A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Yakalama ve mRNA 3' biter nın mRNA işlemesi, çalışma ve gen ekspresyonu miktar sağlar. Poli(a) kuyruklarını nedeniyle, ökaryotik mRNA'ların verimli toplam hücresini lysates boncuk immobilize oligo-deoxythymidine (Ayrıca cDNA sentez Başbakan oligo(dT)) moleküller,. ile gelen saf Ancak, bu yaklaşım iki dezavantajı vardır. İlk olarak, Tutanaklar için iç olan A'ın menziller cDNA sentezi, sahte Poli(a) Siteler'de kaynaklanan da Başbakan. İkinci, homojen Poli(a) uzanır için sıralama için transkript kimlik bilgilendirici olmamak bir yana, belirli sorunlar teşkil. Çeşitli yaklaşımlar ters transkripsiyon yoluyla Poli(a) gibi bu sınırlamaları aşmak için önerilen RNase H sindirim (3 P-seq ¹), tarafından takip kuyrukları kullanın 20 dakika sonra biten bir özel sıralama astar Ts (2 P-seq ²), in disindan RNA parçaları ile ardından RNase H sindirim (3' okuma ³) ve bir saç tokası (A-seq ⁴) 3' bağdaştırıcıyı içeren bir oligo-dT astar kullanımı CU₅T₄₅ astar ile 50 nukleotid Poli(a) kuyruğu.

Son zamanlarda Gelişmiş A-seq2 yöntem ⁵ hedefler sıralama Poli(a) aracılığıyla ve bağdaştırıcıları, özellikle meydana gelen öz ligasyonu tarafından oluşturulan dimer oranını en aza indirmek için aynı zamanda atlamak için zaman bağdaştırıcıları molar konsantrasyonu INSERT konsantrasyonu daha ağır basar. Her iki bağdaştırıcı polinükleotit biter A-seq2, nerede 3' bağdaştırıcıları için 5' uç RNA parçaları ve bağdaştırıcılarına 5' 5' ucuna cDNAs sonra ters transkripsiyon bakmaksızın olduğu gibi aynı türüne bakmaksızın zaman bu sorun ortadan kaldırılabilir. Bizim daha önce önerilen A-seq - sıralama 5'-için-3'te yapıldı daha yöntemdir ' böylece tam olarak gerektiren yönü kontrol RNA parçalanma-Poli(a) sitesi kimliği yüksek bir doğruluk korurken,. Tipik örnekleri olarak sıralı okuma yaklaşık % 80 benzersiz olarak genom için harita ve 20.000'den fazla Poli(a) sitesi kümeleri, hangi ek açıklama eklenen 3' ile UTRs çakışan %70 daha fazla tanımlaması yol.

Kısacası, A-seq2 Protokolü mRNA parçalanma ve ters-tamamlayıcı 3' 5' ucuna RNA parçaları bağdaştırıcısına ligasyonu ile başlar. Poli (A)-içeren RNA'ların sonra ters bir çapa nükleotit 3' ucu, bir dU pozisyonda 4 ve 5' sonunda, bir biotin içeren bir 25 nükleotit (nt) uzun oligo(dT) astar ile transkripsiyonu için manyetik streptavidin boncuk cDNA bağlamaya izin vererek. Astar, biotin, dahil olmak üzere çoğu kaldırılır cDNA dU, bölünme tarafından urasil DNA glycosylase (UDG) ve DNA glycosylase-liyaz endonükleaz VIII içeren kullanıcı enzim karışımı tarafından. Poli(a) kuyruğu konumunu işaretlemek için bölünme kalır sonra bu reaksiyon olduğu gibi amaçları için bir 5' bağdaştırıcısı ve üç Ts sol ligasyonu bırakır. Tüp ligasyonu alıcı 5' biter tarafından 5' her ikisi ve 3' uyarlamak eklendiğinden, hiçbir bağdaştırıcısı dimer oluşturulur. Dört nükleotit rasgele-okur başlarında mers state-of--art sıralama aletleri üzerinde küme çözünürlük sağlar ve aynı zamanda benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) olarak algılama ve PCR güçlendirme eserler kaldırılması için hizmet edebilir. UMI boyutunu daha da diğer çalışmalar ⁶' olarak artırılabilir. Protokol tamamlayıcı mRNA 3' biter, her 3 Ts. işleme onların PCR güçlendirme eserler tarafından düzeltilmesi ile 5' sonunda başlar, 3 tanı Ts var okur tarafından takip randomize bir tetramer başlayarak geriye doğru okuma oluşturur UMIs, 3' bağdaştırıcısı dizileri, kaldırılması istismar ve ters uluslara. Oligo(dT) astar iç A-zengin siteler üzerinden kökenli olduğu okuma da hesaplama açısından tanımlanır ve atılır. Sahte siteleri genellikle iyi karakterize 18 birini eksikliği ve olması gereken korunmuş Poli(a) sinyalleri ~ 21 nükleotit akıntıya karşı belirgin bölünme sitesi ⁷yer.

Protokol yaklaşık 8 s uygulamalı zaman, hücre kültürü ve gece d sayma değil gerektirir. İlişkili yazılım son derece hassas Poli(a) sitesi kimliği sağlar analiz okudum. Poli(a) sitesinden kümeleri 4 örnekleri bu el yazması (Denetim siRNA ve si HNRNPC tedavi edilen hücreleri iki biyolojik çoğaltır) % 84 örtüşme Açıklama eklenmiş bir gen ile ve bu, bir 3' UTR % 75 çakışma ve %86 ile ikisinden biri daha fazla vurgulu temel alınarak oluşturulan bir 3' UTR veya bir terminal exon. Çoğalt örnekleri... biter 3' ifadesinin Pearson korelasyon katsayısı 0.92 olduğunu ve üzerinde 0,9 değerleri genellikle yöntemi ile elde edilir. Böylece, A-seq2 çok tekrarlanabilir sonuçlar verir uygun bir yöntemdir.

1. hücre büyümesi ve mRNA yalıtım

1. 1 ~ %80 izdiham kuyuda başına 10 ⁶ hücre x 6-şey tabak içinde deneysel tasarım göre hücreleri büyümek.
2. Büyüme orta kaldırmak ve hücreleri bir kez tamponlanmış fosfat ile serum fizyolojik yıkayın. Doğrudan plaka üzerinde hücreleri mRNA yalıtım teçhizat--dan 1 mL lizis arabelleği ekleyerek parçalayıcı. Viskoz transfer 1 mL pipet ucu ile 15 mL plastik tüp içine lysate. Tamamen hücre malzemesi plaka yüzeyinden ayırmak için bir plastik spatula kullanın.
3. Lysate içeren yapışkan DNA lysate artık yapışkan kadar 23 G Hipodermik İğne için birkaç pistonu yukarı ve aşağı hareketleri dinç bağlı 1 mL şırınga ile kesme. Şırınga iğne lysate tüp dışarı çıkarma önlemek için alt ortasına gelin.
4. Lysate şırınga kullanarak bir 1,5 mL tüp içine aktarın. 20.000 x g de 5 min ve enkaz kaldırmak için 4 ° C spin. DNA düşük bağlama 1,5 mL tüpler boyunca protokol kullanın.
Santrifüj çalışırken
5. lizis arabelleği 500 µL ile manyetik bir raf üzerinde resuspended oligo (dT) ₂₅ manyetik boncuklar 300 µL yıkayın. 2 - 3 kez üzerine askı boruları karıştırın. Çözüm açıktır sonra arabellek kaldırın. Açık süpernatant 1.4 adımından toplamak ve boncuk için ekleyin. Resuspend ve yer tüpler 10 dakika süreyle dönen bir tekerlek üstünde
6. Tüpler manyetik bir rafa yerleştirin. Berrak sıvı 2 dk. sonra Ekle 0.8 mL arabellek A mRNA yalıtım Seti'nden kaldırın. Tüp 180 ° derece rafta, 2 - 3 kez kapatın. Bu yıkama işlemi tekrarlayın arabelleği A. ile bir kez daha
7. 1.6 adımda anlatıldığı gibi boncuk arabelleği B 0.8 mL ile 2 kere yıka.
Boncuklar, üzerinden bağlı mRNA elute
8. 33 µL H ₂ O ekleyin ve boncuk resuspend. Isıtmalı bir blok üzerinde 5 min için 75 ° c ısı. Hemen tüpler 1 s ve yer için spin manyetik raf onları. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın. Örnekleri kadar daha fazla kullanılmasını-80 ° C'de saklanabilir.
9. 33 66 eklemek µL alkalin hidroliz arabelleğe µL mRNA (Adım 1.8), mix ve tam olarak 5 dakika Isıtma blokta 95 ° c ısı. Hemen buz üzerine boruları, soğuk
10. Bir RNA Temizleme kiti ile izole RNA.
    Not: ses onaylamak; 100 µL olması gerektiği.
    1. Seti ve 250 350 eklemek µL RLT arabelleğinden µL etanol. Sütun ve 30 tur üzerine yük 8000 x g oda sıcaklığında (RT), s. 500 µL RPE arabelleği kiti ile yıkayın. 500 µL % 80 etanol ile yıkayın. Sütun kurumaya 20.000 x g de 5 min için spin. 36 µL H ₂ O sütununu ekleyin ve 20.000 x g., 1 dk sütun atmak ve eluate kaydetmek için spin.

2. 5 ' fosforilasyon ve Dnaz tedavi sonunda

1. ekleyin 5 µL polinükleotit kinaz arabellek, 5 µL 10 mM ATP, 1 µL ribonükleaz inhibitör, 1 µL Dnaz ve 2 µL polinükleotit kinaz örnekler ve 1.1 birimleri karıştırılarak ana reaksiyon karışımları protokol boyunca 30 dk. isteğe bağlı olarak hazırlamak için 37 ° C'de kuluçkaya n x (n = örnekleri sayısı) her bileşenin.
2. Değiştirmek arabellek ve ATP Poli(a) ek bir sonraki adımda önlemek için bir spin sütunu kaldır.
   1. Prespin spin-sütunlar vasıl 735 x g 1 dk. sütunları yeni 1,5 mL tüpler için Transfer ve kinaz reaksiyonlar sütunlar üzerine yük. 735 x g., 2 dk sütunları sütunları atın ve toplanan reaksiyonlar tüplerini Buza koyun veya saklamak-80 spin ° C.

3. 3 engelleme ' biter Cordycepin trifosfat ile

Not: 3 blok esastır ' onların concatemerization sonraki ligasyonu tepkiler. 3 önlemek için RNA parçaları ucu ' zaten engellenmez bir () tarafından biter hidroliz kabul edilir sonra buna ek olarak bir 3 tarafından döngüsel) fosfat ' dATP (cordycepin trifosfat) zinciri Sonlandırıcı nükleotit Poli(a) polimeraz yardımı ile. Burada, ifade ve ⁸ ' de açıklandığı gibi saf Maya Poli(a) polimeraz (yPAP), 0,5 mg/mL konsantrasyonu kullanıldı. Maya veya E. coli PAP her iki var hemen hemen aynı etkinlik 3 eklenmesi için ' dATP ve ticari olarak satın alınabilir (malzemeleri tablo görmek).

1. Ekleyin 13,5 µL 5 x konsantre Poli(a) polimeraz tepki tampon, 10 mm 3 2 µL ' dATP, 1 µL RNase inhibitörü ve 1 µL Poli(a) polimeraz gelen tepki için adım 2.2.1. Mix ve spin için 30 dk. eklemek 32.5 µL H ₂ O her tepki için 37 ° C'de 1 s. Incubate. RNA olduğu gibi adım 1.10.1 arındırmak. RNA 14 µL H ₂ O. elute

4. Ligasyonu ters 3 ' 5 bağdaştırıcılarına ' RNA parçaları son

1. 6 µL. 3 eklemek µL 10 x T4 RNA ligasyonu arabellek, 3 µL 10 mM ATP için sesi azaltmak için vakum yoğunlaştırıcı 10 min için tepkiler gerçekleşti , 15 µL PEG­-8000, 1 µL RNase inhibitörü, 0,1 mM ters Kompleman 3 1 µL ' bağdaştırıcı " revRA3 " (malzemeleri tablo görmek) ve 1 µL yüksek konsantrasyon RNA ligaz 1, mix.
2. Reaksiyonlar ısıtmalı bir mikser üzerinde 16 h için 24 ° C'de aralıklı 1000 devir / dakikada karıştırma ile kuluçkaya. 70 µL H ₂ O her tepki ekleyip karıştırın. RNA olduğu gibi adım 1.10.1 arındırmak. O. örnekleri saklanabilir-80 ° C'de bu noktada 14 µL H ₂ RNA elute.

5. Transkripsiyon (RT) ters

1. yer eluates için 11 µL. Transfer reaksiyonları 200 µL PCR için sesi azaltmak için vakum yoğunlaştırıcı 3 dk içinde tüpler. 1 µL 0.05 mM RT astar eklemek " Bio-dU-dT25 ". PCR cycler 70 ° C'de 5 min için ısı ve RT 5 dk. için terk
2. 1 µL 10 mM dNTPs, 4 µL 5 x transkriptaz arabellek, 1 µL 0.1 M DTT, 1 µL RNase inhibitörü ve 1 µL transkriptaz ekleyin. Mix ve PCR cycler 80 ° C'de 10 dk 55 ° c ve 10 min için tepkiler ısı. Buz üzerinde veya-80 ° c daha uzun depolama için devam.

6. Sindirim urasil DNA Glycosylase enzim karışımı ile

1. damlalıklı 100 µL Streptavidin-boncuk 1,5 mL şişe içine 800 µL biotin bağlayıcı arabelleğe resuspend ve yer manyetik bir raf. Tüpler 2 - 3 kez tersine çevirin. Ne zaman açık arabellek kaldırın. Çamaşır adımı yineleyin. Boncuk 200 µL biotin bağlayıcı arabelleğe resuspend.
2. Boncuk çözüm ters transkripsiyon tepki ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 20 dk kuluçkaya. Yıkama 2 x biotin bağlama ile tampon gibi boncuk adım 6.1 ve 2 x on tampon ile manyetik bir raf. Boncuk 50 µL on arabellekte resuspend, 2 µL urasil DNA glycosylase enzim karışımı ekleyin ve aralıklı karıştırma ile bir mikser 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
3. Ekle 50 µL H ₂ O, RNase h 11 µL tampon ve tepkileri için 1 µL RNase H. Manyetik bir raf üzerine 20 dk. yer boruları için 37 ° C'de kuluçkaya ve yeni bir tüp cleaved cDNA içeren sıvı transfer
4. cleaved cDNA arındırmak.
   1. Ekleyin 550 µL arabelleği PB PCR arıtma Takımı'ndan bölünme reaksiyonlar. 3 M sodyum asetat, pH pH düşürmek için 5,2 10 µL ekleyin. Tepkiler yük en az elüsyon spin sütunlar ve spin 17.000 x g 1 dk.
   Akış yoluyla
   2. eklemek 750 µL arabelleğe PE sütunlar ve 17.000 x g 1 dk. spin atmak. 17.000 x g Kuru için 1 dakika için sütunları spin. Sütunları bir 1,5 mL flakon aktarmak, 16 µL H ₂ O ve 17.000 x g 1 dk. spin gerçekleşti tepkiler için 7 µL bir birime konsantre için 8 dakika vakum yoğunlaştırıcı eklemek.

7. Ligasyonu 5 ' 5 bağdaştırıcılarına ' cDNA ucunun

1. izole cDNA için 3 µL 10 x T4 RNA ligaz 1 arabellek, 3 µL 10 mM ATP, 15 µL eklemek PEG­-8000, 1 µL 50 µM " revDA5 " oligo ve 1 µL yüksek konsantrasyon T4 RNA ligaz 1. 20 h. eklemek 70 µL için 24 ° c H ₂ O her tepki için kuluçkaya. Örnekleri-20 ° C'de bu noktada saklı.

8. PCR, amplifikasyon kütüphaneler ve Boyut seçimi pilot

1. bir pilot reaksiyon, Kütüphane amplifikasyon veya üssel faz içinde ulaşmak için döngüleri PCR en uygun sayısı belirlemek.
   1. Damlalıklı 25 µL DNA polimeraz mix, 20 µL ligasyonu tepki, 2 µL H ₂ O, 1,5 µL 10 µM ileri PCR astar (RP1) ve 1.5 µL 10 µM ters PCR dizini astar 200 µL PCR tüp içine.
   2. Aşağıdaki programla cycler çalıştırın: 3 dk. 20 20 döngüsü tarafından takip 95 ° C s 98 ° C, 20 s 67 ° C ve 30 s 72 ° C. 7 toplamak µL aliquots 6, 8, 10, 12, 14, 16 ve 18 döngüleri cycler doğrudan dan sonra. Arabellek (% 50 gliserol, % 0.05 Ksilen cyanol) yükleme x 1 µL 10 ekleyin. Not: Lütfen eğer barkod birleştirirken çoğullama kullanarak tedarikçinin önerileri izleyin.
   3. Ayrı ürünler üzerinde % 2 özel küçük yuva, 1:10, floresan yeşil boya 00 seyreltme içeren 1 x TBE arabellekte jel.
      1. Yük aliquots üzerinde % 2 özel jel ve jel 100 volt 15 dk. Visualize geçiş PCR ürünlerinin bir jel dokümantasyon sistemde çalışacak.
2. İki kez pilot reaksiyon ( Şekil 2) için kullanılan birimleri ile büyük ölçekli bir PCR reaksiyonu için pilot reaksiyon üstel amplifikasyon başında döngü sayısı kullanın.
   1. İçin büyük ölçekli PCR reaksiyonları, konsantre ve tepkiler ilk PCR arıtma kiti ile desalt ve 1 x TBE tampon % 2 özel jeller üzerinde geniş yuva ürünlerde ayrı.
3. 200-350 nt DNA içeren jel dilimlerini dışarı kesmek ürünleri. Jel, RT chaotropic arabellek için 30 dakikaya kadar kavrulur. DNA jel dilimleri bir jel ekstraksiyon kiti ile ayıklamak. A-zengin DNA ⁹ bağlama içinde önyargı önlemek için 50 ° c ısı değil.
4. Gönder sıralama için.
   Not: Genellikle 50 döngüleri tek-okunur (SR50) yeterlidir (bkz, örneğin için https://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html).

9. Veri işleme

Not: elde edilen sıralama veri (fastq formatında) gitlab depo (https://git.scicore.unibas.ch/zavolan_public/A-seq2-processing) yazılımlarının işlenir. Analiz dört ana adımları içerir: (1), yükleme (2) bir sanal ortam, git havuzu analizi ile başlatılması (3) belirli parametreleri ayarlama yapılandırma dosyası ve (4) indirme ‘ snakemake ’ ¹⁰. tek bir komut için adım 4'te yapılan tüm analiz gerekir. Analiz ayrıntılı adım adım açıklamasını gitlab depo README dosyasında bulunabilir ve kısa bir açıklama aşağıda mevcuttur. Tüm bireysel işlem adımları halk için elde edilebilir araçlar, dış kaynaklardan gelen ya da yürütme tamamlandı veya şirket içinde hazırlanmış. Hesaplamalı boru hattı bir anakonda tabanlı ¹¹ python 3 sanal ortam snakemake paket kullanılabilir ¹⁰ ile bağlıdır. Üstünde makine Unix benzeri işletim sistemi ile çalışır ve CentOS 6.5 işletim sistemi yüklü olan bir Linux ortamı ve 40 GB kullanılabilir RAM test edildi. Yazılım bağımlılıklarının otomatik olarak sanal ortamı içinde kontrol edilir. Aşağıdaki genel kullanıma sunulan yazılım araçları gerekli ve böylece ortamı ile birlikte yüklenen: snakemake (v3.9.1) ¹⁰, fastx araç seti (v0.0.14) ¹², STAR (v2.5.2a) ¹³ , cutadapt (v1.12) ¹⁴, samtools (v1.3.1) ^{14 , 15}, bedtools (v2.26.0) ^{16 , 17}.

1. Veri ön işleme'den okuyan cDNAs
   Not: sıralama derinlik çalışmaları arasında değişiklik gösterebilir ve enstrüman bağlı olarak bir örnek verileri birden fazla sıra dosya bölünebilir. Bu durumda ise, bir örnek için aşağıdaki adımlarda kullanılır tek bir giriş dosyasında karşılık gelen dosyaları birleştirin.
   1. Dosya fastq fasta biçimine.
   2. Özü okur doğru yapısı (3 thymidines okuma pozisyonlarda 5, 6 ve 7).
      Not: doğru şekilde yukarıda açıklanan deneysel protokolüne göre hazırlanan bir okuma bir yapıya sahip olmalıdır (5 ' sonu): 4-nükleotit barkod - 3 thymidines - transkript 3 Kompleman ters ' son.
   3. Sırası Açıklama satırı başlangıç tetramer hakkında bilgi depolamak.
      Not: Tetramer amplifikasyon eserler daha sonra analizde düzeltilmesi kolaylaştırır benzersiz bir moleküler tanımlayıcı (UMI) olarak hizmet vermektedir.
   4. İlk yedi nükleotit okuma kaldırmak ' s 5 ' son.
   5. Sırası ve UMI amplifikasyon eserler okuma aynı ile yalnızca bir kopyasını tutarak eklemek için düzeltin.
   6. 3 parçası kaldırmak ' bağdaştırıcı dizisi ve sonra geriye doğru tamamlayıcı sırası maçlar sonunda. Sadece uzunluk alt sınırı olan okuma ile devam (varsayılan: 15 nt).
      Not: uzunluğuna bağlı olarak özgün mRNA parçası ve sıralama döngüleri, 3 sayısı ' okunur sonu 3 parçası içeriyor olabilir ' adaptörü, bu adımda kaldırılır.
2. Aşağıdaki kriterleri yerine getirmek tüm okuma ayıklamak: en fazla 2 bilinmeyen nükleotit (' N '), en fazla %80 olarak ve son nükleotit okuma değil A. Bu okuma analizde kullanılacak yeterli kalite olarak kabul edilir.
3. Okuma genom spliced okuma işleme ve BAM biçiminde bir çıkış dosyası oluşturan bir araç ile eşleştirmek.
   1. Eğer STAR kullanılır, okuma eşlenmiş gereken Genom dizini ile bir dosya oluşturur. İnsan Genomu 35 GB bellek (RAM) bu adımı gerektirir.
   2. Harita okuma için genom.
      Not: (STAR özel notlar) yumuşak kırpma 3 eşleme zorlamak için devre dışı ' sonunda her okumak bu gibi nükleotit hemen ters yönde bölünme sitesinin.
4. BAM bir yatak-dosya dönüştürme. Bir okuma birden çok konuma varsa, yalnızca en düşük ile mesafe düzenleme devam.
   Not: Belirli bir konumda eşlenmiş okunur kopya sayısını skor kullanılır. Birden çok konuma harita okuma kesirli yerlerin hangi için bir okuma haritalar 1/numarasına eşit ağırlığı her konuma sayılır.
Bir büyük olasılıkla sıralama hatası değişir
5. çöküşü defa okundu. İki ayrı okuma aynı konuma yeniden eşleştirirseniz (başlangıç ve bitiş konumları eşlemeleri aynıdır) ve onlar aynı UMI paylaşmak, onları PCR çoğaltmalar olarak ve yalnızca bir devam.
6. Sonucuna tüm bireysel pre-mRNA 3 ' işleme siteleri son.
   Not: Bireysel bir okuma için bir 3 kanıt sağlar ' son ne zaman onun son dört nükleotit hatasız genom eşlenir. Hangi pozisyon 3 ' okuma haritalar sonu bölünme site olarak saklanır.
7. Algıla 3 ' sonunda iç astar kökenli olduğu siteleri. Ne zaman 10 nt aşağı genom bölünme sitesinin tatmin site iç astar yapısı olarak tanımlamak aşağıdaki ölçütlerden biri: fazla altı olarak içerir, altı ardışık olarak veya bir aşağıdaki tetramers ile başlar: AAAA, AGAA, AAGA, AAAG .
8. Bireysel 3 bir tablo oluşturmak ' yatak biçiminde işleme siteleri son.
9. Tespit bağımsız olarak Poli(a) sitesi kümeleri düzenlenir.
   Not: Burada açıklanan adımları bir önceki yayın ⁵ ' te kullanılmaya başlanan yordamı izleyin.
   1. Başlatmak bireysel 3 toplayarak ' çalışmanın tüm örneklerinde elde edilmiştir işleme siteleri son.
   2. Bilinen Poli(a) sinyalleri ⁷ -60 için + 10 bölgede açıklama nükleotit bireysel her 3 çevresinde ' son işleme sitesi.
   3. Tespit Poli(a) siteleri aşağıdaki gibi arka planda her örnek yukarıda dile getirdi.
      1. Onların ham ifade geçerli örnek içinde belgili tanımlık yer sıralandı. Sitelerin listesini yukarıdan genom önceden tanımlanmış bir mesafe içinde yer olmaları durumunda alt sırada yer bir daha yüksek dereceli siteyle ilişkilendirme yukarıdan aşağıya doğru çapraz geçiş (varsayılan: 25 nt up - veya karşıdan akış) üst düzey siteden.
         Not: tüm düşük rütbeli siteler yüksek rütbeli bir site ile ilikili tüm bu sitelerin belgeleyen okuma sayısı, Ifade olduğu küme tanımlamak.
      2. Bu kümeler sıralama ifadesi tarafından ve kümeleri listesini yüksekten en düşük ifade, bir ek açıklama eklenen Poli(a) kümeleriyle yüzdesi sinyal açılan bir önceden tanımlanmış eşik (aşağıda ifade eşik c belirlenmesi için çapraz geçiş yapma Varsayılan: % 90'ı).
      3. Atmak herhangi bir küme kesme aşağıdaki sitelerden.
   4. Küme yakından aralıklı 3 ' sona örnekler üzerindeki elde edilen sitelerinin.
      Not: Sıralama 3 ' siteleri ilk örnekleri destekleyen sayısını ve normalleştirilmiş toplamı göre işleme sonunda okumak sayısı (başına okur milyon (RPM)) örnekleri arasında. Listenin yukarıdan aşağıya doğru onların mesafe yüksek rütbe siteye önceden tanımlanmış bir sınırdan daha büyük olduğunda alt sıralarda yer alan siteler daha yüksek sırada sitelerle ilişkilendirme üstten geçme (varsayılan: 12 nt). Ne zaman herhangi oluşturan 3 ' son site bir ek açıklama eklenen Poli(a) sinyal ile çakışıyor veya doğrudan, karşılık gelen küme iç astar algılamak daha fazla kontrol için işaretlenmiş Poli(a) uyarısı vardır.
   5. Birleştirme Poli(a) site kümeleri.
      Not: bir küme olarak sözde iç astar aday olarak işaretlenmesi, bu iki kümeyi Poli(a) sinyallerini paylaşıyorsanız bir aşağı akım kümede birleştirilmiş veya kümenin en aşağı akım sitedeki en azından bulunan bir Poli(a) sinyale sahipse muhafaza akıntıya karşı mesafe (varsayılan: 15 nt). Son olarak, yakından aralıklı kümeleri Eğer birleştirilir: (i) aynı Poli(a) signal(s) paylaştıkları veya (ii) elde edilen küme aralığını en fazla olamaz (varsayılan: 25 nt).
   6. Saklamak tüm 3 okuma sayısı kümeleri ile normalleştirilmiş Toplam yatak-dosya biçiminde ' sona siteler puan olarak her kümedeki.

Poli (A)-RNA içeren izole kültürlü hücrelerden alkalin hidroliz tarafından parçalanmış ve cDNAs ile ters transkripsiyon oligo(dT) astar ile yapılmıştır. Elde edilen cDNA streptavidin boncuk üzerinde immobilize, dU urasil belirli eksizyon tepki olarak i ciddi, bağdaştırıcıları 5' tane ve biter 3' cleaved parça ve ekler sıralı. Şekil 1 deneme grafik bir özetini gösterir.

HeLa ve HEK293 hücreler için 106 hücre protein kodlayıcı genlerin yordamın sonundaki büyük çoğunluğu için Poli(a) siteleri tanımlamak yeterliydi. Ancak, diğer hücre türleri veya doku deneyde kullanılan hücre sayısı olarak tanımlanan Poli(a) sitelerin sayısı doygunluk test etmek gerekli olabilir için artırır. Pilot PCR temsilcisi sonuçlarını adım ve DNA parçası sıralama önce örnek analizi Şekil 2' de gösterilmiştir.

Şekil 3 Sequencer'ı elde edilen ve genom için eşlenmesi hazırız kalite kontrol, bağdaştırıcı kesilmiş okuma ile biten fastq dosyasından başlayarak, sayısal analiz, ön işlem adımları gösterir. Şekil 4 belirli bir örneğinde tanımlanan siteler işleme mRNA 3' ucu katalog karşılık gelen genom ve son okuma eşleştirmeyle ile başlayın çözümleme adımları gösterir. Ne zaman birden fazla örnekleri analiz edilir, ek adımlar 3' ucu bireysel örnekleri bulunan siteleri işleme maç ve onların bereket örnekler üzerindeki rapor için devam etmektedir. Aşağıdaki adımları şekil 5' te gösterilmektedir.

Böylece, örnekleri sıralı bir kez okumak eğe (fastq biçiminde) kullanılabilir işleme boru hattı elde edilen sıralama analizi basittir. Örnekleri hakkında bilgi yapılandırma dosyasına ekledikten sonra boru hattı yürütülmesini çıktı dosyaları iki ana tür neden olur: 1) yatak-dosyaları ile tüm 3' işleme siteleri tespit bireysel örnekleri (örneğin "sona sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") ve 2) çalışmanın tüm örnekleri arasında tüm Poli(a) sitesi kümeleri (clusters.merged.bed) dosyasıyla yatak. Çıkış tüm okur (örneğin "sample1. tek tek her örnek için genom koordinatları da içerir STAR_out/Aligned.sortedByCoord.Out.bam"), daha sonra görülebilir bir genom tarayıcı IGV16gibi. Okuma profillerini görsel muayene genellikle Poli(a) siteleri genom ve çalışma odasında yapılmıştır belirli tedirginlikler üzerine oluşan değişiklikleri dağıtım ilk bir bakış sağlar. Örneğin, şekil 6 ' da belirli bir gen yanıt knock-down HNRNPC protein olarak gösterilir.

Bu genom çapında dağıtımları özetleri (Tablo 1) mevcuttur. Özellikle, kesirler sitelerin belirli ek açıklama eklenen özellikleri ile üst üste "sayar/annotation_overlap" dizinindeki çıktı dosyaları içeren (gtf dosyasından giriş olarak sağlanan; açıklamalı vardır: 3' UTR, terminal exon, exon, intron, intergenic). Son olarak, her örnek için bireysel işlem adımları sonuçları da (örneğin "sample1.summary.tsv") kaydedilir. Bu numaralarını içerir: yüksek kaliteli ham okuma her örnek, 5' uç beklenen yapıya sahip okuma, tam PCR yinelenenleri daraltma sonra kalan okur okur 9.2, bir adımda tanımlanmış ölçütlere göre eşlenen genom benzersiz olarak okur (bkz. bu sıralama hatayla sonuçlanan daraltma sonra adım 9.5), birden çok eşleme okur (bkz. bu sıralama hatayla sonuçlanan daraltma sonra adım 9.5), siteler siteleri işleme her örnek, ham 3' sonunda işleme (değil kümelenmiş) 3' zor kısım iç astar aday benzersiz 3' tüm örnekleri iç astar adaylar ve Poli(a) sitesi kümelerinin son set olmadan sitelerden işlem sonunda.

Şekil 1: A-seq2 Protokolü'nün ana adımları. Tek tek adımları rakam sol tarafında gösterilir. INSERT RNA parçaları ters transkripsiyon sonra açmak için cDNA kırmızı yeşil çizgiler olarak tasvir edilir; bağdaştırıcıları açık mavi veya turuncu renkte görünür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Pilot PCR ve nihai ürün profili. (bir) Aliquots PCR reaksiyon gelen farklı döngüsü sırasında toplanan ve % 2 özel jeller üzerinde ayrılmış. Sayılar sola nükleotit DNA merdiven ilgili gruplarından boyutunda gösterir. Bu deneyde 12 devir (*) büyük ölçekli PCR reaksiyon için seçilmiştir. (b) bir örnek boyutu sonra örneği seçimi yaklaşık 280 nükleotit bir ortalama büyüklüğü ortaya bir parça boyutu Çözümleyicisi üzerinde çalıştırın. Sayılar sola [FU] göreli sinyal yoğunluğu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: okuma sıralama ön işleme taslağını. Fastq dosyaları sıralama araç ilişkili yazılımı tarafından oluşturulan okuma ile ilgili genom eşleştirilir yüksek kaliteli okuma tanımlamak için işlenir. Şekilde tek tek adımları giriş/çıkış tayini "Veri işleme" bölümünde açıklanan protokol tek tek adımları bağlantıları olan boru hattı gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: anahat sırası işleme, işleme siteleri eşleme adım genom bireysel 3' son nesil için okumak. Boru hattı i bağlantıları olan tek tek adımları giriş/çıkış tayini şekil gösterir"Veri işleme" bölümünde açıklanan protokol adımlardan kaynaklandığıdır. Kullanıcıya teslim ana çıkış dosyası kalın olarak işaretlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: anahat siteleri sıralama co düzenlenmiş 3' ucu kümeleri oluşturmak için geçen adımları. Şekilde tek tek adımları giriş/çıkış tayini "Veri işleme" bölümünde açıklanan protokol tek tek adımları bağlantıları olan boru hattı gösterilmiştir. Ana çıkış dosyası kalın olarak işaretlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: örnek sonuçları 3' profilinin son işleme okuma boyunca IGV 16 genom tarayıcıda gösterilen NUP214 gene, terminal exon. A-seq2 okuma denetimi siRNA ile veya bir HNRNPC siRNA ile tedavi HEK 293 hücrelerinin iki örneklerinden hazırlanmıştır. Tarafından analiz boru hattı açıklamalı Poli(a) siteleri belgelenen okuma IGV genom tarayıcı giriş olarak kullanılan BAM biçiminde kaydedildi. 3' biter okuma doruklarına mRNA için 3' Ensembl içinde açıklamalı biter eşleyin. Profilleri uzun 3' UTR izoformu HNRNPC knock-down üzerine artan kullanımı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: örnek çıktı analiz boru hattı. Tek tek adımları elde edildi okuma özetleri.

Yazarlar ifşa gerek yok.