Yöntem makalesi

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

DOI:

10.3791/56342

⸱

24 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geneplus-Beijing Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör DNA (ctDNA) yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak dolaşan analiz klinik Onkoloji gelişimi için değerli bir araç haline gelmiştir. Ancak, bu yöntem uygulama ctDNA kan eser miktarda analiz onun düşük duyarlılık nedeniyle zordur. Ayrıca, yöntem bu sıralama ve sonraki analiz yanlış pozitif ve negatif sonuçlar oluşturabilir. Fizibilite ve ctDNA algılama klinikte güvenilirliğini artırmak için burada sıralama, nadir mutasyon sıralama (ER-Seq) zenginleştirmek için nadir mutasyonlar zenginleştiren bir tekniği mevcut. ER-Seq son derece düşük frekanslı genetik değişiklikleri algılamak için umut verici bir araçtır ve böylece hastalık heterogenicity okumak çok yararlı olacak tek bir mutasyon 1 x 107 vahşi tipi nükleotit, dışarı ayırabilirsiniz. Benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı'nın ligasyonu sayesinde bu yöntem aynı zaman hataları uzmanlığından (anlam ve Antisens) için düzeltme iken, ctDNA molekülleri, verimli bir kurtarma sağlar. 1021 kb sondalar bizim seçim kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştiren 12 tümör tümör ile ilgili sürücü mutasyonların % 95'i. Bu maliyet-etkin ve evrensel yöntem genetik veri benzersiz olarak başarılı bir birikimi sağlar. Verimli bir şekilde arka planda hata filtreleme sonra ER-seq nadir mutasyonlar tam olarak algılayabilir. Bir örnek çalışma kullanarak, sonda tasarım, Kütüphane yapı ve hedef DNA yakalama yöntemleri, veri analizi iş akışı da dahil olmak üzere süre gösteren ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Genellikle bu yöntem taşımak için işlem 1-2 gün sürer.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni nesil sıralama (NGS), soykırım, sırlarını araştırmak için güçlü bir araç genetik değişiklikler ortaya çıkarabilir bilgi büyük miktarda sağlayabilir. NGS analizde klinik uygulama özellikle kişiselleştirilmiş tıp daha yaygın hale gelmiştir. NGS, en büyük sınırlamaları ancak, yüksek hata oranı biridir. Eğitim devralınan mutasyonlar için uygun sayılır, özellikle DNA analiz "sıvı biyopsisi" elde edilen nadir mutasyon analizi büyük ölçüde sınırlı1,2, olsa da.

Tümör dolaşan DNA (ctDNA) boş hücre DNA (cfDNA) tümör hücreleri döken kan var. Çoğu durumda ctDNA onun algılama ve analiz zorlayıcı olun son derece düşük miktarıdır. Ancak, ctDNA çok çekici özelliklere sahiptir: onun yalıtım minimal invaziv, tümör büyüme erken dönemlerinde algılanabilir, ctDNA düzeyi terapötik etkinlik yansıtır ve ctDNA içeren birincil ve metastatik lezyonlar bulunan DNA mutasyonları 3 , 4 , 5. bu nedenle, hızlı bir gelişme NGS tekniği ve analiz göz önüne alındığında, başvuru ctDNA algılama daha cazip oldu.

Farklı kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar ctDNA tespiti için kullanılan ama bu yaklaşımlardan hiçbiri kliniklerde sınırlamaları nedeniyle rutin kullanım için kabul edildi: düşük duyarlılık, çok yönlülük eksikliği ve nispeten yüksek maliyetli6 ,7,8. Örneğin, bir benzersiz tanımlayıcı etiketi (UID), temel çift yönlü sıralama Art arda sıralama hatalarının en takviyeli-fikir birliği uzmanlığından hataları düzeltir. Ancak, bu yöntemin fizibilite düşük veri kullanımı9,10ve yüksek maliyet nedeniyle kaybolur. Doğruluk ve evrensellik bu yöntemlerin geliştirilmesi gerekir rağmen benzer şekilde, CAPP Seq ve geliştirilmiş, yineleme, CAPP-IDE11,12, büyük pratiklik cfDNA algılama var.

Doğru ctDNA algılama ve çözümlemesi geçerli ihtiyacını karşılamak için yeni bir strateji, nadir mutasyon zenginleştirmek (ER-Seq) sıralama geliştirdi. Bu yaklaşım aşağıdaki birleştirir: Çift yönlü hata düzeltmesi ve dışarı-in tek bir mutasyon ayırt yeteneği ile ctDNA molekülleri verimli bir şekilde kurtarmak için benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı > 1 × 107 vahşi tipi nükleotit; kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştirmek 1021 kb probları %95 12 tümörler akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, dahil olmak üzere, gelen tümör ile ilgili mutasyonların Rahim ağzı kanseri, yemek borusu kanseri ve rahim Karsinomu (tablo 1); ve verimli ve nadir mutasyonlar ctDNA içinde tam olarak algılamak kolay hale temel veritabanı eleme.

Temel veritabanı oluşturmak için ER-Seq tarafından tüm gen mutasyonlarının örnekleri (~ 1000 başına) aynı türde bir dizi bulmak. Bu gerçek mutasyonlar diğer çeşitli güvenilir algılama yöntemleri ve analiz tarafından doğrulanması gerekir. Daha sonra yanlış mutasyonların desen özetlemek ve tüm yanlış mutasyonlar ilk temel veritabanı oluşturmak için küme. Yanlış mutasyonlar sonraki sıralama deneylerden buldum bu veritabanına eklemeye devam edin. Bu nedenle, bu temel veritabanı sıralama doğruluğu önemli ölçüde artıran bir Dinamik Genişletilmiş veritabanı olur.

Tümör tanısı ve takibi devam teşvik etmek, ER-Seq, evrensel veri edinimi için düşük maliyetli ve uygulanabilir bir yöntem mevcut. Biz ER-Seq analizi, uygulanan bir vaka nadir mutasyonlar ve fizibilite kullanmak için klinikte algılama doğruluğunu gösteren mevcut.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tümör örnekleri ve kan örnekleri Etik Komitesi, Pekin Üniversitesi insanlar tarafından onaylanmış bir protokolüne göre elde ' s hastane. Yazılı Onam saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için hastalardan elde edildi. Katılımcılar aşağıdaki kriterlere göre ekranlı: erkek, Gelişmiş sigara-küçük hücreli akciğer kanseri, EGFR p.L858R mutasyon belirtilen önceki Sanger sıralama tarafından hastalık ilerleme EGFR iki oturumu takip hedefli tedavi Erlotinib ile ve ER-ctDNA direnç nedeninin çözümlemek ve yeni hedef uyuşturucu bulmak için uygulanan Seq.

1. DNA çekme--dan cfDNA ve genomik DNA (gDNA) için periferik kan

  1. periferik kan toplama tüp 10 mL toplamak, yavaşça yukarı ve aşağı 6 - 8 kez için tersine çevirin karıştırın. Hücre kesme önlemek. Kan örnekleri saklanabilir toplama tüp 6-37 ° c ilâ 72 saat.
  2. Toplama tüp, oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi 1600'de (±150) x g.
  3. Dört temiz 2 mL uygun şekilde santrifüj tüpleri Pelet Katmanı (beyaz kan hücreleri) bozmadan bir tek kullanımlık damlalıklı kullanarak etiketli koleksiyonu tüpünden süpernatant (plazma) transfer.
  4. Transfer1 mL 2 ml temiz tek kullanımlık damlalıklı uygun kullanarak hücre santrifüj tüpü etiketli. Hücreler saklı-20 ° c veya daha önce adım 1.8 daha soğuk olabilir.
  5. (Kimden adım 1.3) plazma 4 ° C'de 10 dakika ve 16000 (±150) için santrifüj kapasitesi g. x
  6. Transfer düzgün olarak etiketli santrifüj tüpleri temizlemek için plazma " plazma ", kirlenmesini önlemek için alt kısmında kalan birim ~0.1 mL bırakın. Adım 1,7 kadar plazma-80 ° C'de depolayın.
  7. Plazma adım 1.6 3 mL cfDNA (içeren ctDNA) belirlemek için kullanın üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak ' s yönergeleri.
  8. Kullanım 200 µL üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak gDNA yalıtmak için adım 1.3 beyaz kan hücrelerinin ' s yönergeleri.
    Not: Her ikisi de cfDNA ve gDNA-20 ° c kullanmadan önce saklanabilir.
  9. CfDNA ve gDNA (Tablo 2) için farklı kalite denetimleri uygulanır. Kalite kontrol için örnek yıkımı ve/veya gDNA kirlenme düzeylerini belirlemek bioanalyzer standart bir yöntem yerine getirilir. CfDNA ayıklama kalitesini analizini tepe şekil 1 ' e benzer görünmelidir.
    Not: CfDNA en yüksek boyutu yaklaşık 170 olduğunu bp. Not cfDNA nadir mutasyonların etkili tespiti için daha yüksek bir kalite kitaplığındaki DNA miktarını artırarak sonuçlanır. En az 30 ng cfDNA (30.000 kopya) kullanmanızı öneririz.

2. Kütüphane hazırlık

Not: temel Kütüphane inşaat parçalanmış DNA ile ilgili olarak cfDNA en yüksek boyut ~ 170 bp ile parçaları bulunmaktadır ve böylece birleştirilmesi gerekmez.

  1. Parça denetimi örneği (gDNA) tarafından sonication 200-250 bp parçaları elde etmek için.
    1. Hazırlamak 1 µg Tris-EDTA arabelleği bir temiz sonication tüp 100 µL gDNA örneğinin.
    2. Sonication programı 30 küme s 12 dk. toplam 12 döngüleri için kapalı açık ve 30 s
    3. Ürün (5 µL) içeren 200-250 bp parçaları % 2 özel jel ile bir analiz çalıştırarak sonication sonra onaylamak.
    4. Tüm parçalanma ürünleri için yeni bir 1,5 mL tüp aktarmak ve 150 µL doğru parçaları seçmek 5 min için manyetik boncuklar ile kuluçkaya.
    5. Süpernatant kaldırmak için 30 manyetik bir raf üzerinde tüp koyarak s.
    6. Manyetik raf kalan tüp boncuk 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ile yıkayın. 30 için kuluçkaya süpernatant kaldırmadan önce s. Bir kez yineleyin.
    7. Hava kuru manyetik raf kalırken açık tüp kapaklı boncuk. DNA hedef de kurtarır emin olmak için overdried boncuk kaçının. DNA parçaları boncuk boncuk miktar tarafından UV/Vis spektroskopisi tarafından takip DNA parçalarının gidermek için 10 mm Tris-HCl (pH 8) 32 µL ekleyerek elute.
      Not: en az 200 ng aşağıdaki deneyler için gerekli.
  2. Son hazırlık tepki
    Not: takip üretici ' s öğretim ve gerektiği gibi değiştirin. CfDNA kullanım 30 ng; ve gDNA denetim olarak 1 µg. CfDNA steril nükleaz ücretsiz tüp,
    1. eklemek 7 µL tepki arabelleği, enzim karışımı 30 3 µL ng ve GKD 2 O 60 µL toplam hacmi ekleyin. Ayrı bir tüp içinde yukarıdaki bileşenleri eklemek ama gDNA cfDNA yerine 1 µg.
    2. Mix ve karışımı 30 dk 65 ° C 30 dk içinde bir thermocycler için ısıtmalı kapağı takip için 20 ° C'de kuluçkaya. Hemen bir sonraki adıma devam.
  3. Bağdaştırıcısı ligasyonu
    1. ekleyin 30 µL ligasyonu ana karışımı, 1 µL ligasyonu artırıcı ve 4 µL karışıma benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı adım 2.2.
    2. Incubate bir thermocycler ısıtmalı kapağı olmadan içinde 15 dakika 20 ° C'de.
    3. Manyetik boncuklar resuspend ve boncuklar, oda sıcaklığında en az 30 dk önce bir sonraki adım için bırakmak için girdap.
    4. 87 µL resuspended manyetik boncuklar daha önce sözünü ettiğimiz karışıma ekleyin; de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın ve sonra 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
    5. Yıkama ve hava kuru boncuk adım 2.1 içinde açıklandığı gibi.
    6. 10 mm Tris-HCl (pH 8) 20 µL ekleyerek boncuk DNA hedeften elute.
  4. Bağdaştırıcısıyla bakmaksızın zenginleştirme DNA parçalarının
    1. Ekle 20 µL bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA parçaları, dizin astar/i7 5 µL (2.5 µL astar-P7 (10 pM) ve astar-P5 (10 pM), 2,5 µL sıralama amaçları için), 25µL, Kütüphane amplifikasyon ana mix ve GKD 2 O toplam hacmiyle 50 µL.
    2. PCR yükseltmek bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA ve termal döngüsü aşağıdaki gibi: 45 için 98 ° C'de ilk denatürasyon ardından 8 döngüsü (cfDNA) veya 4 döngüleri (gDNA) tavlama 15 ° C, s, s, 65 ° C 30 s, 30 72 ° C s) ve son bir uzantısı 60 72 ° C'de s sonra sıcaklık 4'te holding ° C.
    3. Alınan parçaları almak için PCR zenginleştirilmiş DNA için askıya alınmış manyetik boncuklar eklemek 45 µL.
    4. Elute DNA parçaları 10 mm Tris-HCl (pH 8) 30 µL bağdaştırıcılarla.
  5. Kütüphane kalite kontrol
    1. üretici takip ' s protokolü için bağdaştırıcı ölçmek ticari teçhizat bakmaksızın DNA toplama. Bioanalyzer DNA kalitesini belirlemek için kullanın.

3. Hedef DNA yakalama

Not: hedef zenginleştirme bilinen tümör ilişkili sürücü mutasyonlar 12 kapsayan bir 1021 kb hedef zenginleştirme bölge için bir özel sıra yakalama-sonda özel olarak tasarlanmış kullanarak gerçekleştirilen yapıldı. tümör farklı türleri. Üretici değişiklikler ' s protokolü aşağıdaki adımları ayrıntılı.

  1. Kütüphaneler havuz engelleme
    1. eklemek 1.5 µg (havuzu cfDNA için kitaplıklarına en fazla sayısı 6, gDNA 20) adım 2, P5 Block(100P), P7 Block(100P) 8 µL ve karyolası-1 DNA'ın 5 µL 8 µL (1 µg/µL) steril bir tüp. 60 dakikaya ayarla vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüp içeriğini kuru ° C.
  2. DNA yakalama probları ile kütüphane Hybridize.
    1. 3.1: 8.5 µL 2 X hibridizasyon arabellek, hibridizasyon artırıcı, ve 1.8 µL GKD nükleaz ücretsiz 2 O. 2.7 µL adım tüpünden için aşağıdaki bileşenleri ekleyin
    2. Mix tarafından yukarı ve aşağı pipetting ve bir thermomixer 10 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya
    3. Kuluçka hemen özel yoklama, 4 µL ekleyin. 65 ve #17, termal cycler örneklerinde kuluçkaya6; C kapak ile ısıtılan 75 ° c 4 h için
  3. DNA parçaları yakalama
    1. streptavidin boncuk boncuk ilişkisiz DNA çıkarmak için yıkama tarafından takip ile melezleşmiştir hedef DNA kuluçkaya. Üretici göre ticari setini kullanın ' resuspended boncuk yakalanan DNA ile son 20 µL almak için s yönergeleri parçaları.
  4. Yakalanan DNA amplifikasyon parçaları
    1. gerçekleştirmek ticari kullanarak PCR kiti 2 µM omurga oligonucleotides ile üretici göre ' s yönergeleri.
    2. Ne zaman PCR reaksiyon tamamlandığında, askıya alınan boncuk 45 µL PCR ürüne doğrudan ekleme ve boncuk için 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile 30 µL elüsyon tarafından bağlı güçlendirilmiş hedef DNA parçalarının zenginleştirmek.
  5. Sayısal Kütüphane miktar kiti ile DNA parçalarının ve Bioanalyzer ( Şekil 2) ortalama parça boyla belirlemek.

4. sıralama

  1. sıra multiplexed 18 h. toplam veri üretilen 60 gigabayt için 75 bp eşleştirilmiş uç ishal üstünde bir benchtop sequencer kullanarak kütüphaneleri, 15 G hasta örnek cfDNA ve 1 G için denetim örnek gDNA için gerekli.

5. veri analizi iş akışı

Not: şekil 3 genel iş akışı ve veri analiz süreci görüntüler. Veri analiz parametrelerini ve komutları aşağıda gösterilir.

  1. Filtre düşük kaliteli okuma ve hataları ve NCfilter kullanarak UID maskeleme için doğru.
    NCfilter(own)
    NCfilter filtre -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
    realSeq(own)
    python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o çıkış dir -p önek -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f.
  2. Referencing genom hg19 (insan genomu 19), BWA (sürüm 0.7.12-r1039) mem kullanarak sıralama sonuçları bulun ve genom analizi Toolkit (GATK) (sürüm 3.4-46-gbc02625) yeniden hizalayın.
    BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
    java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
    Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz
    GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp bilinen —
    allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - ı cancerBam-ı normalBam
    java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
    Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp bilinen
    - allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam
  3. Küme UID ve üsleri PCR/sıralama tarafından tanıtıldı ve temel kalite değiştirmek hata düzeltmek üzere şablon parçaları konumunu göre çoğaltmaları.
    realSeq(own)
    python realSeq/bin/realSeq - p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir küme
    -m 6 önek
  4. BWA mem. tarafından kümelenmiş çoğaltmaları yeniden Hizala
    BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
  5. temel kalite puanı GATK (sürüm 3.4-46-gbc02625) kullanarak ayarlamayı tarafından takip yerel bir yeniden düzenlenmesi gerçekleştirmek.
    Loacal yeniden düzenlenmesi: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals bilinen -nt 10 -CancerBam-ı normalBam
    java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals bilinen aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam
    temel kalite puanı ayarlamayı: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kozmik - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ben bam -o grp java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T kavanoz PrintReads-ben bam - BQSR CTP -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
  6. (tek nükleotid varyant) SNV ve INDEL (küçük eklemelerin veya silmelerin) arama için düşük frekans mutasyonlar doğruluğunu daha da GSR (iyi destek okur) tarafından her ikisi ile doğrulanır ileriye ve geriye doğru strand çiftleri ve filtrasyon kontrol grubu (germline mutasyonlar) ve temel veritabanı aracılığıyla okuyun.
    realDcaller(own)
    python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30
  7. KNV (kopya numarası varyasyon) çağrıları yapmak için bir denetim olarak temel örnekleri kullanır.
    NCcnv(own)
    python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion KNV--normgt normalBam tumgt--cancerBam--repdb repeatMarsk
  8. klipler ve SV (yapısal farklılıklar) aramak için uyumsuz çift okuma eşlenmemiş, Realigned.
    NCsv(own)
    python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transkript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ER-Seq içinde kullanılan zenginleştirilmiş hedef bölgeleri tablo 1' de gösterilen 1021 kb probları hangi kapakları 12 ortak tümörler gen mutasyonlarının % 95'den fazla. Bu sondalar çeşitli kanser hastalarının çoğunluğu için geçerli bu işlem sağlar. Ayrıca, bizim benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı ve temel veritabanı tarama nadir mutasyonlar kesin olarak tespit etmek mümkün kılar.

GDNA ve perif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CtDNA analizleri hala değil rutin klinik uygulamada uygulamadır ancak tümör DNA (ctDNA) dolaşan varlığını daha 30 yıl önce keşfedilmiştir. İlgi ctDNA yöntemleri pratik uygulama geliştirme teknolojileri ctDNA algılama ve çözümleme ile artmıştır. Tümör ctDNA ile izleme mikroskopik rezidüel hastalığı, tedavisi ve tümör moleküler profilleri altında arka plan tümör gelişimi ve intratumoral heterojenlik13Yanıt değerlendirilmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sunuyor, 14<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Geneplus – Beijing Enstitüsü tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit KitiQiagen55114cfDNA için Periferik Kandan DNA Ekstraksiyonu
QIAamp DNA Kan Mini KitiQiagen51105Periferik Kandan DNA Ekstraksiyonu
InvitrogenQ32854cfDNA konsantrasyonunu ölçün
Quant-iT dsDNA BR Test KitiInvitrogenQ32853Ölçümü kütüphane konsantrasyonu
Agilent DNA 1000 ReaktifleriAgilent5067-1504cfDNA ve kütüphane parçalarını ölçün
NEBE7645LKütüphane Hazırlığıiçin NEBNext UltraII DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti
Agencourt SPRIselect ReaktifiBeckmanB23317DNA fragmanı tarama ve saflaştırma
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100MLSigma93283dağılma
xGen Kilitleme ProblarıIDTve mdash; —xGen Özel Probu
İnsan Cot-1 DNALife15279-011Hedeflenen DNA yakalama
Dynabeads M-270 StreptavidinLife65305Hedefli DNA yakalama
xGen Kilitleme ReaktifleriIDT1072281Hedefli DNA yakalama
KAPA HiFi HotStart ReadyMixKAPAKK2602yakalama sonrası PCR zenginleştirme kitaplıkları
KAPA Kütüphane Miktar Belirleme KitiKAPAKK4602Kitaplık konsantrasyonunu ölçün
SonrakiSeq 500 Yüksek Çıkış Kiti v2 ((150 döngü)illuminaFC-404-2002Dizi
Santrifüjü5810eppendorf5810
Nanodrop8000Thermo Scientific8000gDNA konsantrasyonunu ölçün
Qubit 2.0InvitrogenQuantify
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilent
ThermoMixer Ceppendorfİnkübasyon
16 tüplü DynaMagTM-2 Mıknatıs Ömrü12321D
Konsantratör artıeppendorf
PCRABsimplyamp
QPCRAB7500Dx
NextSeq 500illumina
gDNA Quant-iT dsDNA HS Test Kiti için Illumina

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
  4. Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
  5. Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
  6. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
  7. Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
  8. Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
  9. Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
  10. Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
  11. Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
  12. Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
  13. Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
  14. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
  15. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  16. Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
  17. Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  18. Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
  19. Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
  20. Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
  21. Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
  22. Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  23. Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dola an T m r DNA sNadir Mutasyon TespitiER Seq Y ntemicfDNA zolasyonuHedeflenmi DNA YakalamaK t phane AmplifikasyonuVeri Analiz AkProb Tasar mK t phane Olu turma

İlgili makaleler