Yöntem makalesi

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

13.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

31 Ağustos 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Özet

Bu iletişim kuralı kimliği için enfekte hücreleri DNA'dan (HSV-1) ilişkili herpes simplex virüsü tip 1 yalıtmak için viral ve hücresel proteinler tarafından kütle spektrometresi hedefidir. Her ne kadar viral genom ile etkileşim proteinler enfeksiyon sonucu belirlemede önemli rol oynarlar, viral genom ilişkili proteinler kapsamlı bir analiz daha önce mümkün değildi. Burada biz HSV-1 genleri enfekte hücreleri doğrudan arıtma sağlayan bir yöntem göstermek. Viral DNA çoğaltılıyor seçerek bir ALKİN fonksiyonel grup içeren değiştirilmiş nükleotit ile etiketlenir. Etiketli DNA sonra özellikle ve geri dönüşümsüz tagged biotin azid bir bakır (I) ile kovalent eki ile-katalize azid ALKİN reaksiyon cycloaddition ya da tıklayın. Biotin öğesini DNA streptavidin kaplı boncuk saflaştırılmış ve ilişkili protein eluted ve kütle spektrometresi tarafından tanımlanan. Bu yöntem seçici hedefleme ve yalıtım HSV-1 çoğaltma çatal veya karmaşık biyolojik ortamlardan bütün genleri etkinleştirir. Ayrıca, bu yaklaşım adaptasyon herpesviral enfeksiyon, çeşitli yönlerinin yanı sıra diğer DNA virüsleri genleri incelenmesi incelenmesi için izin verir.

Giriş

Virüs temel işlevlerini gerçekleştirecek ve bu nedenle enfeksiyon viral gen ekspresyonu, çoğaltma, tamir, Rekombinasyon ve ulaşım dahil olmak üzere önemli yönlerini kolaylaştırmak için ana bilgisayar etkenlere bağlı için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu ana faktörler faaliyetleri genellikle virally kodlanmış proteinler tarafından artar. Ayrıca, virüs algılama ve girişim tarafından hücresel yanıt için viral enfeksiyon kaçınmak gerekir. Bu nedenle, virüs ana etkileşimler enfeksiyon sonucu dikte. Büyük önem nasıl virüs viral işlemleri kolaylaştırmak için hücresel makine adapte hücresel ortamı alter anlaşılmasıdır. Özel ilgi hangi faktörler ve süreçleri viral genom bulaşıcı döngüsü boyunca hareket tespitidir.

Herpes simplex virüsü tip 1 (HSV-1) bir çift DNA virüs bulaşan insan nüfusunun önemli bir kısmı mahsur olduğunu. Enfeksiyonun ilk bir saat içinde nerede viral DNA (vDNA) çoğaltma1ile koordineli olarak viral gen ekspresyonu sıralı bir çağlayan ensues çekirdeği, viral genom girer. Çekirdek, genleri tabi epigenetik düzenleme, onarım ve rekombinasyon geçmesi ve öyle ki ilk döl virions 6 saat içinde üretilen capsids paketlenir. Viral genom ilişkili proteinler enfeksiyon seyri boyunca kapsamlı değerlendirme viral genom hareket ve hangi viral ve hücresel faktörler görmemizi sağlayacak süreçleri moleküler ayrıntılarını araştırmak için zemin enfeksiyon çeşitli aşamalarında yer alırlar.

Benzeşme arıtma ilişkili hücresel proteinler2,3,4,5 analizi için viral proteinlerin ana faktörler viral enfeksiyon katılan incelenmesi için önceki yöntemleri içerir , 6 , 7 , 8 , 9. bu deneyleri ana bilgisayar antiviral yanıt yanı sıra viral Kromatin değişiklik, gen ekspresyonu, enstrümantal hücresel faktörler katılan tanımlanması için edilmiş ve DNA tamir. Ancak, vDNA ilişkilendirmesiyle etkileşimleri bağlıdır ve proteomik yalnızca belirli bir viral faktör bir fonksiyonu olarak oluşan etkileşimleri içgörü sağlamak olup olmadığını tespit etmek zordur. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) nerede belirli viral ve hücresel proteinler viral genom10,11,12,13,14 ' e bağlamak tanımlamak için kullanılan , 15 ve immunocytochemistry ile kombine floresan In situ hibridizasyon (balık) vDNA16,17,18ile, colocalize hücresel faktörler görselleştirme sağladı 19 , 20. bu deneyleri kayma ve temporal analiz için izin. Ancak, çok özel antikorlar, sınırlı hassasiyet ve virüs ana bilgisayar etkileşimleri önceki fikir ihtiyacını ihtiyacını sınırlamaları içerir. Bu nedenle bir yöntemi iPOND (yalıtım doğmakta olan DNA üzerinde proteinlerin)21 tarihinde göre geliştirilen ve seçmeli olarak etiket ve vDNA üzerinden arındırmak için aniPOND (hızlandırılmış yerli iPOND)22 viral genom tarafsız tanımlanması için hücreleri enfekte Kütle spektrometresi ile ilişkili proteinler. iPOND hücresel çoğaltma çatal dynamics soruşturma için vesile olmuştur.

Enfekte hücreleri üzerinden viral genom seçici arıtma için vDNA çoğaltılıyor modifiye ethynyl nükleozitler, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) veya 5-ethynyl-2´-kovalent tarafından takip deoxycytidine (EdC) (Resim 1), taşır konjugasyon için biotin azid viral genom ve ilişkili proteinler streptavidin kaplı boncuk (şekil 2B) üzerinde tek adım arıtma kolaylaştırmak için kimya'ı tıklatın. Önemlisi, enfeksiyonlar hücresel DNA ikileşmesi belirli vDNA etiketleme etkinleştirmek için nişanlı değil sabit hücrelerde, devam etmektedir. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu hücre döngüsü tutuklama nedenleri ve hücresel DNA çoğaltma23,24engeller. Virüs önce gelen viral genom (şekil 1A) ile ilişkili protein analizi için enfeksiyon prelabeled ya da yeni sentezlenmiş vDNA (şekil 1B) ile ilişkili protein analizi için DNA ikileşmesi sırasında etiketli 25. Ayrıca, nabız chase analiz doğa viral çoğaltma çatal (şekil 1 c)26ile ilişkili proteinlerin araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, vDNA ethynyl-modified kovalent protein dinamiği (şekil 2A ve şekil 3) kayma soruşturma için bir fluorophore için Birleşik. Görüntüleme vDNA doğrudan görselleştirme için sağlar ve vDNA-protein etkileşimleri doğrulama için ücretsiz bir yaklaşımdır ve viral genom enfeksiyon boyunca izlemek için adapte edilebilir. Biz bu yaklaşımlar daha da herpesviral enfeksiyon, gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme, dahil olmak üzere herhangi bir yönünü çalışmaya ve diğer DNA virüsleri çalışmaya değiştirilebiliyordu tahmin. Ayrıca, 5-ethynyl üridin ile etiketleme (AB) RNA viral genom analizi için izin verebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hücre kültürü, Viral enfeksiyon ve EdC etiketleme ( şekil 1)

Aşağıdaki protokol virüsler ile çalışma gerektirir. Kurumunuzun için bakınız ' s biyo-güvenlik protokollerini virüsler ve diğer biyolojik ajanlar güvenli taşıma ile ilgili. Bu protokolün Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından kabul edildi.

  1. Bir Konfluent 150 cm 2 doku kültürü şişesi MRC-5 hücre trypsinize ve hücreleri 100 mL DMEM artı % 10 içeren 600 cm 2 doku kültürü plakasına transfer FBS. Varlığında % 5 CO 2 3-4 gün confluency ve sabit faz ulaşmak için için 37 ° C'de kuluçkaya. Konfluent 600 cm 2 çanak ~ 7 x 10 7 hücreler içerir. Her koşul için 1 plaka ve her karşılık gelen negatif kontrol için 1 plaka hazırlayın.
    Not: Bu sadece vDNA etiketli ve sonraki adımlar saf emin olmak için hücresel DNA ikileşmesi etkisizleştirmek için durağan faz hücre ulaşmalıdır.
    Not: Her örnek ücretsiz bir negatif kontrol süresi noktası EdC ek olmadan ve aynı enfeksiyon koşulları kullanılarak hazırlanan etiketsiz gerektirir.
    Not: Bu deneme sürümü ölçekli A tandem hücresel DNA'sı karşılaştırılabilir hücre büyüme, enfeksiyon, koşullar, etiketleme EdC kullanarak görüntüleme tarafından etiketleme için test etmek ve Puan zaman yapılmalıdır (see Adım 2).
  2. 7 x 10 8 PFU HSV-1 7 ml seyreltik soğuk Tris-Buffered serum fizyolojik (TBS). Büyüme orta çıkarın ve 37 ° C'de saklayın Bulaştırmak için 7-mL sulandırılmış virüs MRC-5 hücreleri ve kaya oda sıcaklığında 1 h için ekleyin. Aşağıdaki adsorpsiyon, inoculum kaldırmak, 50 mL oda sıcaklığında TBS ile durulayın ve özgün büyüme orta yerine. Varlığında % 5 CO 2 37 ° C'de kuluçkaya. Bu adımı her deneysel durumu ve negatif kontrol yapılmalıdır.
    Not: Artan EdC etiketleme HSV-1 mutantlar arızalı için viral dUTPase (UL50 gen) ve/veya urasil glycosylase (UL2 gen) ifade kullanılarak elde edilebilir. HSV-1 dUTPase düşük substrat özgüllüğü vardır ve birkaç nükleozit analogları 25 , 27 aktivasyonu düşürebilir.
  3. Etiketi viral genom EdC ile. Gelen genleri (1.3.1.), genleri (1.3.2.) veya viral çoğaltma çatal (1.3.3.) çoğaltma etiketlemek için yönergeleri izleyin.
    Not: Tek adım 1.3.1, 1.3.2 veya 1.3.3 gelen genleri, çoğaltılmış genleri veya çoğaltma çatal sonraki adımlar sırasıyla analiz edilecek olup bağlı olarak yapılmalıdır.
    Not: EdU veya f-ara EdU EdC için yedek olabilir. Nükleozit analogları toksisite izlenmeli ve en aza indirgemek.
    1. Kullanım prelabeled adım 1.2 enfeksiyonunda yürütmek ve adım 2'ye devam etmek için hisse senetleri veya 3 4 h içinde yazı çoğaltılmamış vDNA ( şekil 1A) araştırmak için enfeksiyon (HPI).
      Not: yukarıda açıklanan protokol 25 kullanarak hisse senetleri prelabeled virüs hazırlayın. Virüs stokları herhangi bir kalıntı EdC kaldırmak için G-25 sütununu tarayarak geçti.
    2. Etiket kopyalayan vDNA 5-25 µM ekleyerek EdC için 2-4 h ( şekil 1B) enfekte hücreleri hücre kültür orta için. Eklemeden önce EdC seyreltik büyüme orta 1 mL.
      3. Viral çoğaltma çatal, vDNA çoğaltma başlangıcından sonra etiketlemek için
    3. (≥ 4 HPI), vDNA 5-25 µM ile çoğaltma darbe etiket EdC 5-20 dk için. Kovalamak için 3 x 25-100 µM 2´deoxycytidine içeren chase orta ile yıkayın (deoxyC) ve sonra chase orta bir ek 20-40 dakika ( şekil 1 c) huzurunda kuluçkaya.
      Not: Kullanmadan önce 37 ° C ve % 5 CO 2 darbe ve chase orta equilibrated.
      Not: darbe chase deneyler için bu hücreyi girmek ve onlar DNA çoğaltılıyor içine dahil edilebilir önce fosforile nükleozitler geçen süreyi dikkate almak önemlidir. Bu ampirik olarak belirlenmelidir.
      Not: darbe chase deneyler çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan deneysel koşullar altında viral çoğaltma oranını hesaplamak. Bu bir tek adım büyüme saat ders 26 sırasında viral genom kantitatif PCR tarafından belirlenebilir.
      Not: Viral genom görüntüleme için adım 2'ye geçin ve viral genom arıtma için adım 3'e devam.

2. EdC görüntüleme etiketli DNA ( şekil 2A)

Not: hücresel DNA deneyleri etiketli değildir doğrulamak için viral genom arıtma yöntemi ile tandem görüntüleme gerçekleştirmek yararlıdır. Görüntüleme etiketli vDNA doğası görselleştirmek için ve proteomik verileri doğrulamak için de kullanılabilir. Hücresel ve viral DNA desenleri boyama örnekleri şekil 3 ' te gösterilen.

  1. Enfeksiyonlar taşımak ve EdC adım 1 kullanarak dışında gösterildiği gibi etiketleme coverslips büyüme orta 1 mL içeren bir 12-iyi doku kültürü tabak koşullara küçülttüm.
  2. 1 mL % 3.7 hücrelerle düzeltme paraformaldehyde 1 x PBS RT., 15 dakika içinde Fiksasyon sonra durulama 2 x 1 mL % 3 BSA PBS ile hücreleri.
    Dikkat: Paraformaldehyde kalıcı ya da ciddi yaralanmalara neden olabilir. Güvenlik önlemleri izleyin.
    Not: Protokol burada durdu ve coverslips ikinci yıkamaya 4 ° c ilâ 3 gün saklanabilir için.
  3. Permeabilize 1 mL permeabilization arabellek içeren hücreleri [Tablo malzemeleri görmek] sallanan süre oda sıcaklığında 20 dk için.
  4. Durulama 1 mL % 3 BSA ve sonra oda sıcaklığında 30 dakika ile 1 mL % 3 BSA PBS içinde blok ile sallanan süre.
  5. Eklemek tıklayın tepki kokteyl 1 mL [Tablo malzemeleri görmek] kovalent Alexa Fluor 488 çekimlerine coverslips azid EdC için DNA etiketli. 30 dk için oda sıcaklığında sallanan süre kuluçkaya. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.
  6. Leke hücresel DNA ile sallanan süre bir 1:2,000 seyreltme Höchst içinde PBS, oda sıcaklığında 30 dk için 1 mL. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.
  7. Leke standartlarına göre birincil ve ikincil antikorlar ile dolaylı ayirt protokolleri 25.
    Not: Etiketli vDNA ICP8, ICP4 veya UL42 ile colocalizes ve hücresel etiketli DNA ile Höchst leke colocalizes.
  8. Dağ coverslips slayta ve görüntü bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri.
    Not: Birkaç hafta için 4 ° C'de slaytlar depolanabilir.

3. VDNA ve ilişkili proteinler arıtma

Not: Bu protokol çeşitli yönleri Leung ve ark. uyarlanmıştır 22
Not: tüm arabellekleri ve Kimyasalları kullanmadan önce buzda soğutulmuş ve tüm adımları buza aksi belirtilmedikçe yapılmalıdır.

  1. Hasat çekirdeği.
    Not: çekirdeklerin izolasyon önce formaldehit crosslink proteinler DNA için kullanılabilir. Daha sıkı yıkama koşulları daha sonra boncuk streptavidin kaplı üzerinde DNA arıtma sırasında kullanılabilir. CR içinSirbu vd. osslinking ve yıkama koşullara bakınız 21.
    1. 20 mL çekirdek ayıklama arabellek (NF'leri) ile büyüme orta eski yerine koymak ve 4 ° C'de ara sıra sallanan ile 20 dk için kuluçkaya. Hücre çekirdeği içinde mikroskop görünür olacak.
    2. Çekirdeği kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka scrape ve 50 mL konik tüp aktarmak. 2500 x g çekirdekleri cips, süpernatant atın için 4 ° c de 10 dakika santrifüj.
      Not: mavi boyama çekirdeği hücrelerden yalıtım doğrulamak için kullanılabilir Trypan.
    3. Yavaşça 10 ml PBS, 15 mL konik tüp transferi nükleer Pelet çıkarmak ve cips 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de 2500 x g, 10 dk centrifuging.
      Not: Çekirdeklerin donmuş olabilir ve protokol bu noktada duraklatıldı. Bunu yapmak için yavaşça nükleer Pelet 500 resuspend buz gibi µL tampon ve bir etanol/kuru buz banyosu tüpte kuluçkaya. Çekirdeği-80 ° C'de dondurulmuş mağaza Kullanmadan, çekirdek, oda sıcaklığında erimek, hızlı bir şekilde aktarmak buz, 10 mL PBS, yavaşça karıştırın, 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından cips için rock eklemek için ve tamamen PBS kaldırmak. Çekirdeği dondurma düşük verim neden olabilir.
  2. Kovalent eşlenik biotin azid EdC için etiketli vDNA.
    1. 10 mL tıklayın tepki nükleer Pelet mix [Tablo malzemeleri görmek] yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 5 kere ile 10 mL damlalıklı resuspend.
      Not: Bu tıklayın tepki karışımda bulunan reaktifler belirtilen sıraya göre eklenir önemlidir.
    2. 4 ° C'de 1 h için döndürme Döndürme sırasında hazırlamak ve arabellekleri B1, B2 ve B3 [bkz: Malzemeler tablo] chill.
    3. 4 ° C. tamamen Kaldır'de 2500 x g, 10 dk centrifuging tarafından Pelet çekirdeği tepki karıştır'ı tıklatın ve yavaşça 10 mL PBS resuspending ve 4 de 2500 x g, 10 dk centrifuging Pelet yıkama ° C.
    4. Yavaşça 1 ml PBS nükleer Pelet ve transfer büyük pipet ucu kullanarak 1.5 mL microfuge Tube resuspend. Cips çekirdekler için 2.500 x 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de g ve sıvı azot flaş donma, 10 dk centrifuging.
      Not: Bu noktada protokol duraklatılmış ve donmuş çekirdeği saklanabilir sonraki lizis-80 ° C. donma çözülme yardımcı olur, dolayısıyla çekirdeklerin ne zaman adım 3.3 için aynı gün bile geçmeden dondurulmuş flaş önerilir.
  3. Çekirdeği lyse ve DNA parçası.
    1. Buz çekirdeği çözülme ve 500 µL arabellek B1 yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. 45 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
    2. Sonicate örnekleri 6 kere için 30 s her % 40 genlik 3 mm microtip sonda kullanarak. Buz 30 örnekleri yer s bakliyat arasında. Sonication sonra örnekleri görünmesi gereken açık, değil bulutlu.
      Not: Sonication koşulları tek tek sonicators için optimize edilmelidir. Sonication koşulları optimize etmek ayrıntılı yönergeler için Leung ve ark. için başvurun 22.
    3. cips hücre artıkları 14.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de centrifuging tarafından Pelet boyutunu önemli ölçüde azaltmak gerekir. Süpernatant 100 µM hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve aracılığıyla akış korumak.
    4. Ekle 500 µL arabellek B2 süzülmüş süpernatant. 900 µL Bu örnek için 3.4.2. adımda kullanılan.
    5. Bir aliquot DNA izolasyonu (50 µL veya 1/20 birim) için her durumun alıp 50 µL 2 x SDS-bikarbonat çözüm ekleyin [Tablo malzemeleri görmek]. DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.
    6. Her koşul giriş protein (50 µL veya 1/20 birim) için bir aliquot almak ve 50 µL 2 x Laemmli örnek arabellek eklemek, sıvı nitrojen içinde dondurmak ve depolamak-80 ° C. kullanımda adım 3.5.6.
  4. Bağlama biotinylated DNA streptavidin kaplı boncuklar.
    1. 1.5 mL microfuge tüp boncuk Bulamaç 300 µL aktarma tarafından hazırlamak Streptavidin T1 manyetik boncuklar. Boncuk örnek başına bir tüp hazırlayın. Yıkama boncuk 3 x ile 1 mL arabellek B2 yanında vortexing resuspend, boncuk ayırmak için bir mıknatıs uygulamak ve yıkama arabellek aspirating.
      Not: en yüksek düzeyde verim ve minimal arka plan bağlayıcı koşulları sonuç bağlama en iyi duruma getirilmiş. Deneysel Streptavidin T1 manyetik boncuklar özel boncuk yanı sıra diğer Streptavidin boncuk ve daha az arka plan bağlayıcı Streptavidin C1 boncuk daha önemli ölçüde daha fazla bir bağlama kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir ( şekil 4A ).
    2. Ekleyin 900 µL örnek adım 3.3.4. yıkanmış boncuk ve Döndür'ün gece saat 4'te ° C.
      Not: örnek onlara eklendikten sonra girdap boncuk etmeyin.
      Not: önemli miktarda DNA veya protein etiketlenmemiş negatif kontrol izole Eğer bu adım bir gecede 4 h için arka plan bağlayıcı azaltmak için azaltılabilir.
  5. Yıkama boncuk ve vDNA ve ilişkili proteinler elute.
    Not: Bu filtre ipuçları için kalan adımları kullanmak için tavsiye edilir.
    1. Yer örnekleri süpernatant Kaldır, manyetik microfuge tüp raf içine yavaşça 1 ml arabellek B2, döndürme 4 ° C'de 5 dakika süreyle resuspend.
    2. Tekrarlama adım 3.5.1 üç kez.
    3. Örnekleri bir manyetik microfuge tüp raf içine yerleştirin, süpernatant kaldırmak, yavaşça 1 mL arabellek B3, resuspend ve 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürmek
    4. İlişkili DNA izolasyonu için yeni bir tüp transfer 100 µL boncuk karışıma (1/10 inci cilt). Bu tüp mıknatıs için geçerlidir, süpernatant kaldırmak, SDS-bikarbonat çözüm x 100 µL 1 boncuk resuspend ve DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.
    5. Kalan 900 µL boncuk karışımı adım 3.5.3 içeren tüp geçerlidir. mıknatıs için süpernatant kaldırmak ve protein ve DNA-protein kompleksleri elute için Laemmli örnek arabellek x 50 µL 2 boncuk resuspend.
    6. Kaynatın örnekleri 15 95 ° c min, girdap, hızlı spin microfuge ve mıknatıs uygulanır. Yeni tüp, flaş donma ve-80 mağazasında eluate transfer ° C.
      Not: kullanım kap kilitleri tüpler pop sağlamak için süre kaynatma açın.
      Not: Protokol bu noktada durdu ve örnekleri için birkaç hafta-80 ° C'de saklanabilir.
    7. Analiz protein örnekleri Coomassie mavi boyama, western Blot ya da Standart prosedürler 25 tarafından kütle spektrometresi. Temsilcisi-den sonuçlanmak göstermek şekil 4 ve şekil 5.
      Not: protein verim için kütle spektrometresi yeterli olup olmadığını belirlemek için her örneğinin 7.5 µL analiz için Coomassie boyama mavi tarafından kullanılır ve Batı temsilcisi viral genom kurutma için 7,5 µL protein (ICP4, ICP8 veya UL42) ilişkili. Lysates adım 3.3.6 aynı hacmi. yanında giriş protein düzeyleri için denetime çalıştırılır. Kalan örnek (35 µL) sonra kitle tarafından analiz 25 daha önce açıklandığı gibi spektrometresi.
  6. DNA izolasyon
    1. adımları 3.3.5 örneklerinden kuluçkaya. ve 3.5.4. 65 ° c 4-16 h. çıkarmak için manyetik boncuklar, gerekirse örnek.
    2. Ayıklamak örnekleri ile 150 µL fenol: kloroform: izoamil alkol (PCI) ve sulu faz için yeni bir tüp transfer.
    3. 100 µL ile kalan PCI ayıklamak Tris-EDTA (TE) ve sulu faz için yeni bir tüp ekleyin.
    4. Ayıklamak örnekleri ile 200 µL kloroform: izoamil alkol (24:1).
    5. Arındırmak PCR arıtma Kit üreticiye göre kullanarak sulu faz ' s protokolü.
      Not: pH göstergesi arabellek PB ile örnek için eklendiğinde mor dönecek. 10 ve # eklemek181; L 3M NaOAc pH 5,0 örnek pH düşmesine.
    6. Bir yer kullanarak belirlemek DNA toplama.
      Not: Bu protokol genellikle 100-400 ng boncuk bağlı DNA verir. Hiçbir DNA negatif kontrol içinde EdC değil eklendi adım 1. 3'eluate tespit edilmelidir.
    7. DNA'sı düşük bir DNA bağlamasında depolanan tüp 4 veya - 20 ° C ve gerçek zamanlı PCR veya yüksek işlem hacmi sıralama analizi için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tıklayın kimya kullanım hücrelerden DNA arıtma için iPOND yöntemi21tarafından ilk başarılı oldu. İPOND hücresel çoğaltma çatal ilişkili proteinlerin tanımlanması için arındırmak için amaçtır. Bu teknik özellikle enfeksiyon sırasında vDNA protein etkileşimleri çalışmaya adapte olması. EdC (şekil 1), ile viral genom eşitlenmiş enfeksiyonlar ile kombine etiketlemek için yaklaşım manipülasyon seçici yalıtım ve vDNA ayrı nüfus incelenmesi i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralı, değilse dikkatle takip önemli ölçüde azaltılmış protein verim veya kirlenme hücresel DNA ile sonuçlanabilir birden çok adım içerir. Bu sabit hücre hücresel DNA etiketli saf ve değil emin olmak için tüm deneyler için kullanılır önemlidir. HSV-1 genomu sentez için hücresel DNA polimeraz kullanmaz çünkü bu hücresel DNA polimerazlar protein örnek yokluğunda tarafından onaylanabilir. EdC etiketleme ve çekirdekleri adımları hasat sırasında örnekleri her eşit işlenir emin olmak için sendeleyerek. Arıtma adım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu yazının hazırlanmasında yardım için Hannah Fox anıyoruz. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01AI030612 verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MRC-5 hücreleriATCCCCL-171
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco12800-08210 FBS, 2 mM L-glutamin, 12 mM ile ikame edilmiş; (şişelerde büyüme için) veya 30 mM (bulaşıklarda büyüme için) sodyum-bikarbina
600 cm2 doku kültürü kabıThermo Fisher Scientific166508
Tris Tamponlu Salin (TBS), pH 7.4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Trisin
HSV-1 stoğu1x109 PFU/mL'den büyük titrelere sahip stoklar en iyi
sonucu verirSephadex G-25  sütun (PD-10 Tuzdan Arındırma Sütunu)GE Healthcare17085101
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5&akut;-Etinil-2&akut;-deoksisitidin (EdC)Sigma-AldrichT51130740 mM stok, alikot hazırlamak ve -20 °C'de saklamak için DMSO'da çözün; C 
2 akut; - deoksisitidin (deoksiC)Sigma-AldrichD389740 mM stok hazırlamak için suda çözün, alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın; C 
Nükleer Ekstraksiyon Tamponu (NEB)Taze hazırlayın (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sükroz, %0.5 Igepal)
Hücre sıyırıcıBellco cam7731-22000Kullanmadan önce otoklav
Tripan mavisi çözeltisiSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7.2 (10x)1,37 mM NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (kullanmadan önce steril suda 1x'e seyreltin)
Bakır (II) sülfat pentahidrat (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489100 mM stok hazırlayın ve 4 °C'de saklayın; 1 aya kadar
C (+) Sodyum L-askorbatSigma-AldrichA4034Taze olarak 100 mM stok hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde saklayın
Biotin azideInvitrogenB10184DMSO, aliquot'ta 10 mM stok hazırlayın ve -20 °C'de saklayın; 1 yıla kadar C 
Reaksiyon Karışımı'naBelirtilen sırayla reaktifler ekleyerek kullanmadan hemen önce hazırlayın (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25 mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodyum askorbat)   
Komple Proteaz İnhibitörü KokteyliRoche1169749800150x stok hazırlamak için 1 mL suda çözün, 4 ° C'de saklayabilirsiniz; 1 haftaya kadar C veya doğrudan 50 mL tampona 1 hap ekleyin
Donma tamponuTaze hazırlayın (7 mL %100 gliserol, 3 mL NEB, 200 & mu; L 50x proteaz inhibitörü)
Tampon B1Taze hazırlayın (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %1 Igepal, 1x proteaz inhibitörü)
Tampon B2Taze hazırlayın (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %0,5 Igepal, 1x proteaz inhibitörü)
Tampon B3Taze hazırlayın (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x proteaz inhibitörü)
3 mm mikro uçlu prob ile donatılmış Vibra Cell Ultra Sonic ProcesserSonicsVCX 130
Hücre süzgeciFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Yaşam Teknolojileri65601
DynaMag-2 MıknatıslıYaşam Teknolojileri12321D
Mini Tüp DöndürücüFisher Scientific260750F
2x Laemmli numune tamponu400 mg SDS, 2 mL %100 gliserol, 1.25 mL 1 M Tris (pH 6.8) ve 10 mg bromofenol mavisini 8 mL suda karıştırın. 4 'de saklayın; ° 6 aya kadar C. Kullanmadan önce, 200 mM'lik bir son konsantrasyona 1 M DTT ekleyin.
1,5 mL tüp için kapak kilitleriFisher ScientificNC9679153
Standart batı lekeleme reaktifleri
NOVEX Kolloidal Mavi Boyama KitiInvitrogenLC6025
12 oyuklu doku kültürü kabıCorning3513
LamellerFisher Scientific12-545-100Kullanmadan
önce otoklavMikroskop slaytlarıFisher Scientific12-552-5
%16 paraformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710Kullanmadan önce 1x PBS'de %3,7'ye seyreltin
Sığır serum albümini (BSA)Fisher ScientificBP16051x PBS'de %3 hazırlayın
Geçirgenlik tamponu (%0,5 Triton-X 100)Sigma-AldrichT87871x PBS'de
%0,5 Triton-X 100 hazırlayınClick reaksiyon kokteyli - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme KitiMoleküler ProblarC10337Üreticinin protokolüne göre hazırlayın
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Suda 10 mg / mL hazırlayın, 4 ° C'de saklanabilir; 1 yıla kadar C
Fare anti-ICP8 birincil antikoruAbcamab201941x PBS'de 1:200 seyreltme kullanın
Fare anti-UL42 birincil antikoru (2H4)Abcamab19311antikorda 1:200 seyreltme kullanın
Yaşam Teknolojileria110051x PBS Bağışıklık montajlı Thermo Fisher Scientific 9990402'de 1:500 seyreltme kullanın
2x SDS-bikarbonat çözeltisi%2 SDS, 200 mM NaHCO3
Fenol: kloroform: izoamil alkolKullanmadan en az 1 gün önce 25:24:1 karıştırın, 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C
kloroform: izoamil alkolKullanmadan en az 1 gün önce 24: 1 karıştırın, karanlıkta oda sıcaklığında
saklayın 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 mM Tris, 10 mM EDTA (kullanmadan önce 1x'e seyreltin)
Qiaquick PCR saflaştırma kitiQiagen28104
3 M sodyum asetat pH 5.2
Kübit 2.0 FlorometreİnvitrojenQ32866
Qubit dsDNA HS Test KitiInvitrogenQ32851
Qubit tahlil tüpleriInvitrogenQ32856
Görüntüleme yazılımı
1.5 mL tüpler
15 ve 50 mL tüpler
Hücre kültür inkübatörü
Biyogüvenlik kabini
Isı blokları65 ° C; C ve 95 & derece; Ç
% tıklayın 1x PBS Keçi anti-fare 594 konjuge ikincil ile donatılmış floresan mikroskobuiçin mikrosantrifüjiçin masa üstü santrifüj

Kaynaklar

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Viral DNA Safla t rmaHerpes Simplex Vir sKlik KimyasBiyotinlenmi DNAStreptavidin BoncuklarK tle SpektrometrisiDNA Replikasyonuekirdek zolasyonuSonikasyonProtein Analizi

İlgili makaleler