Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Summary

Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.

Abstract

Zebra balığı larva bir gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesi için önemli model organizmadır. Ayrıca, Zebra balığı larva uzay ve zaman ile hücresel kararlılık içinde dinamik biyolojik olayların canlı yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüleme için değerli bir sistemdir. Ancak, özel saklama geleneksel yöntem canlı görüntüleme için larva geliştirme ve doku büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve tuzak aygıt büyüme ve görüntüleme için), hangi tasarlanmış ve larva yüksek çözünürlüklü mikroskopi için izin ederken yönlendirmek için işlevsel olarak bölümlere bir aygıt olarak fabrikasyon Kaudal fin transeksiyon aygıt ve sonraki kontrolsüz kuyruk geliştirme ve yeniden büyüme içinde. Yaralama ve canlılığı koruyarak uzun vadeli görüntüleme için bu cihaz sağlar. ZWEDGI kalıp baskılı 3D olduğunu göz önüne alındığında, onun geometrileri customizability üstesinden kolaylıkla değiştirilerek farklı Zebra balığı görüntüleme uygulamaları için. Ayrıca, zWEDGI kolay görüntüleme için birden çok larvalar yönünü ve aygıtı yeniden kullanılırlığı reaktifler, uygulanması veya yaralama için deneme sırasında larva erişim gibi çok sayıda avantaj paralellik sunar.

Introduction

Zebra balığı larva Danio rerio yeniden üretim kapasitesini yapmak onları bir ideal model organizma yara yanıt yanı sıra^1,2,3,4şifa ve büyütme incelenmesi. Transgenik Zebra balığı hatları ve Zebra balığı'nın anatomik şeffaflık daha fazla bir dizi erişim için in vivo çalışmalar yara yanıt olaylar hem de uzun vadeli rejeneratif işlemleri⁴onların yardımcı geliştirmek. Bu nedenle yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış Floresans mikroskobu kullanarak bu biyolojik süreçlerin çalışma yüksek kararlılık ve Zebra balığı larva en az hareketin canlılığı koruyarak sağlar canlı bir görüntü Zebra balığı aygıtı gerektirir. Bu cihazın etkili şifa süre yaralama için izin verir ve rejenerasyon oluşur aygıt tarafından etkilenmemiş anahtarıdır.

Larva özel içinde canlı görüntüleme sırasında katıştırma Standart canlı görüntüleme sabitleme yöntemi büyüme kısıtlar ve rejenerasyon⁵ yara ve larva dört sonra kalp stres ve doku nekrozu belirtisi göstermeye başlar beri ölüm oranlarını artırabilir Saat⁴. Bu nedenle, özel ilgi bölgelerinden kaldırılması genellikle normal gelişim izin gereklidir ve rejenerasyon⁶için özel olarak potansiyel zararı larvalar açığa, kes gitsin. Ayrıca, özel^5,6,7katılaşır önce teknik katıştırma özel ile kısa sürede larva kullanıcı yönlendirmek gerekir. Hızla larva manipüle sadece kullanıcının beceri gerektirir, ayrıca larva hasar riski. Her ne kadar canlı görüntüleme için larva stabilize etmek için yöntemler ridged agar wells³ veya divets⁸gibi bu sakıncaları aşmak için tarif var silikon vakum kullanımı yağ PVC boru veya diğer görüntüleme bir oda oluşturmak için malzemeler⁶ve dönme tüp⁹, bu yöntemlerin çoğu vardır emek yoğun, dağınık, sık sık yeniden ve çevre düzenlemesi için izin verme (ilaç tedavileri, yaralama vb.) Balık takıldıktan sonra.

Bu nedenle, zWEDGI cihazı (Resim 1) bazı örnek manipülasyon erişimine izin verme sırasında Zebra balığı larvalar uzun vadeli canlı görüntüleme için montaj agar sakıncaları üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. ZWEDGI üç yarı açık bölümlere odaları (izin vermek için,şekil 1A) yükleme, kısıtlama, yaralama ve 2-4 gün sonrası döllenme Zebra balığı larva görüntüleme için oluşur. Cihaz Polydimethylsiloxane (PDMS) imal edilmiştir ve kapak notu bir 60 mm cam alt görüntüleme tabak yerleştirilir. Ancak zWEDGI tasarım modüler tasarım ve standart üretim teknolojileri kullanmanıza değiştirilebilir ve yordamlar için özellikle deneysel prosedürler çeşitli mükellef burada sunulan tasarım yara iyileştirici çalışmalar için amaçlanan oldu bu deneysel manipülasyon ve uzun vadeli görüntüleme ile en az kısıtlama gerektirir.

Protocol

Not: temel zWEDGI tasarım 2-4 gün sonrası döllenme (dpf) ve University of Wisconsin-Madison araştırma hayvanlar Kaynak Merkezi yönergeleri izleyin Zebra balığı larva için formüle edilmiş.

1. tasarım ve kalıpları 3D baskı

1. Model PDMS bileşen istenen geometrileri ve özniteliklerle bir 3D modelleme yazılımı ⁵ cihazın. Boş bir kalıp ve PDMS parçası bir derleme oluşturmak ve PDSM bölgesine karşılık kalıp içinde bir oyuk oluşturarak PDMS bölümü için negatif bir kalıp oluşturun. Kalıp 3D baskı ( 2 rakam, adım 1.1) için bir .stl dosyası olarak kaydedin.
   Not: Bir Stereolitografi biçimi (.stl) burada sunulan kalıp tasarım ( şekil 1) elde edilebilir için download vasıl https://morgridge.org/designs/ dosyasıdır.
2. Baskı kalıpları fotopolimer 3D yazıcı ( Şekil 2, adım 1.2) kullanarak. Birden çok kalıpları yapmak tek bir baskıda mümkünse, böylece birden fazla cihaz kalıp PDMS tek bir toplu işlemle.
   Not: gösterilen örnek fotopolimer reçine ⁵ kullanarak bir 0.075 mm ışın çapı ve 0.05 mm kalınlığı ile res modunda basıldı.
   1. Temiz kalıpları nazikçe fırçalayın ve iyileşmemiş reçine kaldırmak için iyi bir fırça, denatüre alkol bir sprey şişesinde ve basınçlı hava kullanarak. Microchannel bölgelerden herhangi bir malzeme çıkarmak.
   2. İyileşmemiş istifa Zebra balığı larva ¹⁰ için toksik olduğu gibi her iki tarafında 60 dk için bir UV sonrası tedavi aleti kalıpları sonrası tedavi.
3. Sızdırmazlık yüzeyler (kanal geometrileri ve kalıp çevre takılması) zımpara ile temas kadar düz bir yüzeye 200 kum zımpara ile kalıp boşluğuna tarafında kum. Hafifçe 400 ve 600 kum zımpara kağıdı ile aşamalı olarak, tüm geometri Balata ( Şekil 2, adım 1.3) arasında düzgün floş yüzeyler üretmek için kum. Yakın tasarlanmış derinliği olduğunu doğrulamak için bir arama göstergesi ile zımpara sonra kavite derinliğini ölçmek.
   1. Temiz kalıpları ve kapak diskler (1 ¾ inç çap x ¼ inç kalın borosilikat cam veya akrilik; bir cam kalıp örtmek) bir ultrasonik temizleyici 30 dk için su dolu yerleştirerek veya akan suyun altında kızarma.
   2. Darbe basınçlı hava ile kuru ve her iki kalıpları temiz ve izopropil alkol ve filtre uygulanmış basınçlı hava ile kapsar. Temiz bir Bank havadan enkaz kirlenme en aza indirmek için cihazlar imal etmek bir yer olarak kullanın. Temizlenmiş kalıpları ve cam kapsar temiz tezgah veya kapaklı bir petri gerekinceye kadar tabak bırakın.

2. ZWEDGI cihaz imalatı PDMS

1. yapmak PDMS dökme 184 tarafından silikon elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) 5:1 (temel harekete geçirmek için) plastik bir kap içine bir oranında. Ekmek yoğurma gibi kendi, üzerine jel üzerinde karıştırarak bir ahşap tekne sopayla de 2 dakika karıştırın. 5 kalıpları için 10 g tabanının ve harekete geçirmek, 2 g kullanın.
   1. Tüm baloncuklar gitmiş kadar karışımı bir vakum desiccator 25-45 dk için de-gaz.
   2. Kadar kalıp biraz bir Menisküs ( Şekil 2, adım 2.1) aşan bir 10 mL şırınga kullanarak PDMS yaklaşık 0.75 mL ile her 3D yazdırılan kalıp boşluğuna doldurun.
   3. Doldururken oluşmuş ek kabarcıklar kaldırmak 45 dk için doldurulan kalıplar de-gaz.
2. Cam örtmek yuvarlak yüzey üstünde tepe-in PDMS dolu kalıp uygulamak, kabarcıklar önlemek için bir açıyla aşağı disk tuşuna basarak tuzağa ( Şekil 2, adım 2.2). Aşırı PDMS cam disk kapak uygulandığı gibi okuldan izin.
Örtmek yuvarlak yüzey için kalıp sıkıca tutmaya
3. kullanım küçük kilit kelepçe.
   Not: bir kez PDMS tedavi edildi ve 3D yazdırılan geometrileri cam kapak notu ile aynı hizada nerede deliklerden üretir bu düz bir yüzey oluşturur. Alternatif olarak, aynı anda tedavi cihazlarının sayısını artırmak için bir çok kelepçe aygıtı (örn. oluşturmak Şekil 2, adım 2.3).
4. 100 ^o C fırında, klempe kalıpları PDMS cihazda 90 dk ( Şekil 2, adım 2.4) için tedavi. Kalıpları fırından çıkarın ve kolayca ele alınması kadar soğumasını bekleyin. Sıkma cihazın metal ise, metal PDMS kalan ısı nedeniyle tedavi devam etmesini önlemek için kelepçe kalıp ve kapak disk montaj kaldırmak.
   Not: Cihazın hala biraz sıcak ve tam olarak tedavi kalıp kaldırmak kolaydır. Ancak, bir kez kalıp fırın kaldırılır ve örtmek yuvarlak yüzey kaldırılır, bir kaç gün demolding için devam etmeden önce aygıt oturabilirsin. Cihazın kısa bir süre kür fırından çıkardıktan sonra demolded, kirletici tam olarak tedavi için izin verirken en aza indirmek için kapalı bir petri kabına yerleştirin.

3. Plazma-bağ zWEDGI cam çanak

1. kelepçe bir tezgah Yardımcısı PDMS aygıtı içeren kalıp böylece kalıp ' s geometrileri çalışma istasyonu tezgah için bakan, paralel. Düz uçlu cımbız kullanarak kalıp PDMS çekme sekmesinden serbest bırakarak PDMS aygıtı kaldırmak için
   1. Başlat. Çevre (gibi bir pasta ( 2 rakam, adım 3.1) bir tava dışarı kaldırma) cımbız ile kalıp ve geçici çözüm.
   2. Sıkıştırılmış hava ve yavaşça çekme tırnağını tutarak ve cihazın altında hava üfleme kalıp cihazınızdan çekin cımbız kullanın filtre. Yavaş, iş yardım için hava ayrı kalıp üzerinden PDMS izin, ince tünel bölümleri cımbız ipuçları ile özel dikkat.
2. Yasaklama tünel dilimleri plastik ( 2 rakam, adım 3.2) dokunuyorsun PDMS aygıt alt üst kapak cam kaynatıp yemeğin içine yerleştirin.
3. Ters zWEDGI ve karşılık gelen cam kaynatıp tabak çanak kapağı bir plazma temizleyici yukarı bakacak şekilde iç cam ile ( Şekil 2, adım 3.3) yerleştirin.
   1. 500 mTorr basınç ulaşıncaya kadar odası Temizleme plazma tahliye.
   2. Set radyo frekansı (RF) gücü yüksek. Cihazın ortaya çıkarmak ve yemek için RF frekans yaklaşık 2 dakika süreyle yavaş yavaş odası de-basınç ve cihaz ve çanak temiz oda kukuIeta döndürür.
4. PDMS aygıt çanak kapağı çıkarın. Dikkatle Merkezi de cam alt çanak ( Şekil 2, adım 3.4)
   1. üzerine arka uç cımbız kullanarak getirerek PDMS zWEDGI camına doğru şekilde üzerinde flip, hafifçe bastırın PDMS üzerinde Hava kabarcıkları altında sıkışmış değil emin olmak için aygıt. Mikro kanallar dakika geometrileri çevresinde basınç uygulayın ve kenarları ( şekil 5C) PDMS düzgünleştirmek.
      Not: PDMS ve cam arasında tam temas plazma bağ üzerinden daha iyi uyum sağlar. ZWEDGI aygıt-ebilmek var olmak diğer altlı cam tabak formatlarını altlı cam 6-şey plat üzerine yapıştırılmış plazmae ( şekil 2C).
   2. Temiz oda hood çıkarmadan önce aygıt çanak üzerinde bir kapak yerleştirin.
      Not: cihazlar için cam düzelttikten sonra kullanıma hazır olana protokol duraklatılmış.

4. Hazırlık ve yükleme larva kanal

Not: genel Zebra balığı yetiştiriciliği gerçekleştirilmiştir Zebra balığı kitap elde edilebilir online http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Yetişkin Zebra balığı ve embriyo ¹ daha önce açıklandığı gibi muhafaza. Vahşi türü AB suşu kullanılmıştır. Kurum izleyin ’ s hayvan bakım iletişim kuralı özellikleri canlı larvaları görüntüleme gereksinimleri ile ilgili olarak için.

1. Durulama kanalları en az 100 µL % 70 etanol yasaklama yoluyla durulama için bir micropipette kullanarak kanal başına bir tünel. Etanol ve 2 veya 3 kez Çift Kişilik distile su ile durulama kaldırın. Hava Kuru izin.
2. Kanalları (adlı bir konsantrasyon suda seyreltilmiş % 1) yağsız süt ile larva bağlılık cam coverslip yemeğin için en aza indirmek için oda sıcaklığında 10 dakika için doldurun. Sonra yavaşça durulama için birkaç kez Çift Kişilik distile su cihazda daldırın. Hava için baş aşağı kuru sağlar.
   Not: İletişim kuralı burada duraklatılmış. Bu hazırlık zWEDGI aygıtı kullanmak için birkaç gün önce yapılabilir. Mağaza oda sıcaklığında kapalı.
3. 100 µL % 2 erimiş LMP özel 100 µL 2 ile birleştirerek (LMP) özel x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - etil 3-aminobenzoate) E3 arabellek ¹¹ 38 ^Ey için C. önceden ısındı hazırla % 1 düşük erime noktası % 1 korumak 38 ^o C gelling önlemek için sıcak bir blok içinde özel/tricaine çözüm.
   Not: Multiphoton mikroskobu ¹¹, (örneğin casper ¹²) her iki un Pigmentli Zebra balığı değişikliklerini kullan veya 0.2 mM pigment oluşumunu önlemek için N-phenylthiourea içeren larva E3 içinde korumak yakın kızılötesi dalga boylarında absorpsiyonu pigment ile en aza indirmek için ¹¹.
   Dikkat: N-phenylthiourea zehirlidir. Kurum izleyin ' s kuralları bertarafı için.
E3
4. Anesthetize larva içeren 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) ¹¹ tampon. Larvaları hareketsiz ve non-yanıt veren bir dokunmatik uyarana kadar bekleyin.
5. Tricaine/E3 birkaç microliters kanallarıyla önceden ıslak.
   1. Pick kadar geniş orifis pipet ucu kullanarak tek bir larva iken. Larvalar bir yükleme kanala ( şekil 3A) Kasası. Bir pipet ucu veya benzer bir araç kullanarak yükleme odasında larva yükleme odası ve yasaklama tünel ( şekil 3B) doğru kuyruk yüzleri düz kenarına dorsal yüzü öyle ki şark.
   2. Dikkatle sıvı larva yasaklama tünele ( şekil 3 c) akışı sağlayan yaralama odası geri çekmek--dan. Sıvı çoğu larva ( şekil 3D) çevresinde nemi koruyarak kaldırın. Bu işlem çanak yaralama odası doğru hafifçe eğerek yardımcı olabilir.
6. Tricaine/E3 içinde % 1 LMP özel yerleştirin (~ 38 ^o C) larva üzerinde ' s kafa, yükleme Odası ( şekil 3E) doldurma. Uygun pozisyonda larva ile kuvvetlendirmek özel izin. Tricaine/E3 yaralama odasına hidrasyon korumak için gerektiğinde ekleyin. Bu yükleme işlemi kalan 2 kanal için işlemi yineleyin.
7. Bir şırınga iğnesi kullanarak dikkatli bir şekilde yasaklama tünelden yaralama Odası ( şekil 3F) seeped herhangi bir özel çıkarın. Biraz özel (için yaralama, kısa vadeli görüntüleme veya yara tedavi yalıtım) üzerinde ek tricaine/E3 ekleyebilirsiniz veya kültür yemek (için uzun vadeli görüntüleme) doldurmak için. Buharlaşma önlemek için kültür çanak kapağı değiştirin. Larva (askerinden) bu noktada yansıma ya da yaralı.

5. Yaralama ve görüntüleme larva

1. ( şekil 3 G, H) yaralama odasında notochord ¹¹ arka kuyruk yüzgeci transect bir steril neşter bıçak kullanma. Gerekirse ek tricaine/E3 ekleyin ve kültür çanak kapağı değiştirin.
   Not: Alternatif olarak, faiz gelişimsel saat penceresinin bağlı olarak, larva olabilir yaralı, E3 içinde yeniden elde etmek için izin ve bu noktada onlar gibi kanal içine yüklenebilir istediğiniz görüntüleme zamana kadar bir kuluçka (28,5 ^o C) muhafaza yukarıda açıklanan.
2. 60 mm cam alt çanak uygun büyüklükte bir sahne eklemek içinde ters bir mikroskop üzerine imzalat larvaları ile zWEDGI aygıtı yükleyin. Larva kuyruk kuyruk istediğiniz konuma almak için gerektiği gibi çanak dönen üst-çoğu kanalı bulun. Özel deneme için gerektiği gibi görüntü.
   Not: ZWEDGI geniş widefield floresan ve lazer mikroskobu tarama dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobu için geçerlidir. Zebra balığı larva Imaging bir dizi parametre dikkat edilmesi gereken noktalar vardır ancak enstrüman, örnek ve deney bağımlı parametreleri Imaging özeldir. Burada, larva kuyruk aşağıdaki parametreleri kullanan bir özel yapý multiphoton mikroskop ^{5 , 11} tarihinde görüntüsü: 40 uzun çalışma mesafe su daldırma amaç, 890 nm lazer uyarma, X 445/20 nm emisyon filtre ve 512 x 512 çözüm.

6. Deneme sonunda

1. Kaldır zWEDGI çanak--dan mikroskop. Larvalar yanında duvar ilanı zWEDGI bir buz su banyosu veya 4 ^o C için en az 20 dk, ötenazi ve kalp atışı ve kan dolaşımı yokluğu için değerlendirmek.
   Not: çünkü larva ayrı bölmeleri tutulur, larvalar ayrı ayrı forseps veya pipet ile agar üzerinde hafifçe çekerek elde edilebilir. Agar-ebilmek var olmak çıkarmak baş bölgesi ve antikor boyama için fiksasyonu gibi ek işlemleri için kullanılan veya RNA veya protein çıkarma için işlenen larva.
2. Çıkarılması larva ve agar, zWEDGI etanol ile temiz ve distile su, 4.1. adımda açıklandığı gibi ve baş aşağı hava kuru ayarla. Mağaza serin, Kuru bir yerde kapalı. Yağsız süt (Adım 4.2) ile sonraki kullanımdan önce gerektiği gibi yeniden kat.
   Not: cam parçalarından uzak gelmek PDMS başlayana kadar zWEDGIs birden çok kez yeniden kullanılabilir.

Results

ZWEDGI PDMS mikrosıvısal aygıt Kaudal fin şifa ve büyütme Zebra balığı larva olarak yaralama, canlı görüntüleme ile ilgili dört ana işlevleri (aşağıda listelenmiştir) karşılamak için tasarlanmış işlevsel olarak bölümlere bir aygıttır. Sadece hazır olmadığından ve endüstri standardı Biyouyumluluk, aynı zamanda İnşaat kalıpları içinde de bir PDMS zWEDGI imalat için seçildi. Ayrıca, cihazın oluşan bir kez PDMS aygıtı yeniden kullanılabilir ve sert ve keskin kenarları geçersiz yapar. ZWEDGI ö...

Discussion

3D zaman atlamalı istikrarı ve yüksek çözünürlüklü mikroskop objektif küçük çalışma uzaklığı içindeki balık yönlendirme tarafından görüntüleme yakalamak için zWEDGI cihazın amacı budur. Bu tasarım özellikleri karşılarken, aynı zamanda bir gelişme canlı görüntüleme için geleneksel agar tabanlı hazırlık bitti. Hangi doğru yapılmazsa arızalı aygıtlar neden olabilir zWEDGI imalatı (aşağıda) üç kritik adım vardır:

PDMS hazırlık (şekil 5A)

Ka...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrikasyon kalıpları
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modelleme yazılımı	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D yazıcı	3D Systems Inc.	23200-902	3D Sistemleri A.Ş.
Accura 60 fotopolimer reçine	3D Sistemleri A.Ş.	24075-902	3D Sistemleri A.Ş.
denatüre alkol	Sunnyside	5613735	Menards
UV kür sonrası aparatı	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Sistemleri A.Ş.
TouchNTuff nitril eldiven	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 kumlu T414 mavi bak zımpara kağıdı	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilikat cam disk, 2 "çap	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator temizleyici	Branson	1510R-MTH
izopropil sürtünme alkolü %70	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz şeffaf plastik bardak	WNA Başyapıtı	557405	Amazon
6 "zanaat sopa	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
< güçlü > Adı< güçlü	> < güçlü > Şirket < / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü
> < güçlü > zWEDGI PDMS cihazı üretin< / güçlü >
Sylgard 184 silikon elastomerik kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Yapıştırıcıları
10 mL şırınga	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
kurutucu	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 cırcırlı çubuk kelepçesi	Pittsburgh	68974	Harbour Freight
laboratuvar fırını	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Endüstriyel
cımbız seti	Aven	549825	McMaster-Carr
basınçlı hava filtreli nozul	Innotech	TA-N2-2000FT	Temiz Oda Kaynağı
vakum tezgahı mengenesi	Wilton Tool Group	63500	MSC Endüstriyel
55 mm cam alt tabak; 30mm mikro kuyu # 1.5 kapak camı	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plazma temizleyici	Harrick Plazma	PDC-001	Harrick Plazma
< güçlü > Adı< / güçlü >	< güçlü > Şirket< >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü
> < güçlü > Larva Yükleme < / güçlü >
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
% 100 etanol (kullanımdan önce su ile% 70'e seyreltilir)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipeti	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
toz yağsız süt		2902887	MP Biyomedikal
çift damıtılmış su
N-feniltiorüre	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
trikain (etil 3-aminobenzoat)		C-FINQ-UE	Western Chemical
düşük erime noktalı agaroz	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
ısı bloğu (kuru banyo inkübatörü)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 tamponu ve nbsp;
büyük delikli pipet ucu, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
Genel amaçlı pipet ucu, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 neşter bıçağı	Tüy	2976	Amazon
25G şırınga iğnesi	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Imaging
ters mikroskop
Imaris görüntüleme yazılımı	Bit düzlemi