Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre kültür manken direnç arter

7.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55992

⸱

8 Eylül 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Bu makalede

Özet

Hücre kültür manken direnç arter yollar endotel, düz kas, veya endotel ve düz kas (myoendothelial junction) arasında sinyal diseksiyon için izin açıklanmıştır. Bu hücre kültür model kullanarak agonistler veya protein yalıtım, elektron mikroskopi veya ayirt seçici uygulama yararlı olabilir.

Özet

Myoendothelial kavşak (MEJ), küçük çaplı direnç arterler içinde benzersiz bir sinyal microdomain yerelleştirme spesifik proteinlerin ve vasküler sesi ve kan basıncı kontrol edebilirsiniz sinyal süreçlerin sergiler. Bu da bir projeksiyon endotel veya düz kas hücresi ve küçük nedeniyle (ortalama olarak, bir alan ~ 1 µm2), MEJ boyutu gibi yalıtım modunda çalışmaya zordur. Ancak, vitro MEJ oluşumu, endotel hücre polarizasyon ve proteinler ve süreçleri direnç damar duvarındaki sinyalizasyon disseksiyonu sağlar vasküler hücre ortak kültürü (VCCC) denilen bir hücre kültür modeli geliştirdik arterler. VCCC uygulamalar vardır ve farklı hücre türleri uygun şekilde uyarlanabilir. Model içinde vitro MEJs oluşabilir 0.4 µm gözenekli filtre karşı taraflarında yetiştirilen iki hücre tipleri oluşur. Burada VCCC yolu ile endotel, izolasyon ve kaplama hücre oluşturmak nasıl açıklamak MEJ ve daha sonra protein yalıtım veya etkinlik için kullanılabilir düz kas kesirler deneyleri. Katıştırılmış ve kesitli immünfloresan analiz için filtre sağlam hücre katmanları ile düzeltilebilir. Önemlisi, birçok buluşlar bu modelden sağlam direnç arterler, fizyolojik önemini vurgulamış kullanarak teyit edilmiştir.

Giriş

Küçük çaplı direnç arterlerde endotel (EC) ve düz kas hücreleri (SMC) bir ince iç elastik lamina (IEL) ayırır. Hücreler bu elastik matris deliklerden proje ve doğrudan sitoplazmik bağlantı yolu ile gap junction kanal1,2. Bu eşsiz yapının myoendothelial Kavşağı (MEJ) olarak adlandırılır. MEJ küçük (yaklaşık 0.5 µm vasküler yatağın bağlı olarak 0.5 µm x), hücresel projeksiyon ağırlıklı olarak endotel hücreleri oluşur fakat düz kas de3,4kaynaklı. Müfettişler bir dizi seçmeli olarak endotel ve düz kas5 arasında çift yönlü sinyal kolaylaştırmak için özellikle önemli bir konuma işleme MEJ oluşan ağlar sinyal büyük karmaşıklığı göstermiştir ,6,7,8,9,10.

Ancak, sinyal yolları MEJ, mekanik bir diseksiyon sağlam bir arter zordur. MEJ hücresel bir projeksiyon olduğundan, şu anda bir vivo içinde MEJ damar duvarından izole etmek mümkün değil. Bu nedenle, VCCC model1 geliştirilmiştir. Önemlisi, VCCC fizyolojik endotel Morfoloji11 ve apikal arasında sinyal polarizasyon çoğaltır ve hücre12MEJ bölümleri. Endotel hücre, MEJ için polarize olan alfa hemoglobin keşif kolaylaştırdı bu benzersiz model oldu. Alfa hemoglobin13ifade değil geleneksel kültürlü endotel hücreleri aksine bu. Araştırmacılar mikrovasküler endotel baktılar, özellikle niyet küçük çaplı direnç arterlerde oluşan sinyal yolları incelemek için ise VCCC, kültürlü endotel hücreleri kullanmak daha uygun olabilir.

Sağlam bir plastik eklemek küçük çaplı gözenekleri (çapı 0.4 µm) olan bir filtre içeren ortak kültür iki farklı hücre tipleri için kullanarak hücrelerin katmanlar arasında geçiş engeller. 10 µm mesafe içinde vivoönemli ölçüde daha uzun, ama hala MEJs protein Yerelleştirme ve ikinci haberci1 sinyal de dahil olmak üzere, in vivo özelliklerinin çoğunu çoğaltır hücreleri arasındaki sonuçlar , 14. Ayrıca, hücre türüne özgü bir agonist veya antagonisti belirli hücresel yuvası eklenmesi ile sinyal hedefleme için VCCC sağlar. Örneğin, EC kalsiyum şelasyon yapın için BAPTA-AM ile yükleme ve SMC phenylephrine14ile uyarıcı. Aksine diğer açıklamalar ortak kültür modelleri15,16,17,18,19,20,21, bu sağlar mRNA ve protein, filtre gözenekleri içinde farklı MEJ kesir dahil olmak üzere farklı kesirler yalıtma hakkında talimatlar. MRNA yerelleştirme veya transkripsiyon22, protein fosforilasyon12,23ve protein etkinlik12değişiklikler belirli incelenmesi için bu teknik için VCCC eklenmesini sağlar. İki hücre tipleri farklı biçimler11,18,24yılında kültür mümkündür ancak bu makalede EC filtre ve SMC üstünde tepe-in alt kaplama anlatacağız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. kaplama hücre VCCC

  1. kültür büyük 225 cm 2 şişeler EC ve SMC % 70-90 birleşmesi kadar 37 ° C'de steril koşullarda. SMC daha daha fazla EC kullanılan sağlamak; birincil insan EC ve SMC, EC genellikle 3 büyük şişeler SMC 1 büyük şişesi için kullanıyorsanız.
    1. Alt geçitler Primer hücre kullanın ve geçit 10 kullanmayın. Co kültürlü olmak alan kültür ortamı seçin. Birincil insan koroner arter için EC, EBM-2 EC Bazal medya EGM2 MV büyüme faktörleri ile kullanın. İçin birincil insan koroner SMC, SmBM SMC Bazal medya SmGM-2 büyüme faktörleri ile kullanın. Önce kültürlü hücrelerle, büyüme faktörleri medyaya ekle.
  2. VCCC gün 1 inşaatı: sprey büyük (150 mm) Petri yemekler ve kapakları dezenfektan ile (örneğin, Cavicide) ve uzak bir kağıt havlu veya hav bırakmayan mendil ile silin. O zaman Petri yemekler % 70 etanol (alkol) ile sprey ve mahallede hava kuru koyun.
  3. (Tablo reçetesi görmek) filtre ekler tabak steril koşullarda açın ve (filtre alt tarafı) SMC tarafında ekleme fibronektin çözüm ile kat. INSERT sağlanan 6-şey plaka tutarak, damlalıklı fibronektin çözüm yan aracılığıyla filtre yarısı alt (en fazla 1 mL) kaplı emin plaka, altına kesmiş.
  4. Sonra 30 dk fibronektin çözüm, oda sıcaklığında hücre kültür Hood ile tedavinin ekler plaka dışında al, herhangi bir fazla çözüm ve ters çevir'i temiz Petri kabına yarısı altına yerleştirerek, vakum. Bir kenara koyun. Filtre Ekle membran aşırı çözüm emme olduğunda bozmamaya dikkat edin; Bu yavaşça plaka devirme ve çözüm ekleme kenarına kapalı vakumlama önlenebilir.
  5. Trypsinize 225 cm 2 şişeye SMC, 3 mL Önceden ısıtılmış 2 X tripsin-EDTA çözüm, ve bir kez hücreleri plaka kaldırdı ile 9 mL SMC medya tripsin (3:1, medya: tripsin) nötralize etmek için ekleyin. Aktarım için konik bir tüp, mix iyi ve damlalıklı 10 µL üzerine cep numarasını belirlemek için bir hemasitometre.
    1. Sayısı 5 x 5 hücre sayısı kutuları (Yani, 18), bu hücre sayısı 1 mL (180.000) almak için 10.000 çarpmak. O zaman 12 mL (toplam hacmi hücre süspansiyon, 2.16 milyon SMC) tarafından çarpın. Wells için istediğiniz sayıyı plaka için yeterli SMC olduğundan emin olun.
      Not: Örneğin, 1 de 75.000 SMC olmalı ve böylece 18 wells 1.35 milyon toplam SMC olurdu. 1 mL başına 180.000 hücreleri tarafından gerekli 1.35 milyon Hücre Böl ve kaplama için gerekli olacak hücre süspansiyon 7.5 mL sonuçlanır. Sonra gerekli son hacim hesaplamak (18 kuyu x 750 µL 13.5 mL =). Böylece, hücre süspansiyon 7.5 mL al, ses getirmek Önceden ısıtılmış SMC medya ve mix iyi ile ilâ 13,5 mL.
  6. Plaka 750 µL yaklaşık her süzgeç, alt tarafında üzerine 75.000 SMC bir medya ve hücre çözüm bile ziyan değil dikkatli içeren hücre süspansiyon. Kapağı üstüne yerleştirin ve dikkatle Petri kabına ekler ile 37 ° C'de kuluçka makinesi içine gecede transfer.
    Not: Diğer hücre tipleri için optimum hücre yoğunluğu ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
  7. 2 günde temiz 6 iyi yemekler taze, Önceden ısıtılmış SMC medya 2 mL ile doldurulması. Tabakları da kuluçka kaldırın. Ekler tek tek dışarı almak ve medya tarafından emme kaldırmak sonra yer SMC medya ile 6-iyi çanak içine.
  8. Filtre (EC yan) karşı tarafına 1 mL için en az 30 dk. %37 0.5 sığır jelatin çözeltisi ile kat ° C.
  9. EC 225 cm 2 flask(s) Önceden ısıtılmış 2 3 mL ile trypsinize X tripsin-EDTA (10 x seyreltilmiş steril Dulbecco ' s PBS) hücreleri plaka dışına Asansör için balonun nazik dokunarak ile çözüm.
    Not: Şişeye geri 37 ° C'de kuluçka 1-3 dakika içine yerleştirmek için gerekli olabilir.
      Bir kez
    1. hücreleri plaka kaldırdı tripsin (3:1) nötralize etmek için 9 mL EC medya ekleyin. Konik bir tüp, havuzu birlikte transfer, mix iyi ve damlalıklı 10 µL üzerine cep numarasını belirlemek için bir hemasitometre.
      1. Sayısı 5 x 5 hücre sayısı kutuları (Yani, 60), bu hücre sayısı 1 mL (600.000) almak için 10.000 çarpmak. O zaman 12 mL (toplam hacmi hücre süspansiyon, 7.2 milyon EC) tarafından çarpın. Wells için istediğiniz sayıyı plaka için yeterli EC olduğundan emin olun.
        Not: İyi yaklaşık 360.000 EC gereklidir. Örneğin, 18 wells 6.48 milyon EC gerektirir 600.000 EC 1 mL başına gerekli 6.48 milyon Hücre Böl ve kaplama için gerekli olacak hücre süspansiyon 10.8 mL sonuçlanır. Sonra gerekli son hacim hesaplamak (18 kuyu 1 mL = 18 mL x). Böylece, hücre süspansiyon 10.8 mL al, birim kadar getirmek ile 18 mL önceden EC medya ısıttı ve yavaşça resuspend.
  10. 1 mL her INSERT filtre üst kısmı üzerine 360.000 EC plaka. 24 h yerine orta gün 4'te 37 ° C'de rahatsız edilmeden kuluçkaya hücreleri izin. Hasat günde 5.

2. VCCC gelen kesirler hasat

  1. 4 ° C Oda izolasyonda gerçekleştirmek ve tüm aletleri buz üzerinde tutmak
  2. İzole bireysel ekleme sayısı göz önünde bulundurun ve lizis arabellek MEJ (için izole filtreler) etiketli bir 50 mL tüp ekleyin. O zaman etiket iki 10 mm tabağı; bir at, bir SMC için.
  3. Bağlı olarak nasıl konsantre lysate olması gerekiyor; 15 için ekler lizis arabellek hacmi, 500 µL lizis arabelleği MEJ tüpü ve Petri kabına başına 250 µL tavsiye edilir ayarlama.
  4. İş ekler bir seferde bir 6-şey plakalı. Hücre kültür hood ve buz soğuk bir odaya ışınlamaya ortamda kapalı emme
    Not: Aşağıdaki talimatlar 1 yalıtım eklemek için geçerlidir.
  5. 1 x PBS SMC yan ucun üzerine damlalıklı 10 µL.
  6. Ekleme, bir ucunu hücrelere aşağı kazımak için hücre kaldırıcı kullanmak ve onu arabellekte lizis var SMC Petri kabına için hırsızı hücrelerden transfer
    7. Hücre lifter çanak lizis arabellekte dokundu bir kez
  7. Bu kadar edilmiş tamamen sildi ve kağıt havlu üzerinde kurutulur Ekle filtresi dokunmak izin vermez. Kalan SMC hücre artıkları tamamen kaldırmak için kazıma SMC filtre en az bir iki kez yineleyin.
  8. Üzerinde ekleme ve damlalıklı 10 µL 1 x PBS, INSERT filtre üst/EC yan içine açın. 2.6 ve 2.7 hücre kazıyıcı ve EC Petri kapları ile yineleyin.
  9. Kalan hücre ve PBS Bulamaç için lizis arabelleği ile EC Petri kabına pipet ve transfer filtresiyle EC tarafındaki toplanır. Hücreleri her iki tarafında en az EC/SMC kirlenme MEJ kesir terk olarak filtre dışına kazıma çok kapsamlı olması.
  10. Neşteri plastik eklemek filtresinden kesmek için dikkatli kullanın. Kesme 70-80 %'plastik uzak bunu ve forseps tamamen kapalı plastik eklemek yapı filtresi çekmek için kullanın. Filtre ile lizis tampon MEJ etiketli 50 mL konik tüp içine koyun ve lizis arabellekte oturur ve ıslak kalır olun.
  11. Tüm ekler iþlenene kadar gruplar halinde 6, yalıtım adımları yineleyin.
  12. Farklı tedavi grupları ayrı tüpler ve yemekleri tutulmasını sağlamak.
  13. Girdap 50 mL MEJ konik tüp 15 tam güçte s veya iyi kadar karışık. En fazla protein ve sıvı tüp terk olarak tüp yan duvarlar boyunca sürükleyerek Forseps ile MEJ konik filtreleri kaldırın. Bu noktadan sonra filtreleri atın.
    14. Bir kez tüm filtreleri MEJ konik tüp sizden çıkarmak
  14. yapmak bir tüm sıvı ve proteinler tüp altına çekmek için bir santrifüj hızlı spin (10-15 s max hız ~ 16.000 x g). MEJ tüp ve EC ve SMC Petri yemekler içeriğini ayrı, daha küçük santrifüj tüpler içine aktarmak.
  15. İsteğe bağlı: MEJ/SMC/EC tüpler içeriğini solüsyon içeren temizleyicide 4 üç 10 s bakliyat için buza ayarlamak veya hafifçe el ile homojenize.
  16. Maksimum hızda (~ 16.000 x g) 15 dk santrifüj kapasitesi 4'te ° C. damlalıklı süpernatant dışarı ve lysate bicinchoninic tahlil yöntemi kullanarak protein içeriği için tahlil.

3. VCCC Tr yüz ayirt için hasat

  1. üzerinde gün 5 in VCCC kuluçka kuluçka makinesi ekler kaldırmak. Hücre kültür mahallede çalışma, SMC medya her INSERT filtre ve durulama 1 x PBS ile iki kez daha düşük Wells kapalı emme gerek. Tekrar EC yüzü.
  2. Ekler bozulmadan ve plaka tutarak, nazik bir shaker bir yürüyüş 4 ° C Oda %4 paraformaldehyde (PFA) 10-20 dk için ekleyin. 1 x PBS Ekle filtresiyle 5 min için her iki yıkama ve iki kere tekrar edin.
    Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınması gerekir.
  3. Engelleme, birincil ve ikincil antikor incubations plaka, her iki taraf için filtre antikor içinde tutulur sağlanması + çözüm engelleme gerçekleştirmek (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg sığır serum albümin, 500 µL normal serum)
  4. Bir slaytta bir neşter ile plastik eklemek dışında geçiren filtre filtre takmak için monte edilmiş kolu ve montaj orta ile mikroskop Slayttaki yer.

4. VCCC için enine ayirt hasat

  1. üzerinde gün 5 in VCCC kuluçka kuluçka makinesi ekler kaldırmak. Hücre kültür başlık Ekle filtrede her iki medya kapalı emme ve her iki tarafında iki kez 1 x PBS ile filtre durulayın.
  2. Ekler koruma sağlam ve 6-şey plaka eklemek %4 PFA ve gecede bir yürüyüş 4 ° C odada nazik bir shaker üzerinde kuluçkaya.
    Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınması gerekir.

5. VCCC enine ayirt için gömme

  1. sonra filtre ekler yaklaşık %4 24 h için düzeltilen PFA, transfer % 70 alkol en az 24 saat, ancak birkaç hafta kadar.
  2. (Gece) bir otomatik doku işlemcisindeki gerçekleştirmek uzun tarih filtreleri işlemek. Program aşağıdaki gibi kullanın: % 70 alkol 30 dk, % 85 alkol 30 dk, % 95 alkol 30 dk, %100 alkol 30 dk, %100 alkol 45 dk, %100 alkol 45 dk, Ksilen 30 dk, Ksilen 30 dk, Ksilen 45 min, 60 ° C için alkol 30 dk, 30 dk alkol 60 ° C , 60 ° C alkol 45 dk.
  3. İşlendikten sonra hasat filtreleri Sıvı parafin, filtre kasete tutmak içine gömme istasyona transfer.
  4. Dikkatle arasındaki sınırda tutmak için forseps kullanarak kaset, filtreyi kaldırın. Filtre, yarıya makasla yarım şeklinde iki yarı dairesel şekillendirme. Her 2 yarıya gömme istasyonu uzun gömme doldurmak için yeterli Sıvı parafin ile kalıp sadece soğuk plaka parçasındaki yatıyordu.
    5. Bir kez
  5. Sıvı parafin ile dolu çok kısa bir süre soğuk plaka gömme kalıp touch, sonra her biri için filtre (yan kısmak) kalıp katıştırma içine embed; bu kesit sırasında bir kenarına doğru filtre ortasından doğraması ki sağlar .
  6. Gömme sırasında forseps yerine parafin onları tek başına yeterince soğuk olana düşmesini içine yarım önlemek için filtre tutmak için kullanın. Tamamen katılaşmış kadar soğuk bir tabak için gömme kalıp taşımak.
    Not: blok buz tepsiler üzerinde soğutma yardımcı olur buruşuk bölümleri önlemek için.

6. Kesit ve enine ayirt VCCC boyama

  1. parafin blok için kesit ve montaj slayt: 5 µm bölümleri kesmek, Bölüm 42 ° C su banyosu yerleştirin ve pozitif yüklü kullanarak bölümleri Seç slaytlar. Sonra slaytlar gecede kurumaya 42 ° C fırında tutun.
  2. Rehidrasyon adımları başlamadan önce slaytlar parafin eritmek için 60 ° c fırında ve slayt VCCC bölümlerine uygun yardım. Kısaca serin, o zaman slaytlar arasında Ksilen, % 100 iki değişiklik rehydrate alkol, % 95 alkol, bir değişim % 70 alkol ve iki değişiklikler distile su.
  3. Mikrodalga veya bölümler slaytın dışına düşebilir gibi Isıtma dahil antijen alma yöntemleri kaçının.
  4. Gerçekleştir, oda sıcaklığında, sonra gece kuluçka 4 ° C'de birincil antikor ile 1 h için standart engelleme adımları ve 1 h için ikincil antikor oda sıcaklığında yıkayarak takip ettim. Montaj montaj medya ve coverslip.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

VCCC için kullanılan filtre ekler var küçük, 0.4 µm delik. Şekil 1A, VCCC filtre ilave bir tr yüz görünümünü MEJ vitrooluşabilir gözenekler gösterir. Şematik filtre alt tarafında bir gün önce endotel hücreleri karşı tarafta (şekil 1B) kaplama kaplama düz kas hücreleri gösterir. Sonra hücreleri kaplama, EC, MEJ ve SMC kesirler izole üç gün sonra olabilir. Bunun bir örneği şekil 2Aner...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

VCCC MEJs vitrorecapitulating açısından avantajları vardır, ama eğer VCCC-ebilmek var olmak kullanmak için belirli uygulama belirlerken tartışma noktaları vardır. Örneğin, farklı hücre türleri bu model ile kullanılmak üzere olduğunda optimize gerekir. Biz birincil insan hücreleri kullandık ama sığır aortas24veya wildtype ya da nakavt fareler hücreleri izole ve VCCC1,5,14' te kullanmak mümkündür.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal kalp tarafından desteklenmiştir, akciğer ve kan Enstitüsü R01088554, T32HL007284 ve Amerikan Kalp Derneği HGUGM bursu 14PRE20420024 verir. Biz özellikle St. Jude hücresel görüntüleme paylaşılan araştırma Randall Wakefield ve Linda Horner elektron mikroskobu görüntüler için Adam Straub temsilcisi ayirt görüntüleri hakkında yardım almak için ve onun için Pooneh Bagher dahil olmak üzere çekirdek, teşekkür el yazması Protokolü değerli geribildirim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 mm çap, 0,4 & m Transwell Polyester membran filtre ekiCorning3450Bu bir adet 6 oyuklu 225
cm'lik şişeCorning431082
6 oyuklu plakalar (filtre ekleri olmadan)Corning3506
Birincil insan koroner arter endotel hücreleriLonzaCC-2585
Birincil insan koroner arter düz kas hücreleriLonzaCC-2583
EBM-2 EC Bazal medyaLonzaCC-3156
EC büyüme faktörleri (EGM2 MV Tek quots)LonzaCC-4147Kullanmadan önce bazal ortama ekleyin
SmBM SMC bazal medyaLonzaCC-3181
SMC büyüme faktörleri (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Kullanmadan önce bazal ortama ekleyin
%0,5 Tripsin-EDTA 10XGibco15400-054Steril dPBS
HemositometreVWR15170-208
SMC Kaplama (150mm) için büyük petri kaplarıCorning353025
Sığır jelatiniSigmaG-9382
İnsan fibronektiniCorning3560085 & mikro; g / ml fibronektin ve -20'de saklayın
10x Hanks'in Tamponlu tuz çözeltisi (HBSS)Gibco14065-056Steril su ile 1x'e seyreltin
10x Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salin (dPBS)Gibco14200-075Steril su ile 1x'e seyreltin
Tek Kullanımlık Kavisli Neşter (30 mm kesme kenarı)saplı AmazonMDS15210
ForsepsFisher17-467-201
Hücre kaldırıcıCorning3008
Hücre sıyırıcıBD Falcon353085
50 mL konik tüpCorning352070
10 mm petri kaplarıFalcon35-1008
Rneasy mini kitQiagen74104
RNA lizis reaktifiQiagen79306
ParaformaldehitSigma158127dPBS% 70 etanol ile% 4 çözelti yapın
Fisher04-355-305
Havsit dezenfektanFisher131000
RIPA protein lizis tamponuSigmaR0278
Sonik ayırıcıFisherModel 50
EC / SMC hasadı için 1x PBS ve immünositokimyaGibco10010023steril olmasına gerek yoktur
İsimCompanyKatalog NumarasıComments
Gömme/Bölümleme/Boyama
ParafinFisherP31-500
Otomatik doku işleyiciExcelsiorES
Gömme istasyonu + soğuk plakaLeicaHistoCore Arcadia
Doku Tek Accu-Edge Mikrotom bıçağıVWR25608-961 veya 25608-964
Mikroskop slaytlarıThermo Fisher22-230-900
LamellerThermo Fisher12-548-5E
Prolong Gold montaj ortamıThermo FisherP36931
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Diğer Çözümler**Solüsyonu canlı hücrelerde kullanıyorsanız tüm adımları steril koşullarda gerçekleştirin
Steril dPBSSterilize etmek için otoklav suyu. Steril su kullanarak DPBS (450 mL steril su: 50 mL 10X DPBS) yapın, karıştırın ve filtreleyin sterilize edin (0.2 & mikro; m filtre).
Nihai konsantrasyon: Sterilize etmek için 1X
steril HBSSOtoklav suyu. Steril su kullanarak HBSS (450 mL steril su: 50 mL 10X HBSS) yapın, karıştırın ve filtreleyin sterilize edin (0.2 & mikro; m filtre).
Nihai konsantrasyon: 1X
Fibronektin stok çözeltisi1 mL alikot stoğu yapmak için fibronektin için 50 mL steril su kullanın, ardından gerekene kadar dondurun
Nihai konsantrasyon: 100 & g/mL
Fibronektin, VCCC'nin, bir alikotu çözdürmek ve 1 mL fibronektin (100 & mikro; g / mL) 5 & mikro'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1X HBSS'nin 19 mL'sine; g / mL.
Nihai konsantrasyon: 5 & mikro; g / mL
2x Tripsin EDTA çözeltisi10X 0.5% Tripsin-EDTA'yı 1X dPBS ile 2X'e seyreltin (40 mL DPBS: 10 mL 10X Tripsin) .
Nihai konsantrasyon: 2X
Engelleme / antikor çözeltisi(9 mL 1X PBS, 25 mL Triton X100, 50 mg sığır serum albümini, 500 mL normal serum)
EC VCCC'yikaplamak için sığır jelatini0.5 g sığır jelatinini 100 mL damıtılmış suya karıştırın. İlk kullanımdan önce otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın. Steril koşullarda saklayın.
Nihai konsantrasyon: %0,50
toplanması için 1x PBS'ninsteril olması gerekmez
ile 2X'e seyreltin SMC tarafını kaplamakHücrelerin

Kaynaklar

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123(2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Myoendotelyal BileşkeVasküler Hücre Ko-kültürüEndotelyal HücrelerDüz Kas HücreleriHücre Fraksiyonlamasıİmmünofloresan AnalizParafin GömmeWestern BlotProtein İzolasyonu
Hücre kültür manken direnç arter
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.