Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme
Bu makalede
Özet
Özet
Alzheimer hastalığı (Ah) bir toksik amiloid-β42 hangi birikimi (Aβ42) peptidler açar sinaptik bozulma, iltihap, nöronal ölüm nörodejeneratif hastalık zayıflatıcı, açıkları öğrenme 's. İnsanlar reklam durumunda kayıp nöronlar kısmen sinir kök/progenitor hücreler (NSPCs) ve düşük neurogenesis Engelli proliferatif kapasitesi nedeniyle yeniden olamaz. Bu nedenle, verimli rejeneratif terapiler de yayılması geliştirmek gerekir ve Nörojenik NSPCs. Zebra balığı (Danio rerio) kapasitesini rejeneratif bir organizmadır ve temel moleküler programlar hangi ile biz tasarım olabilir öğrenebilirsiniz Reklam mücadele için tedavi yaklaşımları. Bu nedenle, Zebra balığı bir reklam gibi modelinde nesil gerekliydi. Bizim metodoloji kullanarak, biz Aβ42 peptid sentetik türevleri doku delici kabiliyetine sahip yetişkin Zebra balığı beynine tanıtmak ve hastalık patoloji ve rejeneratif yanıt analiz. Mevcut yöntemler veya hayvan modelleri üzerinde o Zebra balığı nasıl omurgalı bir beyin doğal olarak yeniden ve böylece insan nörodejeneratif hastalıklar daha iyi endojen NSPCs hedefleyerek tedavisi için bize yardımcı bize öğretebilir avantajdır. Bu nedenle, Yetişkin Zebra balığı beyinde kurulan amiloid-toksisite modeli Nörobilim ve klinik tıp alanında araştırma için yeni yollar açılabilir. Ayrıca, bu yöntem basit yürütülmesi için maliyet-etkin ve verimli deneysel değerlendirme sağlar. Bu el yazması sentezi ve Aβ42 peptidler kod Zebra balığı beyin içine ekleme açıklar.
Giriş
Reklam nöronlar kaybı ile karakterize kronik ilerleyici bir hastalıktır ve serebral korteks1,2,3,4,5' te synapses. Reklam klasik neuropathological işaretlerinden amiloid peptidler birikimi vardır ve neurofibrillary oluşumu (NFTs)6ipliği. Senil plaklar, olarak da bilinen amiloid plaklar, β-Pileli yapıları içinde beyin parankimi5formu amiloid-β (Aβ) peptidler oluşur. Aβ42 birikimi reklam hastalarda, hastalığın ilerlemesinde erken ve kritik bir rol vardır. Sinapt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu iletişim kuralı EU kurallar tarafından önerilen bir standart bir uygulamadır (2010/63) ve Avrupa Toplum Biyoloji ve Tıp (EuFishBioMed) yılında Karlsruhe Enstitüsü, Teknoloji (KIT) Balık modelleri için. Sonra burada açıklanan tüm yöntemleri (Landesdirektion Dresden; belge numarası TVV-52/2015) etik Komisyonu tarafından onaylanmış olan.
1. hazırlık Aβ42 peptid
- Synthesize peptidler (bkz. Tablo 1) standart 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Kimya 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-ile kullanma tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) kaplin reaktif tarihinde bir otomatik katı fazlı peptid synthesizer
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
HPLC sentezlenmiş peptid arındırmak için kullanılan ve kütle spektrometresi arıtılmış amiloid β peptidler karakterize etmek için kullanılmıştır. HPLC sütun Aβ peptidler ayrılması geliştirmek için 50 ° C sıcak olduğu ve bütün fraksiyonları toplanmıştır. Doğru sentezlenmiş peptid tanımlamak için kütle spektroskopisi analiz tüm bölümler için gerçekleştirildi. UPLC Kromatografik bileşik saflığı gösterir. UPLC (Yani, gerekli amiloid Beta peptid oranında şarj etmek için doğru kitle) üz.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Amiloid peptidler sıra varyasyonları veya çeşitli Etiketler içerecek şekilde değiştirilmiş. Örneğin, şifreli amiloid peptid oluşturulabilir ve peptidler N-terminus peptid sonu itibariyle floresan etiketlerle etiketlenmiş ya da taşıyıcı peptidler39ile Etiketlenmiş. Benzer şekilde, bu protokol için taşıyıcı peptid hücre Penetran peptid TR etkinliğini nakliye kargo derin nedeniyle beyin doku39içine alınır. Ayrıca, bizim yöntem enjeksiyon ve toksik toplamalardan
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa yoktur
Teşekkürler
Bu eser DZNE ve Helmholtz Derneği (VH-NG-1021), CRTD, tarafından desteklenmiştir TU Dresden (FZ-111, 043_261518) ve DFG (KI1524/6) (C.K.); ve tarafından Leibniz Derneği (SAW-2011-IPF-2) ve BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Biz de Ulrike Hofmann peptid sentez ve Nandini Asokan, Prayag Murawala ve Elly Tanaka için yordamı çekimleri sırasında yardım için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fmoc korumalı amino asitler | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya) | Katı faz peptit sentezi için Fmoc bazlı amino asitler (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)üronyum hekzaflorofosfat (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya) | RL-1030 | Aktivatör |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya) | RL-1180 | Rasemizasyon baskılayıcı |
| N,N-Diizopropilaminlamin | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya) | SOL-003 | Baz |
| Dimetilformamid | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Almanya) | SOL-004 | Çözücü |
| N-Metilmorfolin | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Almanya | A12158 | Baz |
| 1-Hidroksibenzotriazol hidrat (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, ABD) | 157260 ALDRICH | Aktivatör |
| Piperidin | MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya) | 822299 | Fmoc koruma koruma azaltıcı |
| reaktif Diklormetan (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya) | 106050 | Çözücü |
| Formik asit (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya) | ||
| Trifloroasetik asit (TFA) | bileşeniMERCK KGaA ( Darmstadt, Almanya) | 808260 | Levage Karışım reaktifi |
| Triizopropilsilan (TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Almanya) | 233781 ALDRICH | Clevage Karışım reaktifi |
| Asetonitril (UPLC/LCMS için) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Çözücü |
| Asetonitril (HPLC için) | VWR International Ltd, İngiltere | 83639.320 | Çözücü |
| Diethylether | VWR International Ltd, İngiltere | 23811.326 | Peptit çökeltme için çözücü |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, İngiltere | 0281-25G | Çatal Karışım reaktifi |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amid reçine | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Almanya) | S30023 | SPPS |
| Peptit sentezi için katı faz 5 ml şırınga dahil filtreli | Intavis AG (Köln, Almanya) | 34.274 | filtresinden elde edilen klevaj için reaksiyon tüpü |
| Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa) | 11806-50-N | Çökeltilmiş peptitlerin filtrelenmesi | |
| Polivinilidenflorür (PVDF) şırınga filtresi | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | HPLC |
| Peptit Sentezleyici | Intavis, Köln, Almanya | ResPep SL | Otomatik katı fazlı peptit sentezleyici |
| Su İttifakı HPLC | Waters, Milford Massachusetts, ABD | Waters 2998, Waters e2695 | Yarı hazırlayıcı ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) |
| PolymerX, boncuk boyutu 10 & mu; m, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Almanya | 00G-4328-N0 | Gözenekli polistiren divinilbenzen HPLC sütunu |
| Milli-Q Advantage A10, Milli-Q filtreli | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, ABD | LCPAK0001 | Su arıtma sistemi |
| Filtrasyon Ünitesi | Sartorius Stedtim (Aubagne, Fransa) | 16307 | |
| peptit çökeltme UPLC Aquity için filtrasyon ünitesiWaters, Milford, Massachusetts, ABD | M09UPA 664M | LC-MS | |
| ACQUITY UPLC BEH C18 için analitik ters faz ultra HPLC, boncuk boyutu 1.7 & mu; m, 50x2.1 mm | Sular, Milford, Massachusetts, ABD | 186002350 | Analitik C18 sütunu |
| ACQUITY TQ Dedektörü | Sular, Milford, Massachusetts, ABD | QBB908 | Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Almanya | 16706, 101542 | Vakum pompalı liyofilizatör |
| Paradigma plaka okuyucu | Beckman Coulter | ||
| MESAB (etil-m-aminobenzoat metansülfonat) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri kapları | Sarstedt | 821.472 | |
| Fosfat tamponlu salin | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| İğne | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Diseksiyon mikroskobu | Olympus, Leica, Zeiss | üreticiye göre | |
| Dumont Cımbız | Dünya Hassas Aletler | 501985 | |
| Gillies Diseksiyon Forseps | Dünyası Hassas Aletler | 501265 | |
| Cam enjeksiyon kılcal damarları | Dünya Hassas Aletler | TWF10 | |
| PicoNozzle | Dünya Hassas Aletler | 5430-12 | |
| Pnömatik PicoPump | World Hassas Aletler | SYS-PV820 | |
| Halka aydınlatıcı; Halka Işık Kılavuzu | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Kriyostat | Leica | CM1950 |
Kaynaklar
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
