Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Reklam nöronlar kaybı ile karakterize kronik ilerleyici bir hastalıktır ve serebral korteks^1,2,3,4,5' te synapses. Reklam klasik neuropathological işaretlerinden amiloid peptidler birikimi vardır ve neurofibrillary oluşumu (NFTs)⁶ipliği. Senil plaklar, olarak da bilinen amiloid plaklar, β-Pileli yapıları içinde beyin parankimi⁵formu amiloid-β (Aβ) peptidler oluşur. Aβ42 birikimi reklam hastalarda, hastalığın ilerlemesinde erken ve kritik bir rol vardır. Sinaptik fonksiyon bozukluğu, Engelli plastisite ve nöronal kayıp^7,8,9,10önde gelen olaylar bir çağlayan reklam tetikler.

Teleost Zebra balığı yetişkin beyin düzenleme kök hücre plastisite^{11,12,13,14,15,} , eğitim için mükemmel bir model hizmet veren ^{16,17,18,19,20} ve^21,yılında^{22,23 de dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi (MSS), çeşitli hastalıklarda ,24}. Kullanılabilir deneysel yöntemleri^{19,20,25,26,27,28,29,} geniş bir dizi sayesinde ^{30 , 31}, bu çalışmalar bilgilendirici ve uygulanabilir. Zebra balığı CNS^{13,15,32,33,34,35,36,37doldurmak,} kısmen aktif nöron kaybı^{19,39,40,41,42,43}sonra^{, moleküler programları kullanarak, 38, 44}. Bu nedenle, nörodejeneratif hastalık modeli içinde Zebra balığı kurulması omurgalı beynindeki rejeneratif yeteneği ve kök hücre biyolojisi ile ilgili yeni soruları adresine yardımcı olabilir.

Son zamanlarda, sentetik Aβ42 peptidler (Tablo 1)³⁹enjekte edilerek yetişkin Zebra balığı beyin amiloid toksisite modelinde geliştirdik. Bu enjeksiyon neden ateş fenotipleri (örneğin, hücre ölümü, mikroglial harekete geçirmek, sinaptik bozulma ve bellek açıkları), insan beyninin patolojinin anımsatan Bu Zebra balığı-ebilmek var olmak kullanılmış için alabilme gösteren ateş Zebra balığı beyinde peptidler immunohistokimyasal stainings ve rejenerasyon CNS olabilir yetişkin Zebra balığı olarak moleküler mekanizmaları ile tespit edilebilir Aβ42³⁹tespit edilmiştir. Bu protokol için biz sentetik amiloid peptidler makarna bir cerebroventricular enjeksiyon (CVMI) yöntemi^27,39,45,46 kullanarak Zebra balığı beyin içine enjeksiyon göstermek Amiloid birikimi (şekil 1) taklit etmek için. CVMI enjeksiyon olarak β-sayfa yapıları üzerine toplamak ve toksisite sarfetmek peptidler, teslim yeni bir yol sağlar. Peptidler⁴⁵tüm rostro Kaudal eksen boyunca ventrikül alan hedefleme beyin boyunca eşit olarak dağıtılır. Ayrıca, bu yöntem amiloid kapanımlar takip yetişkin Zebra balığı beyinde NSPCs morfolojik ve moleküler yanıt analiz için sağlar. Bu tür çalışmalar bize memelilerde başarılı beyin tamir için bir fikir verecek. Bizim yöntem başarılı rejenerasyon yanıt gerekli moleküler mekanizması kayıp neurons ve fonksiyonel iyileşme ikmal ikna etmek için reklam benzeri belirtiler sonra anlamak için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı EU kurallar tarafından önerilen bir standart bir uygulamadır (2010/63) ve Avrupa Toplum Biyoloji ve Tıp (EuFishBioMed) yılında Karlsruhe Enstitüsü, Teknoloji (KIT) Balık modelleri için. Sonra burada açıklanan tüm yöntemleri (Landesdirektion Dresden; belge numarası TVV-52/2015) etik Komisyonu tarafından onaylanmış olan.

1. hazırlık Aβ42 peptid

1. Synthesize peptidler (bkz. Tablo 1) standart 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Kimya 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-ile kullanma tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) kaplin reaktif tarihinde bir otomatik katı fazlı peptid synthesizer ⁵² olarak. Sentez ölçeğini 100 µmol yapıldı.
2. 500 mg Fmoc korumalı reçine ile otomatik peptid synthesizer (yükleme kapasitesi 0,2 mmol/g) katı faz yükleyin. Çözünmüş Fmoc korumalı amino asit konsantrasyonu 0.5 M, yük hacimli gerekli ve ilgili synthesizer için hesaplanan olarak.
   Not: Her Fmoc korumalı amino asit kavraması her yapı taşı reçine ⁴⁷ 5 kere fazlalığı ile iki kez etkinleştirmek için hesaplamalar yapılır.
3. Dimethlyformamide (DMF) peptid sentezi için gerekli reaktifler geçiyoruz. Örneğin, Sigara tepki amino grupları kap için belgili tanımlık harekete geçirmek, HBTU, bir konsantrasyon 0,48 m, % 45 v/v N-Methylmorpholine (NMM) (temel) ve % 5 v/v asetik anhidrit (kapatma karışımı) adlı hazırlayın.
4. Trifluoroacetic asit (TFA) oluşan bir taze hazırlanmış bölünme karışımı bir karıştırıcı kullanarak sağlam destek sürekli karıştırılarak reçine tüm peptidler ayırmak: Triisopropylsilane(TIS): su: Dithiothreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), 4 h için kullanın 10 mL 100 µmol sentez ölçek için.
5. 100 mL buz gibi Dietil eter için bölünme karışımı ekleyerek cleaved ürün çökelti. 0,45 µm gözenek büyüklüğü ile politetrafloroetilin (PTFE) filtre ve yıkama ile 20 mL buz gibi Dietil eter içeren bir filtrasyon ünitesi üzerinden geçmek.
6. Filtre uygulanmış peptid filtre kağıdı toplamak ve erime 100 mg 5 ml zarlarını peptid deiyonize su distile: Asetonitril 1:1.
7. Ters fazlı yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) üzerinde Boncuk boyutu 10 µm gözenekli polistiren divinylbenzene sütun ile donatılmış bir yarı partiye hazırlık HPLC ile arındırmak.
   1. Sütun ön ısı ve 50 ° C cihazı Isıtma bir sütun kullanarak korumak. Degrade % %5 100 solvent B 25 dk 4 mL/dak., uygulayarak bir otomatik kesir toplayıcı kullanarak büyük kesirleri toplamak
      Not: Solvent A % 0,1 olduğunu TFA su ve solvent B % 0,1 olduğunu TFA Asetonitril ⁵².
   2. 220, Kromatografik izlemek nm, uygun doruklarına toplamak ve LC-Bayan kullanarak analiz
8. Onayla saflık tarafından analitik ters faz ultra yüksek basınç sıvı Kromatografi (UPLC) vasıl 220 nm UV bulmak ile örnek bir analitik C18 sütun (Boncuk boyutu 1.7 µm) üzerinden geçen süre izleme. Peptid ürün tarafından kütle spektrometresi onaylayın.
   Not: Bir electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESI-MS) ve Tandem Quadrupole Dedektör UPLC birleştiğinde.
9. Bir yuvarlak alt şişesi içinde istenen peptid doğru kesirler için kabarık bir toz 0,052 mbar, bir vakum uygulayarak lyophilize. Vakum pompası süresiz olarak-78 ° C. Store-80 ° C'de tutulan bir dondurucu birimine çift.
10. Kullanmak lyophilized peptid Asetonitril bir karışımı 1 mM stok çözeltisi hazırlamak için: DMF: analitik sınıf su 1:1:1 deneyler için. Peptidler Bu çözümde toplamak değil gibi bu eriyik-ebilmek var olmak stok en az 6 ay için.

2. Enjeksiyon karışım hazırlanması

1. lyophilized peptidler seyreltmek için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄, 2 mM KH ₂ PO ₄, pH 7,4) hazırlayın.
2. Peptid PBS 20 µM son bir konsantrasyon için geçiyoruz. Bu çözüm taze hazırlayın. İyice karıştırın ve buza enjeksiyon kadar saklayın. Çözüm toplamada önlemek için 30 dk fazla olamaz.

3. Anestezi

1. hazırla anestezikler, düzenli balık suda dolaşan üzerinden % 0,1 etil-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), hisse senedi çözüm sistem. Anestezi çözüm %0.0025 (v/v) son bir konsantrasyon için hazır olun.
2. Bir taşıma kaba 5 L sistem su ile onların tank balık için istediğiniz sayıyı kaldır.
3. Yarı-dolgu plastik bir Petri kabına (90 mm) 40 mL anestezi ile. Bu yemek için iğne kullanın.
4. Opercular hareketi sona erdi kadar anestezi balıkta kuluçkaya.

4. Cerebroventricular mikroenjeksiyon

1. enjeksiyon aparatı hazırlanması
   1. hazırla cam enjeksiyon kılcal bir iğne çektirmenin aşağıdaki parametreleriyle kullanma: Isıtma döngüsü, 537; çekerek döngüsü, 250; hız, 1,5 s; zaman, 80 Bayan
   2. basınç ayarı için 25 psi basınç kaynağı getirmek.
   3. Microinjector parametreleri şu şekilde ayarlayın: tutun 20 psi basınç; basınç çıkarma 10 PSI; dönem değeri 2.5; gating değeri 100 Bayan
   4. Cam kılcal enjeksiyon çözüm yükleyin. Cam kılcal mikroenjeksiyon yuvasına takın. Enjeksiyon açısını 45 ° için ayarlamak.
      Not: Başvurular ^{27 , 46} de açıklandığı gibi daha ayrıntılı iletişim kuralları bulunabilir.
2. Yer bir balık yeni bir petri içine dolu anestezi solüsyonu (aynı derecede içinde adım 3.3).
3. Balık forseps ve orient enjeksiyon için tutun.
4. Bir yarık 30 G iğne ucu kafatasında üzerinde optik tectum iki yanal tabak buluştuğu kullanarak oluşturun. İpucu beyin dokusu içine eklemek değil, bu kanama ve hasara neden olur. Bkz: ^{27 , 45 , 46} ek ayrıntılar için başvurur.
5. Cam kılcal slit takın.
   1. Sadece iğne kullanmanızı ve kafatası ile daha--dan 1 mm nüfuz değil. Balık tutmaya ve cam kesi site üzerinden kapiller ucunu takın.
   2. Cam telencephalon 45 ° açıyla doğru kapiller ucu gelecek şekilde yönlendirin. Çözüm 1 µL enjekte. Sıvı Enjeksiyon sonra hemen çekilmesini.

5. Kurtarma

1. balık geri taşıma kapsayıcıya o iyileşene kadar yer. Optimum su kalitesini artırmak amacıyla düzenli olarak dolaşımdaki balık su kapsayıcı bağlanın.
   Not: Kurtarma normalde 1 dk sürer. Daha uzun sürerse, Balık anestezikler için daha kısa bir defa (Bu deneyci tarafından optimize edilmiş olması gerekir) tutulmalıdır.

6. Doku hazırlık ve Sectioning

1. balık ödün önce istenen bir süre için bekleyin.
   Not: Bu deneysel soruda bağlıdır. Amiloid birikimi 1 gün sonra enjeksiyon gibi erken görülebilir.
2. Bağlı olarak etik kurallara uygun yöntemi kullanarak balık kurban (örneğin, 0.1 M MESAB balıkla tedavi).
3. Sivri forcep dorsal tarafta kullanarak optik tectum Kurukafa ikiye ayıracağım ve kafa sadece arkasında bir neşter kullanarak göğüs fin teşrih.
4. Tamir % 2 paraformaldehyde (PFA) kullanarak kafalarını gecede, İngiltere'de yılın 4 ° C. kullanım 3 mL plastik tüp içinde başına bir vidalı kapaklı.
   Uyarı: uygun kişisel koruyucu ekipman PFA işleme giyerler.
5. İçin üç kez 0.1 M kafaları cryoprotection yıkayıp, kalsiyumun, fosfat tampon (pH 7,4), sonra onları % 20 sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) çözüm aktarmak ve gecede 4'te kuluçkaya ° C.
Doku reçine, kesit içine gömmek için
6. plastik Histoloji kalıpları kuru buz (yaklaşık 3-5 bir blok dondurmak için min) % 7.5 gelatin/20% Sükroz çözümde kafaları dondurmak. -80 ° C'de örnekleri depolamak veya sonraki adıma (cryosectioning) devam.
7. Bir cryostat açıklanan ^{28 , 42} kullanarak 12 µm kalınlığında cryosections içine başları bölüm. Cryosections cam slayta doğrudan aktarın ve uzun vadeli kullanım için-20 ° C'de depolayın.

7. İmmunohistokimyasal boyama ve mikroskopi

Not: oksijen odasında tüm kuluçka adımları gerçekleştirin. Ve tüm çamaşır 10 dk her adımlardır.

1. Kuru oda sıcaklığında 30 dk için bölümler. Çözdürme sonra iki kez PBS ve bir kez PBSTx bölümleri yıkayın (PBS % 0.03 ile Triton-X-100).
2. Incubate, 4 ° C gece. birincil antikoru (anti-Aβ42 antikor; PBSTx 1:500 seyreltme) ile gün yıkamak bir kez PBS ve iki kez PBSTx.
3. İkincil antikor (floresan birleştiğinde algılama, 1:500 seyreltme) ile birlikte DAPI bölümlerle kuluçkaya (1 μg/mL) içinde oda sıcaklığında 2 h için PBSTx.
4. Yıkama üç kez PBSTx. Son yıkandıktan sonra bir coverslip 100 μL % 70 gliserol kullanarak slaytları mount.
5. Edinme floresan görüntüleri confocal mikroskop (örneğin 20 X PL APO N.A. 0,7 amacı ile 488 uyarma aralığı ve bir standart yeşil filtre; ile kullanma Şekil 2) ³⁹.

HPLC sentezlenmiş peptid arındırmak için kullanılan ve kütle spektrometresi arıtılmış amiloid β peptidler karakterize etmek için kullanılmıştır. HPLC sütun Aβ peptidler ayrılması geliştirmek için 50 ° C sıcak olduğu ve bütün fraksiyonları toplanmıştır. Doğru sentezlenmiş peptid tanımlamak için kütle spektroskopisi analiz tüm bölümler için gerçekleştirildi. UPLC Kromatografik bileşik saflığı gösterir. UPLC (Yani, gerekli amiloid Beta peptid oranında şarj etmek için doğru kitle) üzerinde bir tepe vermiştir HPLC kesir deneyler (Şekil 2) için daha fazla işlendi.

Toplamları oluşturan içinde peptidler işlevselliğini kullanarak çeşitli spektroskopik yöntemler39,48,49tespit edilebilir ve PBS içinde peptidler, oda sıcaklığında daha 1 h için kuluçka tarafından hangi-ecek da toplamları verim. Bu durumda, precipitates ve büyük toplamları çözümde görülmelidir.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon sonra peptidler beyin ve form amiloid ifadeleri içinde (şekil 3) toplamak. Bu toplamları çoğunlukla hücre içi ifadeleri olarak, aynı zamanda kan damarlarının çevresinde görülür. Böyle toplamalardan doku amiloid peptidler başarılı bir birikimi göstergeleridir.

Şekil 1: peptid sentez, arıtma, enjeksiyon ve analizleri şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Yerel amiloid-β42 peptid karakterizasyonu. Kütle spektrometresi karakterizasyonu yerli amiloid-β42 peptid(a)ve CPP öğesini amiloid-β42 peptid (TR-Aβ42; B). (C), saf, Kromatograf yerli ve TR-Aβ42 peptid üzerinde Ultra-high basınç sıvı Kromatografi (UPLC). X-Axes kütle ücret oranı (m/z) (A, B) ve (C) dakikada elüsyon saat gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: 1 gün sonra enjeksiyon bir yetişkin Zebra balığı beyin bölümünde amiloid yükünün immunohistokimyasal boyama. Aβ42 yeşil, ve Mavi çekirdeği vardır. Yeşil kümeler tespiti verimli Aβ42 toplama gösterir. Ölçek çubukları 100 µm =. Bu rakam başvuru39değiştirildi.

Tablo 1: Aβ42 ve TR-Aβ42 peptid diziler.

Yazarlar ifşa yoktur