küresel uygun analiz ayrıntılarını olmuştur daha önce açıklanan4. Burada, performans ve thermolabile ligandlar ile DSC bağlama deneyler analiz pratik açılardan anahat. Yalnız thermolabile ligand ligand çıkarılır için DSC temel alınan Not + biomolecule dataset, etkili bir şekilde serbest veya termal dönüşüm tarafından absorbe ısı dışarı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Teşekkürler
R. W. H. V McGill Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) eğitim programı içinde Bionanomachines tarafından desteklenmiştir. A. K. M., s. E. J. NSERC hibe 327028-09 (A. K. M) ve 238562 (s. E. J.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sodyum klorür | Kimyasal Impex | # 00829 | |
| Sodyum fosfat monobazik dihidrat | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodyum fosfat dibazik | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Moleküler biyoloji için deiyonize su | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 mikron steril şırınga filtreleri | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa santrifüj filtreler | Millipore UFC900324 | ||
| Diyaliz tüpü 0.5-1.0 kDa kesme | Spektrum Laboratuvarları | 131048 | |
| Silikon boru | VWR | 89068-474 | |
| Plastik DSC flanş kapakları | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Entegre DNA Teknolojileri | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Kokain | Sigma Aldrich | C008 | |
| Kinin | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III mikrokalorimetre | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun yazılımı | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze yazılımı | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Kaynaklar
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
