Burada bir Kolin eksikliği ve ethionine desteklenmiştir (özgür) diyet yedirerek, kronik karaciğer hasarı farelerde ikna etmek için kullanılan genel yöntem açıklanmaktadır. Sağlık izleme, karaciğer perfüzyon, yalıtım ve koruma göstermektedir. Altı hafta bir zaman ders karaciğer hasarı, pathohistology, fibrozis, enflamatuar ve karaciğer progenitör hücre yanıt hakkında bilgilendirebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Kolin eksikliği, Ethionine desteklenmiştir (özgür) diyet kronik karaciğer yaralanma modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Viral hepatit, alkolik karaciğer hastalığı veya non alkolik yağlı karaciğer hastalığı gibi kronik karaciğer hastalıkları sürekli iltihap, ilerici imha ve karaciğer parankimi, karaciğer progenitör hücre rejenerasyonu ile karakterizedir nükleer silahların yayılmasına karşı ve fibrozis. Her kronik karaciğer hastalığının son aşama siroz, Hepatosellüler karsinom geliştirmek için önemli bir risk faktörü olduğunu. Hastalık başlatma, kuruluş ve ilerleme düzenleyen işlemleri incelemek için birkaç hayvan modelleri laboratuvarlarda kullanılır. Burada altı haftalık zaman ders 6 - hafta eski erkek C57BL/6J fareler Kolin eksikliği chow ve % 0.15 DL ethionine takıma içme suyu ile besleme içeren Kolin eksikliği ve ethionine desteklenmiştir (özgür) fare modeli açıklar. Hayvan sağlığı ve tipik vücut ağırlık kaybı eğrisi izleme açıkladı. Protokol sonraki serum analizleri için kardiyak ponksiyon tarafından bir pencere tedavi karaciğer ve kan toplama brüt incelenmesi göstermektedir. Daha sonra karaciğer perfüzyon tekniği ve standart değerlendirme için farklı karaciğer lobları toplanması gösterilen, dahil karaciğer Histoloji Hematoksilen ve Eozin veya Sirius kırmızı stainings, hepatik hücre popülasyonlarının immünfloresan tespiti değerlendirmelerinin transcriptome karaciğer microenvironment yanı sıra profil oluşturma. Bu fare modeli inflamatuar okuyan, fibrogenic ve dinamikleri kronik karaciğer hastalığı ile indüklenen ve bu işlemlerin modüle potansiyel terapötik ajanlar sınamak için kullanılan karaciğer progenitör hücre için uygundur.
Giriş
Karaciğer vücudun en büyük beze gibi metabolik organ ve birçok karmaşık fonksiyonlar vardır. Karaciğer için anahtar rolleri sindirim, metabolizma, detoksifikasyon, depolanmasını gerekli besinlerin, üretim ikamet makrofajlar veya Kupffer hücreleri aracılığıyla aracılı bağışıklık ve kan plazma protein bileşenleri içerir. Karaciğer toplam kütlesi % 70-90 kadar kayıp olsa bile yeniden oluşturmak için büyük bir yeteneği vardır. Akut karaciğer hasarı durumunda kısmi hepatectomy veya asetaminofen zehirlenmesi, aşağıdaki görüldüğü gibi son derece koordineli işlemi1' deki hasarı onarmak için kalan sağlıklı tetkikine çoğalırlar. Ancak, inflamatuar microenvironment fibrozis sürüş hepatik Yildiz Seklinde hücre aktivasyonu tetkikine uzun vadeli viral enfeksiyon nedeniyle, alkollü veya alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, kronik yaralı tetikler ve karaciğer progenitör hücrelerin (LPCs) cholangiocytes veya tetkikine2,3,4,5ayırt etmek için potansiyeli çoğalması. Kesin kökeni, LPCs, karaciğer rejenerasyonu ve hepatocarcinogenesis yaptıkları katkı kaderi farklılaşma konularda yoğun tartışmaların edilmiştir ve olasılıkla yaralanma şiddeti ve bağlam2üzerinde bağlıdır. Erken rejenerasyon ilişkili olay sırası da tartışmalı, hepatik Yildiz Seklinde hücre aktivasyonu ve matris remodeling nesil bir LPC lehine niş6, diğerleri için gerekli olduğunu belirten bazı araştırmacılar ile ele alınmıştır rapor LPC genişleme ve sözde Ductular reaksiyon tetikleyici fibrogenesis7için gereklidir. Hastalık ilerleme düzenleyen temel faktörleri anlamak için ve sonuçta hasta8için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için bir girişim yaralanma ve rejenerasyon, belirli yönlerini incelemek için çok sayıda hayvan modeli var.
Kolin eksikliği ve ethionine desteklenmiştir (özgür) diyet model başlangıçta Sıçanlarda kullanılmak üzere geliştirilen ve kronik karaciğer hasarı indüksiyon fareler9,10için değişikliğin. Diyet Kolin eksikliği Engelli derleme ve çok düşük yoğunluklu lipoproteinler salgısı ile sonuçlanır. DL-ethionine hepatocarcinogen ile birlikte, bu rejimi aşırı karaciğer yağ yükleme, sürekli iltihap, periportal fibroz, LPC yanıt yol açar ve Hepatosellüler karsinom geliştirme11,12 uzun vadeli . Ancak, önemlisi, enflamatuar, fibrogenic ve LPC farklı desenler farklı fare suşları sergi yanıt dinamikleri13. Bu iletişim kuralı kronik karaciğer hasarı yakın akraba evliliğinden doğan indüksiyon en sık kullanılan C57BL/6J farelerde fare zorlanma açıklar.
Kronik karaciğer hastalığı araştırma, tipik analizleri Hematoksilen Eozin ve kollajen ifadeleri, immunohistokimyasal veya hepatik hücre popülasyonlarının immünfloresan tespiti görselleştirmek için Sirius kırmızı boyama tarafından histolojik Değerlendirmeler dahil, ve indüklenen hücresel değişikliklerin üzerinden karmaşık büyüme faktörü ve sitokin ağlar14,15,16,17 orchestrates karaciğer microenvironment transcriptomic analizleri , 18.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hayvan deney
Bu araştırmada açıklanan tüm hayvan çalışmaları Curtin Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi (onay numarası: AEC_2014_28) başlamasından önce deneyler ve Avustralya kod bakım ve hayvanların kullanımı için uygun olarak gerçekleştirilen.
- Hayvan
- 6 - hafta eski erkek C57BL/6J fareler için deneyler kullanın.
- Deneysel tasarım
- hayvan tesisi varış herhangi bir deney başlamasından önce dört gündür parkenizin fareler izin.
- Ev fareler üzerinde görünür tahıl ve SAP tükenmiş ve 12 saatlik gün/gece döngüsü içinde ayrı ayrı fareler kulak buğday saman yatak kafesleri havalandırılmış. Üç ve yedi gün yatak takımları değiştirmek o zaman bundan sonra haftalık.
- Sağlamak fareler Kolin eksikliği ad libitum ulaşabilen diyet ve içme suyu DL-ethionine % 0.15 ile desteklenmiştir. DL-ethionine-takıma su 4 ° C'de tutmak ve tazelik sağlamak ve içme teşvik etmek için iki günde içme suyu değiştirin. Kolin eksikliği chow chow haftada bir kez tam bir değişim ile iki günde kontör.
- Gözlemlemek fareler istirahat ve işleme sırasında. Hayvan sağlığı, genel görünümü, duruş, bakım, sosyal etkileşim de dahil olmak üzere standart belirtileri monitör kat koşul ve vücut ağırlığı.
- Tartmak fareler kilo kaybı % 20'den fazla sergilenmesi herhangi bir hayvan vücut sağlamak için deneme ilk iki hafta boyunca her gün are euthanized aşırı acı sınırlamak için. Bu genellikle % 5 daha az durumda hayvan var. İki hafta sonra tartma frekans için üç kez azaltılabilir haftalık (örneğin, Pazartesi, Çarşamba, Cuma).
- Karaciğer perfüzyon ve yalıtım
- fareler ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) (çalışmada bir, iki ve altı hafta yerini diyet) belirtilen süre noktalarda mayi enjeksiyonu ile anestezi. Yeterli anestezi sağlamak için pedal çekilme refleks testi.
- % 70 etanol kürkle ıslak ve dikey bir ensizyon karın duvarı Mayo makas kullanarak diyafram kadar yapabilirsiniz. Göğüs kafesi-ebilmek var olmak çıkarmak daha kolay erişim için kalp. 25 G x 1/2 kullanarak yavaş kalp ponksiyon kanla
- toplamak " kalbinde çöken önlemek için düzenli duvar iğne. Santrifüjü 2.000 x g 10 dakika için sonra serum numuneleri almak için oda sıcaklığında bir microcentrifuge tüp pıhtısı kan izin. Daha sonra Standart prosedürler 12 ile serum alanin transaminaz düzeyleri ölçmek.
- Mide ve ince bağırsak kenara çek ve portal ven bulaşmasına neden. Çıkmak ve karaciğer tamponlanmış steril fosfat ile sıvı sıvı tuz izin vermek için mayo makas kullanarak kalp kesim (pH 7.4 =) 27 G x 1/2 kullanarak portal ven cannulating tarafından " düzenli duvar iğne. Bir eşit olarak beyazlatılmış karaciğer tüm karaciğer LOB başarılı perfüzyon gösterir.
- Dikkatle karaciğer ayırmak ve forseps ve Mayo makas kullanarak bir kabında yerleştirin. Aşırı, Sigara-karaciğer doku ve safra kesesi kaldırma.
- Karaciğer koruma
- Toplam karaciğer ağırlığı, bir küçük LOB birkaç milimetre kare, birkaç küçük parçalar halinde kesin kayıt altına alınmış sonra onları steril tüpler aktarabilir ve ek-sıvı azot için daha sonra RNA donma ve standart protokolleri göre protein çıkarma. Ek-bu doku parçaları herhangi bir doku yıkımı önlemek için en kısa zamanda organ toplandıktan sonra dondurma.
- Standart protokolleri gibi başına % 10 daha sonra işleme ve parafin katıştırma, tarafsız tampon formalin bir lobunda toplamak.
- Bir LOB reçine katıştırma optimum kesim sıcaklık cryomatrix ile dolu ve ek-freeze sıvı azot bir kalıba yerleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ÖZGÜR kaynaklı kronik karaciğer hasarı altı haftalık süre boyunca parametreleri gün 7 (indüksiyon fazında), 14 ve 21 (kuruluş aşaması) ve 42 (bakım faz) değerlendirildi. Kontrol fareler için karşılaştırıldığında, pencere tedavi fare onların ilk vücut ağırlığının % 20 bir ilk uyum aşamasında kaybetti ve kuruluş ve bakım aşamalarında (şekil 1)ağırlık kazanmak eğilimindedir. Vücut ağırlığı ters hepatosellüler yaralanma (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kronik karaciğer hastalığı genellikle asemptomatik olan çoğu hasta ile sessiz bir hastalıktır ve morbidite ve mortalite dünya çapında büyük katkıyı biridir. Kronik alkolizm ve hepatit C virüs enfeksiyonu önde gelen nedenidir. Kronik karaciğer hasarı karaciğer iltihabı tarafından karakterize fibrozis ve ağır vakalarda siroz, Karsinomu ve sonuçta Karaciğer yetmezliği. Şu anda hiçbir tedavi kullanılabilir ve önemli gelişmeler karaciğer hastalığı mekanizmaları anlamak için yapılan rağmen yeni tedavi yolları hala şiddetle iht...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar tarafından açıklanacak bir şey yoktur.
Teşekkürler
Bu eser hibe Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC), Avustralya (APP1042370, APP1061332, APP1087125) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Curtin sağlık yenilik Araştırma Enstitüsü personel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Altı haftalık erkek C57BL / 6J fareler | Batı Avustralya Hayvan Kaynakları Merkezi, Murdoch, WA, Avustralya | N/A | |
| 10 Kg Buharla Kesilmiş Buğday Chaff | Özel Yemler, Glen Forrest, WA, Avustralya | N/A | |
| Sulama için su 1000ml şişe (Baxter) | Cerrahi Ev, Perth, WA, Avustralya | ||
| Kolin eksikliği olan diyet, modifiye (peletler) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Avustralya 02960210 | ||
| DL-Etiyonin | Sigma-Aldrich, Kale Tepesi, Yeni Zelanda, Avustralya | E5139-25G | |
| Ketamil enjeksiyonu ve nbsp; | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Avustralya | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 enjeksiyonu | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Avustralya | Yok | |
| 27G x 1/2 ", Normal Duvar İğnesi | Terumo Avustralya Pty Limited, NSW, Avustralya | NN-2713R | |
| Şırıngalar Terumo 1ml ve 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Avustralya | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT bileşiği | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Avustralya | 25608-930 | |
| Nötr tamponlu formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Avustralya | NBF-2.5L | |
| Etanol mutlak anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Avustralya | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slaytları | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Avustralya | ||
| Dako Protein Bloğu, serumsuz | Dako Australia Pty Limited, Kuzey Sidney, NSW, Avustralya | X090930-2 | |
| Dako antikor seyreltici | Dako Australia Pty Limited, Kuzey Sidney, NSW, Avustralya | s0809 | |
| sıçan anti-CD45 ve nbsp; | eBioscience, San Diego, Kaliforniya, ABD | M0701 | 1/200 seyreltme |
| tavşan anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, Kuzey Sidney, NSW, Avustralya | Z0622 | 1/300 seyreltme |
| Keçi tavşan önleyici (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Avustralya | A-11008 | 1/500 seyreltme |
| Keçi sıçan önleyici IgG (Alexa Fluor 594) | Yaşam Teknolojileri Avustralya Pty Limited, Mulgrave, VIC, Avustralya | A-11007 | 1/500 seyreltme |
| ProLong Altın Antifade Reaktifi DAPI ile | Yaşam Teknolojileri Avustralya Pty Limited, Mulgrave, VIC, Avustralya | P36935 | |
| Picrosirius Kırmızı Leke Kiti | Polysciences Inc., Warrington, PA, ABD | ab150681 ve emsp; |
Kaynaklar
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
