Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Preniltransferazlar, izopentenil difosfat (IPP) kullanarak alikolit difosfatın zincir uzamasını, çoklu yoğunlaşma reaksiyonları ^{1 , 2} yoluyla katalize eden bir grup enzimdir. Z tipi enzimler, yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağlarının oluşumunu katalizlerken, E-tipi enzimler, trans çift ​​bağ oluşumunu katalize eder ³ . cis--Prenyltransferases (sis -PT, Z-tipi enzimler) klasik kısa zincirli _(Cı-15), orta-zincirli _(Cı-50-55) içine ürün zinciri uzunluğuna göre sınıflandırılır ve uzun zincirli _(Cı-70-120 ) ⁴ . DHPDS (dehidrodirililik fosfat sentaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını, izopentenil difosfat (IPP) ¹ ile çoklu kondansasyonlar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT'dir, ^{5 , 6} . Bu, N-bağlantılı protein glikosilasyonuna ¹ dahil olan glikosil taşıyıcı molekül olan dolichylpyrophosphate için bir öncül olarak görev yapan bir C _55-100 poliprenil difosfat olan dehidrodoliril difosfatın oluşumuyla sonuçlanır. Ashkenazi Yahudileri arasında, DHDDS'deki bir missense muhafazakar olmayan mutasyon (K42E) otozomal resesif retinitis pigmentosa ^{7 , 8 ile} sonuçlanır. Dolayısıyla, mevcut protokol, mekanik çalışmalar için uygun saflaştırılmış DHDDS'yi elde etmek için geliştirildi.

Escherichia coli , rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ve uygun maliyetli konak olarak düşünülür ve bu nedenle de en sık kullanılan konakçıdır. Bununla birlikte, bir heterolog olarak E. coli'deki proteinleri aşırı ifade etmeye çalışırsa, proteine ​​spesifik hususlar yapılmalıdır. Düzgün şekilde katlanan aktiviteyi elde etmekE. rekombinant proteinlerin E. coli'den ayrılması, farklı proteinlerin farklı özelliklerinden dolayı basit bir konu değildir. Bu engellerin üstesinden gelmek için sayısız yaklaşım geliştirildi. Burada, protein füzyonunun kullanımı, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, E. coli'de işlevsel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. Unutmayın, protein füzyonu olmaksızın maya cis- PT'yi aşırı ifade etme girişiminde bulunmak, deterjan ¹² varlığında bile tam çözünmezlik nedeniyle başarısız olmuştur. Açıklanan protokol, basit, uygun maliyetli, zaman kazandıran ve mekanik çalışmalara uygun DHDDS preparatlarını elde etmeyi sağlar. Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisi göz önüne alındığında, bu protokolün diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz.

1. E. coli 'de aşırı salgılamasının için sis -PT klonlanması

1. 109aa tioredoksin (TRX) proteini ¹⁷ ile kaynaştırılmış protein dizilerinin klonlanması ve yüksek seviyede ekspresyonu için tasarlanmış pET-32b ifade vektörünü ve tam boy cis -PT'nin E. coli kodon-optimize edilmiş ¹⁸ kodlama dizisini elde edin.
2. TEV-proteaz, bir kısa esnek bir bağlayıcı ile ve ardından (tütün etch virüsü proteaz) parçalama bölgesine ( "/" bölünme noktasını gösterir ENLYFQ / G) ⁹ için özen cis akış yukarı (SGSGSG, yarılma sitesi erişilebilirlik arttırmak için) -PT dizisi (Şekil 1 A). Ayrıca, klonlama için uygun 5 've 3' kısıtlama bölgeleri ekleyin.
3. Standart ligasyon teknikleri kullanılarak sentezlenmiş DNA yapısını pET-32b vektörü içine kopyalayın ¹⁰ .

2. Overexpreİnsan DHDDS'sinin E. coli'de bulunması

1. E. coli T7'i, yetkili hücreleri, üreticinin talimatlarına göre TRX-füzyon DHDDS yapısı ile ifade edin.
2. Dönüştürülen hücreleri, ampisilin seçici koşullar altında (200 mg / L) LB-agar üzerindeki imalatçının talimatlarına göre plakaya yerleştirin.
3. Seçilen kolonileri, 100 mg / L ampisilin ile 250 ml'lik şişeler başlangıç ​​kültürlerinde 100 mL'lik LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 200 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
4. Kültürün 80 mL'si, her biri, 100 mg / L NaCl ile 1.5 L 2x YT ortamı (16 g / L tripton, 10 g / L maya özütü, 5 g / L NaCl) içeren iki 5 L'lik şişeye (40 mL / şişe) L ampisilin.
5. Kültürü OD _{600 nm} = 0.5'e ulaşana kadar 180 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
6. Sıcaklığı 16 ° C'ye indirin ve hücreleri, 0.5 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ilave ederek indükleyin. aleyhteProtein dozu için 16-20 saat boyunca aynı koşullar altında inkübe edildi.
7. Hücreleri santrifüjle (10 dakika için 10,000 x g ) hasat edin.
   Not: Protokol burada duraklatılabilir; Hücreler pelet arındırılıncaya kadar -80 ° C'de tutulmalıdır.

3. İnsan DHDDS'sinin Arıtımı

1. Hücreleri tampon A'ya (25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol), 1 μg / mL DNase I ve bir proteaz inhibitörü karışımı içine tekrar süspansiyon haline getirin.
2. Bir cam-Teflon homojenleştirici kullanarak hücreleri homojen hale getirin.
3. Hücreleri 12.000 - 15.000 psi'de bir mikrofluidizer veya eşdeğeri kullanarak parçalayın ¹¹ .
4. 4 dakika 40 dakika, 40,000 xg'de hücre lizatı santrifüj ° C. Çözülebilir fraksiyonu içeren süpernatanı alın.
5. Süpernatanı, 5 - 10 mL kobalt hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (Co2 ⁺ -IMAC) ¹² sütun üzerine 10Bunu takiben, spesifik olmayan protein bağlanmayı azaltmak için tampon A ve 10 mM imidazol ile iyice yıkanır.
6. Aşırı preslenmiş proteinleri 250 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon A ile elute edin.
7. İmidazolü, tampon A ile dengelenmiş 53 mL'lik bir hazırlayıcı tuz giderme sütunu kullanarak çıkarın.
8. 6xHis etiketli TRX füzyon proteinini gece boyunca 4 ° C'de çıkarmak için elüe edilen proteinlere 6xHis etiketli TEV proteaz (50 mg protein başına 1 mg TEV proteaz) ekleyin.
9. Bölünmüş 6x His-etiketli TRX füzyon protein ve TEV proteaz kaldırmak için, 5 mM imidazol ile takviye tampon A ile dengelenmiş bir Co ^{2 +} -IMAC sütun üzerine parçalanmış protein yükleyin.
10. Akışı toplayın ve 30 kDa'lık bir moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi kullanarak 3-4 mL'ye konsantre edin.
11. Konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir süperdeks-200 ebat dışlama kromatografi kolonuna yükleyin. Protein, dimer (~ 76 kDa) olarak akar. Elution profilini bir sütun kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin.
12. SDS-PAGE kullanarak hazırlığın saflığını değerlendirin.
13. İndirgenmiş deneyler için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve sıvı nitrojende saflaştırılmış, konsantre proteinlerin küçük miktarlarını dondurun ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Analitik Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC)

1. Proteinin donma-çözme döngülerine dayanma kabiliyetini sağlamak için donmuş proteinlerin bir kısmını çözdürün ve çözünmeyen agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın.
2. Proteinleri, ultra-performanslı bir sıvı kromatografi sistemi ¹³ kullanarak 25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.02 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol ile önceden dengelenmiş bir süper-dex-200 analitik kolona yükleyin ^{, 14} .
3. Triptofan tohumu izleyinProteinlerin elüsyonlu elüsyon profili tespit etmek için scence (λ _ex = 280 nm, λ _em = 350 nm). Moleküler ağırlık değerlendirmesi için geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun - bu eğriler SEC sütun üreticileri aracılığıyla edinilebilir.

5. Enzim Kinetikleri - Zamana Bağlı Faaliyet ^{15 , 16 , 17}

1. 30 ° C - saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, 22 ° C'de 0.5 mM _MgCl2 ile tampon A içinde reaksiyonu başlatmak için 10 uM FPP ve 50 uM ^14C-IPP ile saflaştırılmış DHDDS 5 uM karıştırın.
   Not: Tam reaksiyon koşulları, DHDDS'den farklı cis- PT'lerin preparatlarına göre değişiklik gösterebilir. Üstelik DHDDS'nin aktivitesi ayrıca sıcaklığa ve [Mg ²⁺ ] bağlıdır.
   Dikkat: ¹⁴ C-IPP radyoaktiftir ve yerel radyasyon güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmalıdır. 15 μL tampon A ilave edilmiş 20 mM EDTA (10 mM EDTA nihai konsantrasyona) eklenmesiyle reaksiyonun derhal söndürülmesinin ardından 0, 2, 4 ve 6 saat reaksiyondan 15 μL numuneler çıkarın.
2. Ekle 1 ml _H2 iyice reaksiyon ürünleri elde etmek için 1-butanol ve vorteks O-doymuş.
   Not: Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunacak şekilde tutulabilir.
3. Numunelere sintilasyon kokteyli ilave edin ve bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden reaksiyon karışımından 15 uL'lik radyoaktivite ile birlikte ¹⁴ C'yi kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicel hale getirin.
4. Her zaman noktasından 0 saatlik örnekleri kullanarak ölçülen arka plan okumalarını çıkarın ve kullanılan ¹⁴ C-IPP yüzdesini hesaplayın.
5. Toplam ¹⁴ C-IPP katılma oranını her bir zaman noktasında hesaplayın, toplam ¹⁴ 14 C-IPP katılımının zamanla artması beklenmektedir.

Burada kullanılan yapıya genel bir bakış ve saflaştırma süreci Şekil 1'de gösterilmektedir. Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin kademeli olarak arıtılmasını gösterir ve sonuç olarak yüksek saflıkta bir ürün elde edilir. Şekil 3 , saflaştırılmış enzimin analitik SEC sonuçlarını göstermektedir, bu protein sadece bir homodimer olarak gözlemlenmektedir. Şekil 4 , temsili bir zamana bağlı aktivite tayini göstermektedir. 14 C-IPP birleşmesi, saflaştırılmış enzimin işlevsel olduğunu doğrulayarak 6 saat boyunca açık şekilde yükselir.

Şekil 1: İnsan DHDDS Klonlama ve Saflaştırma . ( B ) Burada tarif edilen insan DHDDS saflaştırma protokolünün taslağı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: İnsan DHDDS'sinin Saflaştırılması . İnsan DHDDS afiniteli saflaştırma adımlarının SDS-PAGE analizi. Şerit 1, molekül ağırlığı markeri (kDa); Şerit 2, ham özüt; Şerit 3, Co 2+ -IMAC akış geçidi. Arrow, TRX-DHDDS füzyon proteinini belirtir; Şerit 4, Co2 + -IMAC eluatı; Şerit 5, gece boyunca inkübasyonun ardından protein-TEV proteaz karışımı; Şerit 6, Co2 + -IMAC, TEV parçalanmasını takiben akar; Şerit 7, TEV bölünmesinin ardından Co2 + -IMAC eluat; Şerit 8, saflaştırılmış insan DHDDS'siBoyutlu eksklüzyon kromatografisini takiben). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Saflaştırılmış İnsan DHDDS'sinin Analitik SEC'si. Triptofan flüoresan, protokolde tarif edildiği gibi izlendi. Bu kolonun kalibrasyon eğrisine göre, DHDDS bir homodimer oluşturur (77.4 kDa). Ok, boşluk hacmini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : TiSaflaştırılmış İnsan DHDDS'sinin bana bağlı Aktivitesi. Saflaştırılmış insan DHDDS'sinin, 10 uM FPP ve substrat olarak 50 uM 14 C-IPP ile yapılan in vitro aktivitesi, protein başına IPP katılma oranı olarak ifade edilir (mol / mol). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.