Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

10.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56024

⸱

31 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology Division, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Özet

Yıllardır, iskelet kas lif türleri arasında ayrım en iyi myosin-ATPaz boyama tarafından görüntülenmiştir. Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama fiber türü daha ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA, IIX yazın yazın ve tip IIB lifleri şimdi onların MyHC profiline dayalı hassasiyetle tespit edilebilir; Ancak, bu verilerin el ile analiz yavaş ve aşağı doğru olabilir sıkıcı. Bu bağlamda, hızlı, doğru değerlendirme fiber türü kompozisyon ve Morfoloji çok arzu edilen bir araçtır. Burada, MyHCs fare hindlimb kas fiber türü ve lif morfolojisi analizini hızlandırır roman yarı otomatik bir algoritma ile uyum içinde elde edilen donmuş bölümlerinde, state-of--art immunohistokimyasal boyama için bir iletişim kuralı mevcut. Beklendiği gibi görüntülenen soleus kas-için boyama tip ı ve tip IIA lifleri, ama türü IIX ya da tip IIB lifleri için değil. Öte yandan, tibialis anterior kas türü IIX ve tip IIB liflerinin, tip IIA lifleri küçük bir kısmını ağırlıklı olarak bestelendi ve az veya hiç tip ı lifleri. Birkaç görüntü dönüşümleri lif morfolojisi (Yani, kesit alanı (CSA), maksimum ve minimum Feret çapı) farklı yönlerini ölçmek amacıyla olasılık haritalar oluşturmak için kullanılan. Bu parametreler sonra el ile elde edilen değerler ile karşılaştırıldı için elde edilen değerler. Hiçbir önemli farklılıklar analiz CSA, maksimum veya minimum Feret çapı açısından her iki mod arasında gözlendi (tüm p > 0,05), bizim yöntem doğruluğunu gösteren. Böylece, bizim immunostaining Çözümleme Protokolü Kas kompozisyonu yaşlanma ve myopathy birçok model üzerinde etkileri incelenmesi için uygulanabilir.

Giriş

Kas iskelet birçok türleri1tek liflerinin oluşan bir süredir bilinmektedir. Başlangıçta, iki grup liflerinin contractile özelliklerine göre karakterize ve adli, uygun şekilde, yavaş seğirme (tip ı) ve hızlı-seğirme (tip II). Bu kategoriler daha fazla lif metabolizma temelinde ayırt edildi. Beri tip ı lifleri mitokondri içinde zengin ve oksidatif metabolizma güvenen, onlar sağlam olumlu Nikotinamid adenin dinükleotit-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) diaphorase2 ya da süksinat dehidrogenaz (SDH)3 ile aydınlatılmamıştır boyama. Buna karşılık, tip II lifleri daha az sergilenen ve değişken derece NADH-TR diaphorase veya SDH boyama ve iki fast twitch alt gruplar ayrıldı (IIA ve IIB yazın) biraz kabaca göreli oksidatif kapasite üzerinde dayalı. Bu ayrımlar lifler arasında-var daha etkili bir şekilde görselleştirildiği myosin-ATPaz boyama tarafından nerede tip ı lifleri leke karanlık pH 4.0 öncesi bir kuluçka sonra ve tip IIB lifleri absorbe pH 10.0 tip IIA lifleri ile acele aşağıdaki ön kuluçka ayda4boyama.

Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama lif tipi5ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA yazın ve tip IIB lifleri tüm hassasiyetle onların MyHC profiline göre belirlenebilir. Ayrıca, başka bir fast twitch metabolik olarak orta fiber türü, IIX, yazın tanımlanan6oldu. Birden fazla MyHC ifade karma lifler de teyit edilen5,7,8olmuştur. Kedi ve maymun gibi bazı türler değil hızlı Tip IIb MyHCs6için bilinir. MyHC immunostaining Kas kompozisyonu state-of--art değerlendirilmesi şu anda olsa da, bu tekniği ile elde edilen verilerin analizi hantal ve zaman alıcı otomatik yardımı olmadan. Bu amaçla, bu verileri çözümlemek için yarı otomatik yöntemleri bir avuç gelişmiş5,9,10olmuştur. Burada, kas lif tipi5,7,8,10, immunohistokimyasal tanımlanması için nispeten standart bir protokol ile birlikte bir roman yarı otomatik mevcut fiber türü ve lif morfolojisi analizini hassasiyetle hızlandırır algoritması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

fareler içeren tüm yordamları Colorado Üniversitesi-Anschutz tıbbi kampüs kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (91813(05)1D).

1. gün 1: İlköğretim (1°) sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ile Immunostaining

fare hindlimb kas (örneğin, tibialis anterior, soleus)
  1. Air-dry donmuş bölümlerini monte için şarj edilmiş slaytlarda ~ 30 dk 11. bir hidrofobik bariyer PAP kalem kullanma bölümlerine bir kenarlık çiz.
  2. Yer ~ 250 µL % 5 BSA/fosfat tamponlu tuz (BSA/PBS) non-spesifik antikor bağlama engellemek için her bir slayt. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h. için kuluçkaya
  3. Engelleme iken, 1:50 hazırlamak dilutions 1° antikor süpernatant % 5'in BSA/PBS (tüm fare monoklonal antikorlar; bkz. Tablo 1 6 , 12); in 250 µL hazırlamak çözüm slayt başına. 1 ° antikor stokları ve dilutions buz üzerinde tutmak

figure-protocol-1
Tablo 1: birincil MyHCs ayırt etmek için kullanılan antikorlar.

  1. % 5 BSA/PBS engelleme çözüm aspirasyon 1 ° antikor seyreltme 250 µL uygun slaytlara ekleyin. 250 eklemek µL % 5'lik BSA/PBS ikincil (2°) salt antikor negatif kontrol için slaytlar.
  2. Incubate için 24-48 h nemli bir ortamda 4 ° C'de.
    Not: Alüminyum folyo nemlendirilmiş filtre kağıdı ile kaplı bir petri uygun kuluçka odası hizmet verebilir.

2. Gün 2:2 ° floresan antikor ile Immunostaining

  1. Aspire 1° antikor çözüm ya da %5 BSA/PBS çözüm kontrol. Yıkama tüm slaytlar üç kez, 10 min %5 BSA ile.
  2. Yıkama sırasında arıtılmış, fluorophore Birleşik 2 ° antikorlar % 5, 1: 200 dilutions hazırlamak BSA/PBS (bkz. Tablo 2, tüm keçi Anti-fare vardır). Çözüm slayt başına 250 µL hazırlayın. Buz üzerinde 2 ° fluorophore Birleşik antikorlar anlatmamanı

figure-protocol-2
Tablo 2: Fluorophore Birleşik ikincil görselleştirmek birincil antikor tanıma, MyHCs için kullanılan antikorlar.

  1. üçüncü uygulama %5 BSA/PBS engelleme çözümün aspirasyon 2 ° antikor seyreltme 250 µL tüm slaytlara ekleyin. Karanlık, nemli bir ortamda oda sıcaklığında 90 dk için kuluçkaya.
  2. Aspire edin 2° antikor çözüm. Yıkama tüm slaytlar üç kez, % 5 ile 10 dk BSA/PBS.
    3. PBS ile
  3. durulama. 10 dakika süreyle kuru
  4. Coverglass bir kalıcı olmayan, düşük viskozite sulu montaj orta ile mount.
  5. Zaman kuru, slayt kenarları oje ile kapatın. Kuru ve mağaza içinde karanlık bir slidebox.

3. Epifluorescence mikroskobu ile slaytlar Imaging

  1. temiz bir bezle küçük, % 70 etanol bulanmış laboratuvar-slaytlar.
  2. İmmunostained kas bölümlerin (Tablo reçetesi görmek) bir fotoğraf cihazları ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edilir.
    1. Yaklaşık 1 mm 2 (10 X amaç, 1.4 NA) alanı seçin.
    2. View 2° Alexa 488 Birleşik antikor floresan bir 505 üzerinden nm uzun geçiren Filtre. Uyarma 595 nm uzun geçiren Filtre üzerinden 2 ° Alexa 594 Birleşik antikorların tarafından oluşturulan Floresans görüntüleyin. Görüntüleri dijital ortama uyumlu bir görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar ile. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı daha sonraki analizler için ölçek çubuğu içerir.

4. Fiji görüntülerle analizi

Not: analizi ile devam etmeden önce Fiji (serbestçe Ulusal Sağlık enstitüleri, Bethesda, MD kullanılabilir) https://imagej.net/Fiji/Downloads yüklenmesi gerekir. Bu süreç içinde kullanılan makro içinde belgili tanımlık Ek dosya mevcuttur. Makro dosyasını kolayca erişilebilir bir dizine yerleştirin.

Seçilen kısımda Fiji
  1. yük bir aydınlık alan görüntüsü. Eklentileri gidin → segmentasyon → öğretilebilir Weka segmentasyon.
    2. Bölüm, hücresel alanlarında şart için
  2. bir kumaş üzerinde bir çizgi çizin ve'ı tıklatın " class 1 Ekle ". O zaman, uzay lifler arasında bir çizgi çizin ve'ı tıklatın " class 2 Ekle " ekstrasellüler etki alanları işaretlemek için. Her sınıfta 5-10 etiketleri kadar yineleyin.
    1. Tıklayın tren Sınıflandırıcısı. Elde edilen kırmızı ve yeşil yerleşim üzerinde daha fazla etiket el ile eklemek (bkz. Adım 4.2) görüntü, gerekirse yanlış kesimli bölümlerine. Lifleri (kırmızı) uygun şekilde lifleri (yeşil) arasındaki boşluğu ayrılır kadar yineleyin.
  3. 'I tıklatın " olasılık almak " ve görüntü yeni etiketli bir klasöre kaydedin.
  4. İle aynı alandan alınan floresan görüntü (Adım 4.2-4.3) Yukarıdaki yordamı yineleyin. Etiket immunostained lifleri olarak " sınıf 1 " ve tüm sigara floresan bölgeleri olarak " sınıf 2 ". Elde edilen olasılık harita işlenmiş aydınlık alan görüntünün depolandığı klasöre kaydedin.
  5. Önceden kaydedilmiş olasılık haritalardan biri Fiji'de açın. Düşsel bilgisayar yazılımı tarafından sağlanan ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi çizin. Analiz gitmek → ayarla ölçek. Ölçek çubuğu tarafından verilen uygun değerlerine (Yani, bilinen mesafesi, uzunluk birimi) parametreleri değiştirmek sonra kontrol " Global " kutusunu her görüntü için ölçek standartlaştırmak için.
  6. Eklentileri gidin → makroları → çalıştırmak → Tyagi'yi vd. fiber miktar macro.ijm (Ek dosya bakın). Hemen, bir gezinti bölmesi görünür. Açık belgili tanımlık imge ' s ana klasör; bir iletişim kutusu görüntülenir. Her iletişim kutusu için değiştirmek " arka plan " açılan değerine " ışık. "
    Not: klasörü şimdi görüntüler fiber özetliyor ve elektronik yazılım dosyaları (CSA ve Feret çapı için en uygun sonuçları ile doldurulur lif morfolojisi miktarının; ölçülen parametreler analiz ayarla ölçümlerde ayarlanabilir). Fiji gözenek analiz işlevi kullanılarak oluşturulan lif morfolojisi veri otomatik olarak her iki floresan ve parlak alan görüntüler için elektronik tablo yazılımı dosyalar için transfer.
  7. Lifleri floresan lifleri alanındaki sayıya karşılık gelen parlak alan resimdeki toplam liflerinin sayısı bölerek bir alanda belirli bir MyHC ifade kısmını hesaplamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bilinmeyen yaş bir erkek C57BL/6 fareden kesmiştim Hindlimb kasları (Yani, tibialis anterior, soleus) sıvı azot soğutmalı isopentane bileşik kas Ekim içeren bir plastik kalıp batan tarafından dondurulmuş flaş. Sonra bir cryotome kullanarak, 8-10 µm seri bölümler-20 ° C'de kesmek ve farklı olumlu tahsil cam slayt12' ye transfer.

Bu kaslar ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş-seğirme liflerinin, sırasıy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, bizim iskelet kas lif türleri tanımlanması için yararlı yön vermişlerdir. Bunu yaparken, biz veri analizi için yeni bir algoritma tanımlamak.

Bizim sonuçları büyük ölçüde bu önceki raporlar5,8,10 onaylayın ve bizim kendi el ile ölçümleri yansıtmak beri algoritma doğru gibi görünüyor. Yine de, yapı kesit sonucu belirsiz fiber Kenarlıklar dahil olmak üzere bazı nadir deneysel tuzaklar ile karşıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

Boettcher Vakfı ve amyotrofik Lateral skleroz Derneği (#17-II-344) bu araştırma verdikleri destek için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serumu AlbüminSigma AldrichA9418-100GPBS'de %5
Hidrofobik Bariyer Pap KalemBilimsel Cihaz Laboratuvarı9804-02
Mikroskop SlaytlarıGlobe Scientific1358W
CoverglassFisher Scientific12-544-E
Bağışıklık KazandırmaTermo Bilimsel9990402
OjeL'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Ters Floresan ve Parlak Alan Mikroskobu Durdurulan
SPOT RT/KESpot Görüntüleme ÇözümleriRT940
Dell Optiplex
BA-F8 Birincil AntikorGelişimsel Çalışmalar Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası 1:50
SC-71 Primer AntikorGelişimsel Çalışmalar Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankasımonklonal fare IgG1; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2bInvitrogenA21145keçi anti-fare; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1InvitrogenA21121keçi anti-fare; 1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGMInvitrogenA21044keçi anti-fare; 1:200
EKİMSakura Finetek4583
izopentanFisher ScientificO3551-4sıvı nitrojen PBS ile soğutun
Fisher BioreagentsBP665-110x, 1x'e seyreltin
Kim mendilKimberly-Clark06-666A
monoklonal fare IgG2b;BF-F3 Primer Antikor Gelişimsel Çalışmalar: Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası, monoklonal fare IgGM; 1:50 6H1 Primer Antikor Gelişimsel Çalışmalar: Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası, monoklonal fare IgGM; 1:50

Kaynaklar

  1. Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
  3. Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
  4. Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
  5. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  6. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
  7. Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
  8. Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
  9. Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
  10. Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).
  11. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
  12. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
  13. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  14. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  15. Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

skelet Kas Lif TipiMiyozin A r Zincirimm nohistokimyasal BoyamaLif MorfolojisiKesit AlanFeret apFare Arka Uzuv KasOlas l k HaritalarFiji Yaz l m
Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.