Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı
Bu makalede
Özet
Özet
Endotelyal progenitor hücreler (EPCs) periferik kan varlığı ve onun katılımı vasculogenesis ilk Ashara ve arkadaşları1tarafından rapor. Daha sonra diğerleri benzer türdeki diğer kemik iliği2,3' ten kaynaklanan EPCs varlığını belgelemiştir. Daha yakın zamanlarda, Yoder ve EPCs göbek kordon kanı türetilmiş gösterdi Ingram4,5,6kan olanlar yetişkin periferik izole göre bir daha yüksek proliferatif potansiyeli vardı. Doğum sonrası vasculogenesis dahil olmak dışında EPCs da söz doku Mühendisliği vasküler kalp kapak yapıları7,ve8oluşturmak için hücre kaynağı olarak göstermiştir. Çeşitli yalıtım protokoller bulunmaktadır, bazıları ücretli mononükleer hücreler (ÇUŞ 'un) endotel ve hematopoetik işaretleri yardımıyla yukarıda belirtildiği kaynaklardan elde edilen hücre sıralanması veya özel endotelyal büyüme ile bu ÇUŞ 'un kültür Orta veya bu teknikleri9bileşimi. Burada, biz yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut ve kullanarak EPCs kültürünün İhtisas endotel orta immunosorting, Western Blot kullanarak izole hücrelerin karakterizasyonu tarafından takip kullanımı olmadan büyüme faktörleri ile desteklenmiş ve immunostaining.
Giriş
Birkaç müfettişler özellikleri ve insan EPCs5,10,11,12,13potansiyelini inceledik. EPCs endotel dokusunda siteleri hipoksi, iskemi, yaralanma veya tümör oluşumu için uygun ve yeni vasküler yapılar4,14oluşumuna katkıda yeteneği olan hücreleri dolaşan olarak tanımlanabilir. Neovaskülarizasyon, doğum sonrası vasculogenesis, şeklinde gözlenen onların katılımı bir anlayış bu hücreler ve tedavi uygulamaları4,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu araştırma Üniversitesi Arkansas kurumsal inceleme Kurulu (onay numarası 16-04-722) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Göbek Kordon kanı birimleri sitrat fosfat dekstroz (GBM) çözümünde, Arkansas Kordon Kanı Bankası toplanmıştır ve depolama gereksinimini karşılamayan birimleri için araştırma kuruluşuna verildi. Kordon kan birimleri ortam sıcaklıklarda koleksiyonunun 24 saat içinde laboratuvara couriered.
1. yalıtım endotelyal Progenitor Hücre kordon kanı üzerinden
- reaktifler hazırlanması.
- Hazırlamak endotel Bazal orta (EBM) % 10 fetal sığır serum için (FBS) ekleyerek EGM takıma 20 ng/mL İnsülin benzeri b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yalıtım ve genişleme endotelyal Progenitor Hücre:
Bir şematik (şekil 1) genel Protokolü tasvir sağlanır. Farklı kan bileşeni katmanları insan göbek kordon kanı ile yoğunluk gradient Orta yoğunluk gradient Santrifüjü takip tespit edildi. Çok uluslu şirketler kollajen tedavi plakalar üzerine tohum, gün 5 ve 7 (Şekil 2A) arasında ilk koloniler akıbet gözlendi. Bu koloniler büyümeye devam etti ve .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Daha önce belirtildiği gibi bir kaldırım taşı döşeli Morfoloji sahip yapışık EPCs. Bizim izole çok uluslu şirketler bir seklinde hücre koloni (Şekil 2A-2D) bir süre kültür on gün içinde bir Arnavut kaldırımlı koloni (Şekil 2E-2F) erken aşamalarında ilerledi. EPCs farklı farklı araştırma gruplarınca, endotel koloni oluşturan hücreleri5veya endotelyal progenitor hücreler12Yani geç en.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu malzeme Grant No altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur CMMI-1452943 ve Arkansas Üniversitesi onur üniversite tarafından. Biz de Arkansas Kordon Kanı Bankası kordon kanı birimleri ile bize sağlamak için kabul etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A) İzolasyon ve kültürleme için< / güçlü > | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| . | |||
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Amonyum Klorür | Kök Hücre Teknolojileri | 7850 | |
| 1x Fosfat Tampon Tuzlu | Su Thermofisher Bilimsel | 14190250 | |
| Sıçan Kuyruğu I Kollajen | Corning | 354236 | |
| Buzul Asetik Asit | Amresco | 0714-500ML | |
| %0.05 Tripsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES tamponu | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antikorlar ve hücre lizatları | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 seyreltme Western blotting |
| CD34 | için Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | Western blotting için 1:100 seyreltme |
| &-tubulin | abcam | ab7291 | Western blotting için 1:2.500 seyreltme |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | Western blotting için 1:100 seyreltme |
| İnsan umbilikal ven endotel hücre lizatı | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valf interstisyel hücre lizatı | Kendi laboratuvarından kültürlenmiş ve RIPA tamponu ile parçalanmış birincil hücre hattı | ||
| C) Western blotting ve immün boyama< / güçlü > | |||
| 10x Tris / Glisin / SDS tamponu | Biorad | 161-0772 | Çalışma tamponu olarak kullanılır |
| 10x Tris / Glisin tamponu | Biorad | 161-0771 | Transfer tamponu olarak kullanılır |
| Immobilon-FL transfer membranı | Merck Millipore | IPFL0010 | Bu, 45 & m gözenek boyutu ve protokolde western blot membran |
| 4x Laemmli numune tamponu | olarak belirtilmiştir Biorad | 161-0747 | |
| 2-merkaptoetanol | Biorad | 161-0710 | |
| %10 Kriter TGX prekast jel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher | Scientific P36930 | Uzun süreli depolama için immün boyalı lamellerin montajında kullanılır |
| Metanol | VWR Analitik | BDH1135-4LP |
Kaynaklar
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
