Mantle hücreli Lenfoma (MCL) bir B hücre bozukluğu tedavi etmek zordur ve eşit bir xenograft fare modeli eğitim ve tedavi geliştirmek için birincil MCL kurmak zordur. Burada, onun temel Biyoloji anlamak farelerde MCL xenografts başarılı kurulması açıklayın.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli
Bu makalede
Özet
Özet
B lenfositler anahtar oyuncular bağışıklık hücre dolaşım ve onlar çoğunlukla ev sahipliği ve lenfoid organlarda bulunan. Normal B hücreleri yalnızca T lenfositler tarafından uyardığında çoğalırlar, oncogenic B hücreleri hayatta kalmak ve özerk olarak tanımlanmamış organ niş genişletin. Mantle hücreli Lenfoma (MCL) bir tür B hücresi, hastalarin medyan sağkalım oranı 4-5 yıl nerede hastalıktır. Bu etkili mekanizmalar tarafından posta ve bu hücrelerin engraftment hayatta kalma artırmak için engellenen ihtiyacı ve uzun ömürlü hastalar için çağırır. Bu nedenle, izleme mekanizması içinde vivo engelleyerek MCL tedavi etkinliğinin çalışmaya xenograft fare modeli geliştirmek için çaba son derece önemlidir. Erken sahne uyuşturucu test etmek için insan hücre xenotransplantation hayvan alıcılarına gelişimi uzun takip, ilgili preklinik fare modelleri ekran yeni terapötik ajanlar için çok önemli olduğu gibi. Bu hayvan modeli insan greft reddi önlemek ve insan hastalıkları için bir model kurmak için geliştirilen ve hastalık ilerleme farklı Lenfoma türlerinden çalışmaya ve preklinik için aday ilaçların test gerçekleştirmek için son derece yararlı bir araç olabilir hematolojik maligniteler, MCL gibi. Çalışma ve MCL için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için mükemmel bir kaynak olarak görev yapacak bir xenograft fare modeli kurduk.
Giriş
Lenfositler doğası gereği immün gözetim içinde önemli bir rol oynamaktadır ve lenfosit kaçakçılığı antijen belirli bağışıklık1,2montaj kritik bir adımdır. Bu işlem geçiş saf T lenfositlerin kan akışına timus ve soydaş antijenleri buluştuğu orada ikincil lenfoid organlara, lenf düğümleri, Peyer's yamalar veya dalak, dahil olmak üzere içerir. B lenfositler kemik iliğinde ayırt etmek ve saf hücreler olarak ikincil lenfoid organlara3köklerinin geçirilir. Bazı bu B hücrelerinin antijen ile onların reseptör bağlamak ve belirli T hücreleri tarafından aktif hale gelir. Yayılması ve bu B hücrelerinin farklılaşma folikül manto bölgeye sigara-harekete geçirmek, naif B hücreleri iter. Aktif hücre sonra vücut devriye veya kemik iliği4' e göç plazma hücreleri salgılayan immünglobulin içine Olgun Hücreler içine bellek B ayırt edebilir.
Naif B lenfositler manto bölgedeki tümör dönüştürdüğünüzde MCL oluşur. Bu Lenfoma hücreleri lenfoid organlar microenvironment içinde bulunan ve belirli T lenfosit kontrol bağımsız olarak çoğalırlar. Ancak, yoğunluğu belirli bir aşamada onlar bu niş kaçış ve diğer organlarda nişler için arama kan recirculate. Adezyon molekülleri karmaşıklığı ve karışıklık kemokinler ve onların reseptörleri, göz önüne alındığında bu hücresel kaçakçılığı vivo içinde mekanizmasının kötü anlaşılmaktadır ve bu nedenle terapi engellemektedir. Roman yöntemleri etkili Lenfoma B hücreleri yeni microenvironments ulaşmasını önlemek için bu geçiş süreci engellemek için gereklidir.
MCL B hücre maligniteler tedavisi en zor biridir. MCL neoplastik bir fenotip biyolojik özellikleri benzersiz edinimi ile karakterize bir multistep çağlayan sonucu gelişmedir. Tanı zaman çoğu hasta (% 70) Dissemine hastalık ile çoğu durumda dalak, kemik iliği ve/veya gastrointestinal sistem5,6Ekstranodal tutulum sergilenmesi ile zaten var. Tedavi edilen hastalarda, konvansiyonel kemoterapi yüksek remisyon oranları kısa vadeli7,8indükler olsa bile bir kaç yıl içinde dayanıklı tümör tarafından nüks yaygındır. MCL yayılması ve onun temel Biyoloji anlamak yardımcı olabilir yeni bir hastalık modeli mevcut burada: hastaların birincil tümör hücreleri kökenli insan MCL xenograft fare modeli kurduk. Biz bu model MCL yayılması karşı tedavi stratejileri geliştirmek ve muhtemelen en iyi tanı ve Relaps hastaların tedavisi için yeni klinik Perspektifler sağlar yardımcı olacağını umuyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan kanı örnekleri yerel etik ve insan deneme Komiteler Cenevre Üniversitesi Hastanesi tarafından onaylanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı kullanılmıştır.
Hayvan yordamlar kurumsal Etik Komitesi hayvan bakımı Cenevre, İsviçre ve Kanton veteriner Office uygun olarak gerçekleştirilen (yetki numarası: GE/26/15).
1. birincil periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk Gradient ayırma tarafından hazırlanması
Not: 3-5 mL periferik kan MCL ile lösemik aşamasında sunulması hastalardan elde edildi. Tanı tanı ölçütlerini standart Akış Sitometresi (CD5 +, CD23−, CD200 +, monoklonal B hücre nüfus) göre kurulan ve daha sonra kromozom translocation t(11;14) varlığı ve siklin D1 overexpression tarafından onaylandı. Her durumda, için monoklonal B hücreleri oluşturmaktadır > toplam B hücre nüfusun % 90. Kalan hücreleri esas olarak monosit ve bazı T hücreleri vardı.
- MCL kan örneği (1:1) 5 mL 5 mL Roswell Park Memorial Enstitüsü orta 1640 (RPMI) (şekil 1A) ile sulandırmak.
- Yoğunluk gradient medya (Malzemeler tablo) ayrıntılı karıştırma sağlamak için kullanmadan önce birkaç kez tersine çevirin.
- Bir pipet aspiratör kullanarak bir 15 mL santrifüj tüpüne 5 mL yoğunluk gradient medya ekleyin.
- Hafifçe sulandırılmış kan örneği (kan yoğunluk gradient medya oranı olmalıdır 2:1, örneğin, 10 mL 5 mL yoğunluk gradient medya için kan) bir aspiratör kullanarak 15 mL santrifüj tüpü yoğunluk gradient medyada üzerinde katman. Bakım değil karıştırmak için iki katman (1B rakam, C) alınmalıdır.
- 400 x g oda sıcaklığında 40 min için de örnek devre dışı santrifüj frenler ile santrifüj kapasitesi.
- Steril bir Pasteur pipet kullanarak yavaşça Orta tabaka ((şekil 1 d, E) bir okla işaretli beyazımsı, ince halka) Aspire mononükleer hücreler içeren ve temiz bir tüpün içine aktarabilirsiniz.
- Çamaşır mononükleer hücre
- Transfer edilen hücre süspansiyon hacmi tahmin etmek ve eklemek steril 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) % 1 sığır serum albumin (BSA) ile x 3 cilt.
- Süspansiyon tarafından pipetting yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın.
- 400-500 x g 10-15 dakika oda sıcaklığında, süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet elde edilir ve yıkama adım tekrar süpernatant atmak.
- Süpernatant kaldırmak ve istediğiniz ses, örneğin, PBS 1 veya 2 mL hücrelerde resuspend.
- Bir otomatik hücre sayaç ya da el ile bir hemasitometre (Neubauer odası) kullanarak hücreleri saydırmak.
2. B hücreleri B hücre negatif seçim tarafından zenginlik
- PBS hücrelerde son konsantrasyonu 50 x 106 hücre/ml seyreltik.
- Hücreleri yuvarlak alt polistren tüp 5 mL aktarın. Antikor kokteyl 100 µL B hücre zenginleştirme Seti'nden hücre süspansiyon için 2 mL ekleyin ve karışımı yavaşça (Şekil 2-1yukarı ve aşağı) pipetting tarafından.
- Hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Kısaca girdap manyetik parçacıklar için 30 B hücre zenginleştirme Seti'nde sağlanan s (Şekil 2-2). Manyetik parçacıkların 150 µL 2 mL örnek ekleyin.
- Örnek oda sıcaklığında başka bir 5 min için kuluçkaya.
- Numune hacmi 2.5 mL 1 x PBS % 2 fetal buzağı serum (FCS) ve 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren getir. Tüp mıknatıs yerleştirin ve başka bir 3-5 dk (Şekil 2-3) için tüp kuluçkaya.
- Mıknatıs tüp yerinde ve bir sürekli hareket ile almak, böylece zenginleştirilmiş hücre süspansiyon (Şekil 2-4) taze bir tüpte toplanır tüp dikkatle boşaltmak. Bir otomatik hücre sayaç ya da el ile B hücrelerinin toplam verim elde etmek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
Not: Genellikle, verim ~ 105 B hücre/mL normal B hücreleri ve 5-50 x 106 hücre/mL MCL için için olur. - B hücre zenginleştirme saflığı teyit
- Al ~ 50.000 hücreleri ve anti-CD19/CD20 antikorları içeren hücreleri kuluçkaya (1:20 seyreltme) ve anti-CD45 antikor birleştiğinde için farklı fluorochromes (1:10 seyreltme) için 15-30 dakika oda sıcaklığında.
- 1 mL 1 x PBS + % 1 BSA ile yıkayın, 400-500 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve PBS ~ 200 µL hücrelerde resuspend.
- Akış Sitometresi tarafından hücre örnekleri almak ve B hücreleri saflık için analiz. Saflık olduğunu çoğunlukla > 90 oranında bu yöntem (şekil 3).
3. Xenograft fare modeli geliştirilmesi
- ~ 40-60 x 1 x PBS (fare enjekte etmek için gerekli miktar) 150-200 µL 106 hücrelerde askıya alma.
- Hücre süspansiyon 150 µL intravenöz enjekte (IV) 6-7 hafta eski immünyetmezligi NOD scid gama (NSG) fareler (şekil 4A) Cinsiyeti ne olursa olsun her kuyruk ven içine.
- Fareler ~ 10 hafta boyunca insan Lenfoma geliştirmeye olanak sağlar.
Not: Birincil insan Lenfoma hücreleri insan Lenfoma hücre hatları (~ 3 hafta) karşılaştırıldığında tümör geliştirmek çok daha uzun sürer. - Hayvanlar kilo kaybı gibi ölümcül hastalık belirtileri göstermek başlattığınızda, fırfır yakalı saç, azalmış aktivite, hind felç, vb, kurban fareler tarafından CO2 boğulma kalp kalp delik tarafından kan elde etmek için takip.
- Toplamak farklı organları gibi kemik iliği, dalak ve karaciğer fareler anatomi ve tümör engraftment analiz için kurban anda kalpten kan çizerek periferik kan toplamak (şekil 4B -F).
4. chimerism analiz farklı organlarda Engrafted tümör hücresi
- Farklı organları topladıktan sonra bunları tek hücre süspansiyonlar 1 amonyum klorür potasyum arabellek x 200 µL kullanmak için kan ve kemik iliği, dalak için 500 µL ve karaciğer için 2 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis takip oluşturmak için mekanik bozulma tarafından işlenmesi .
- Say ve insan B hücre belirli antikor, Yani, anti-CD19, anti CD20 ve anti-CD45 kullanarak hücreleri leke.
Not: NSG fareler B hücreleri eksikliği ve bu nedenle analiz için hücreleri insan belirli B hücre işaretleri ile lekeli. - B hücreleri (CD19, CD20 +, CD45 +) çoğunluğuna göre Akış Sitometresi tarafından her organ dan türetilmiş hücre analiz.
- Engrafted tümör hücreleri farklı organlarda enjekte MCL fareler adım 4.3 (şekil 4 g) belirtildiği gibi geçişli hücreleri temel alan türetilmiş ölçmek.
Not: Malzeme tablo Ayrıntılar için bkz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
El yazması bir xenograft fare modeli engraftment MCL hücre için başarılı gelişimi için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Hazırlık nüfusun bir saf hücre (Bu durumda MCL hücreleri), başarılı MCL xenografts geliştirmek için çok önemlidir. Şekil 1 MCL hastanın kan mononükleer hücre izolasyon için partiye hazırlık adımları yoğunluk gradient ayırma tarafından temsil eder. Mononükleer hücreler daha da saf hücre nüfus fareler içine xenograft enjeksiyo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Klinik çalışmalar gelişmiş bir gelişme aşamasında olan, ancak ilaç keşfi için kullanılan ilaçlar için mümkündür. Hayvan insan hücre xenotransplantation alıcılarına erken sahne ilaçları test amacıyla geliştirmek için çabalarını uzun takip edilmiştir. Burada insan greft reddi önler ve MCL gibi insan hastalıkları için bir model oluşturabilir bir hayvan modeli mevcut. Bu şu anda insan tümör engraftment ve tümör büyüme mekanizmaları incelemek için bir sanat devlet xenograft modelidir. Burada NSG fareler, en bağışıklık eksik f...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
Bu eser Ligue Genevoise contre le kanser, tarafından desteklenen Fondation Dr Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 ve 2914-02-2012 ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe 31003A_156760 ve 310030-153456.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mononükleer hücrelerin ayrılması için | Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco-Life teknolojileri | 61870-010 | kan örneğinin seyreltilmesi için |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | hücrelerin yıkanması |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | İzolasyon sırasında hücrelerin yıkanmasında kullanılan% 1 BSA ile PBS'nin hazırlanması için |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | insan pan-B hücre işaretleyicisi |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | insan pan-B hücre işaretleyicisi |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | insan pan-B hücre işaretleyicisi |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | insan T hücresi işaretleyicisi |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | MCL'de tipik olarak bulunmayan hücre yüzey proteini |
| CD45 KO Beckman | Coulter | B36294 | Pan-lökosit belirteci |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | farelerinde tipik olarak bulunmayan hücre yüzey proteini |
| Charles River Laboratories | 5557 | bu çalışmada | |
| MCL ksenogreftleri geliştirmek için kullanılmıştırKolay sep İnsan B hücresi zenginleştirme kiti | üzere saf hücreler elde etmek için B hücrelerini zenginleştirmek için kullanılan | hücre teknolojileri | 19054 |
| FACS: | Beckman Coulter | Navios | MCL örneğini karakterize etmek ve MCL aşılaması için organları incelemek için kullanılır |
| 1X amonyum klorür, potasyum tamponu | kırmızı kan lizis tamponu (NH4Cl, 8,024 mg/l; KHCO3 1.001 mg / l; EDTA. Na2 ve orta nokta; 2H2O 3.722 mg/l ) |
Kaynaklar
- Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).
- Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th edition, (2001).
- De Silva, N. S., Klein, U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).
- Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma. Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).
- Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).
- Herrmann, A., et al. Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma. J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).
- Martin, P., et al. Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies. Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).
- Iyengar, S., et al. Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice. Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).
- Klco, J. M., et al. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts. Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).
- Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma. J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
