Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Simone S. E. Nielsen; Piotr Siupka; Ana Georgian; Jane E. Preston; Andrea E. Tóth; Siti R. Yusof; N. Joan Abbott; Morten S. Nielsen

doi:10.3791/56277

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

14.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56277

⸱

24 Eylül 2017

Simone S. E. Nielsen¹ , Piotr Siupka¹ , Ana Georgian² , Jane E. Preston² , Andrea E. Tóth¹ , Siti R. Yusof²^,³ , N. Joan Abbott² , Morten S. Nielsen¹

¹Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, ²Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, ³HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Bu makalede

Özet

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Özet

Bu iletişim kuralının amacı ve ekimi pBECs ve vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modelleri pBECs mono-kültür (MC), MC astrocyte şartına orta (ACM), ile temel kurmak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar ve ortak kültür (NCC) astrocytes, domuz ile temas ya da sıçan kökenli. pBECs izole ve parçaları kapiller beyin cortices aile içi domuz 5-6 aylık üzerinden kültürlü. Bu parçaları dikkatli çıkarılması meninkslerde, yalıtım ve gri madde, filtrasyon, Enzimatik sindirim ve Santrifüjü homojenizasyon tarafından saf. Daha fazla bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için kapiller parçaları ile puromisindir içeren kültürlü orta. % 60-95 birleşmesi, kapiller parçalardan büyüyen pBECs için pasajlı zaman geçirgen membran filtre ekler ve modellerinde kurdu. Bariyer gerginlik ve pBECs BBB karakteristik fenotip artırmak için hücreleri aşağıdaki farklılaşma faktörler ile tedavi edildi: membran permeant 8-CPT-kampı (burada kısaltılmış kampı), hidrokortizon ve bir fosfodiesteraz inhibitörü, RO-20-1724 (RO). Yordamı bir 9-11 gün boyunca yürütülen ve NCC modeli oluşturulurken, astrocytes 2-8 hafta önceden kültürlü. Bağlılık protokolündeki açıklanan yordamlara endotel katmanları kurulması son derece kısıtlı paracellular geçirgenliği ile izin verdi, bir ortalama transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) 1249 ± 80 Ω cm^{gösterilen NCC ile model 2}ve paracellular geçirgenliği (P_app) için Lucifer sarı, 0.90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm sn^-1 (± SEM, yani n = 55). Daha fazla bu pBEC fenotip değerlendirilmesi gösterdi sıkı bileske proteinler claudin 5, iyi ifade ZO-1, occludin ve adherens junction protein p120 catenin. Sunulan model bir dizi sağlık ve hastalığında BBB çalışmaları için kullanılabilir ve çok kısıtlayıcı paracellular geçirgenliği ile bu model taşıma ve hücre içi kaçakçılığı çalışmalar için uygundur.

Giriş

Hücresel yapısı ve fonksiyonu kan - beyin bariyerini

Dolaşım ve merkezi sinir sistemi (MSS) arayüzü BBB CNS microenvironment kontrolünü homoeostatic için anahtar bir düzenleyici site düzgün ve sinir sisteminin korunması için gerekli olan görevi görür. BBB kan damarı Lümen astar endotel hücreleri sitedir. Beyin kılcal, endotel hücreleri karmaşık hücreler arası sıkı kavşaklar oluşturmak ve belirli akını ve sızma taşıyıcılar güçlü polarize ifade şekillerinin çok özel moleküler taşıma kan ve beyin ¹arasında olun. Sıkı bağlantı kompleksleri yapısal bileşenlerini aile occludin ve claudin, zonula occludens (ZO) protei....