Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

6.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

3 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Escherichia'dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.

Özet

Preniltransferazlar (PT), çoklu yoğunlaşma reaksiyonları yoluyla izopentenil difosfat (IPP) kullanarak allikik difosfatın zincir uzamasını katalize eden bir grup enzimdir. DHPDS (dehidrodiliden difosfat sintaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını izopentenil difosfat (IPP) ile çoklu yoğunlaştırmalar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT (yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağları oluşturur) 'dir. DHDDS, biyomedikal önem taşır çünkü enzimdeki muhafazakar olmayan bir mutasyon (K42E) sonuç olarak retinitis pigmentosa ile sonuçlanır ve sonuç olarak körlüğe yol açar. Dolayısıyla, mevcut protokol mekanik çalışmalar için uygun olan büyük miktarlarda saflaştırılmış DHDDS elde etmek için geliştirildi. Burada, protein füzyonu, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, fonksiyonel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. cis- PT'nin homolojisi, bu protokolün, doğal kauçuk sentezinde yer alanlar gibi diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermektedir.

Giriş

Preniltransferazlar, izopentenil difosfat (IPP) kullanarak alikolit difosfatın zincir uzamasını, çoklu yoğunlaşma reaksiyonları 1 , 2 yoluyla katalize eden bir grup enzimdir. Z tipi enzimler, yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağlarının oluşumunu katalizlerken, E-tipi enzimler, trans çift ​​bağ oluşumunu katalize eder 3 . cis--Prenyltransferases (sis -PT, Z-tipi enzimler) klasik kısa zincirli (Cı-15), orta-zincirli (Cı-50-55) içine ürün zinciri uzunluğuna göre sınıflandırılır ve uzun zincirli (Cı-70-120 ) 4 . DHPDS (dehidrodirililik fosfat sentaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını, izopentenil difosfat (IPP) 1 ile çoklu kondansasyonlar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT'dir, 5 , 6 . Bu, N-bağlantılı protein glikosilasyonuna 1 dahil olan glikosil taşıyıcı molekül olan dolichylpyrophosphate için bir öncül olarak görev yapan bir C 55-100 poliprenil difosfat olan dehidrodoliril difosfatın oluşumuyla sonuçlanır. Ashkenazi Yahudileri arasında, DHDDS'deki bir missense muhafazakar olmayan mutasyon (K42E) otozomal resesif retinitis pigmentosa 7 , 8 ile sonuçlanır. Dolayısıyla, mevcut protokol, mekanik çalışmalar için uygun saflaştırılmış DHDDS'yi elde etmek için geliştirildi.

Escherichia coli , rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ve uygun maliyetli konak olarak düşünülür ve bu nedenle de en sık kullanılan konakçıdır. Bununla birlikte, bir heterolog olarak E. coli'deki proteinleri aşırı ifade etmeye çalışırsa, proteine ​​spesifik hususlar yapılmalıdır. Düzgün şekilde katlanan aktiviteyi elde etmekE. rekombinant proteinlerin E. coli'den ayrılması, farklı proteinlerin farklı özelliklerinden dolayı basit bir konu değildir. Bu engellerin üstesinden gelmek için sayısız yaklaşım geliştirildi. Burada, protein füzyonunun kullanımı, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, E. coli'de işlevsel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. Unutmayın, protein füzyonu olmaksızın maya cis- PT'yi aşırı ifade etme girişiminde bulunmak, deterjan 12 varlığında bile tam çözünmezlik nedeniyle başarısız olmuştur. Açıklanan protokol, basit, uygun maliyetli, zaman kazandıran ve mekanik çalışmalara uygun DHDDS preparatlarını elde etmeyi sağlar. Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisi göz önüne alındığında, bu protokolün diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. E. coli 'de aşırı salgılamasının için sis -PT klonlanması

  1. 109aa tioredoksin (TRX) proteini 17 ile kaynaştırılmış protein dizilerinin klonlanması ve yüksek seviyede ekspresyonu için tasarlanmış pET-32b ifade vektörünü ve tam boy cis -PT'nin E. coli kodon-optimize edilmiş 18 kodlama dizisini elde edin.
  2. TEV-proteaz, bir kısa esnek bir bağlayıcı ile ve ardından (tütün etch virüsü proteaz) parçalama bölgesine ( "/" bölünme noktasını gösterir ENLYFQ / G) 9 için özen cis akış yukarı (SGSGSG, yarılma sitesi erişilebilirlik arttırmak için) -PT dizisi (Şekil 1 A). Ayrıca, klonlama için uygun 5 've 3' kısıtlama bölgeleri ekleyin.
  3. Standart ligasyon teknikleri kullanılarak sentezlenmiş DNA yapısını pET-32b vektörü içine kopyalayın 10 .

2. Overexpreİnsan DHDDS'sinin E. coli'de bulunması

  1. E. coli T7'i, yetkili hücreleri, üreticinin talimatlarına göre TRX-füzyon DHDDS yapısı ile ifade edin.
  2. Dönüştürülen hücreleri, ampisilin seçici koşullar altında (200 mg / L) LB-agar üzerindeki imalatçının talimatlarına göre plakaya yerleştirin.
  3. Seçilen kolonileri, 100 mg / L ampisilin ile 250 ml'lik şişeler başlangıç ​​kültürlerinde 100 mL'lik LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 200 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Kültürün 80 mL'si, her biri, 100 mg / L NaCl ile 1.5 L 2x YT ortamı (16 g / L tripton, 10 g / L maya özütü, 5 g / L NaCl) içeren iki 5 L'lik şişeye (40 mL / şişe) L ampisilin.
  5. Kültürü OD 600 nm = 0.5'e ulaşana kadar 180 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Sıcaklığı 16 ° C'ye indirin ve hücreleri, 0.5 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ilave ederek indükleyin. aleyhteProtein dozu için 16-20 saat boyunca aynı koşullar altında inkübe edildi.
  7. Hücreleri santrifüjle (10 dakika için 10,000 x g ) hasat edin.
    Not: Protokol burada duraklatılabilir; Hücreler pelet arındırılıncaya kadar -80 ° C'de tutulmalıdır.

3. İnsan DHDDS'sinin Arıtımı

  1. Hücreleri tampon A'ya (25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol), 1 μg / mL DNase I ve bir proteaz inhibitörü karışımı içine tekrar süspansiyon haline getirin.
  2. Bir cam-Teflon homojenleştirici kullanarak hücreleri homojen hale getirin.
  3. Hücreleri 12.000 - 15.000 psi'de bir mikrofluidizer veya eşdeğeri kullanarak parçalayın 11 .
  4. 4 dakika 40 dakika, 40,000 xg'de hücre lizatı santrifüj ° C. Çözülebilir fraksiyonu içeren süpernatanı alın.
  5. Süpernatanı, 5 - 10 mL kobalt hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (Co2 + -IMAC) 12 sütun üzerine 10Bunu takiben, spesifik olmayan protein bağlanmayı azaltmak için tampon A ve 10 mM imidazol ile iyice yıkanır.
  6. Aşırı preslenmiş proteinleri 250 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon A ile elute edin.
  7. İmidazolü, tampon A ile dengelenmiş 53 mL'lik bir hazırlayıcı tuz giderme sütunu kullanarak çıkarın.
  8. 6xHis etiketli TRX füzyon proteinini gece boyunca 4 ° C'de çıkarmak için elüe edilen proteinlere 6xHis etiketli TEV proteaz (50 mg protein başına 1 mg TEV proteaz) ekleyin.
  9. Bölünmüş 6x His-etiketli TRX füzyon protein ve TEV proteaz kaldırmak için, 5 mM imidazol ile takviye tampon A ile dengelenmiş bir Co 2 + -IMAC sütun üzerine parçalanmış protein yükleyin.
  10. Akışı toplayın ve 30 kDa'lık bir moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi kullanarak 3-4 mL'ye konsantre edin.
  11. Konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir süperdeks-200 ebat dışlama kromatografi kolonuna yükleyin. Protein, dimer (~ 76 kDa) olarak akar.
  12. Elution profilini bir sütun kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin.
  13. SDS-PAGE kullanarak hazırlığın saflığını değerlendirin.
  14. İndirgenmiş deneyler için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve sıvı nitrojende saflaştırılmış, konsantre proteinlerin küçük miktarlarını dondurun ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Analitik Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC)

  1. Proteinin donma-çözme döngülerine dayanma kabiliyetini sağlamak için donmuş proteinlerin bir kısmını çözdürün ve çözünmeyen agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın.
  2. Proteinleri, ultra-performanslı bir sıvı kromatografi sistemi 13 kullanarak 25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.02 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol ile önceden dengelenmiş bir süper-dex-200 analitik kolona yükleyin , 14 .
  3. Triptofan tohumu izleyinProteinlerin elüsyonlu elüsyon profili tespit etmek için scence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm). Moleküler ağırlık değerlendirmesi için geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun - bu eğriler SEC sütun üreticileri aracılığıyla edinilebilir.

5. Enzim Kinetikleri - Zamana Bağlı Faaliyet 15 , 16 , 17

  1. 30 ° C - saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, 22 ° C'de 0.5 mM MgCl2 ile tampon A içinde reaksiyonu başlatmak için 10 uM FPP ve 50 uM 14C-IPP ile saflaştırılmış DHDDS 5 uM karıştırın.
    Not: Tam reaksiyon koşulları, DHDDS'den farklı cis- PT'lerin preparatlarına göre değişiklik gösterebilir. Üstelik DHDDS'nin aktivitesi ayrıca sıcaklığa ve [Mg 2+ ] bağlıdır.
    Dikkat: 14 C-IPP radyoaktiftir ve yerel radyasyon güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmalıdır.
  2. 15 μL tampon A ilave edilmiş 20 mM EDTA (10 mM EDTA nihai konsantrasyona) eklenmesiyle reaksiyonun derhal söndürülmesinin ardından 0, 2, 4 ve 6 saat reaksiyondan 15 μL numuneler çıkarın.
  3. Ekle 1 ml H2 iyice reaksiyon ürünleri elde etmek için 1-butanol ve vorteks O-doymuş.
    Not: Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunacak şekilde tutulabilir.
  4. Numunelere sintilasyon kokteyli ilave edin ve bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden reaksiyon karışımından 15 uL'lik radyoaktivite ile birlikte 14 C'yi kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicel hale getirin.
  5. Her zaman noktasından 0 saatlik örnekleri kullanarak ölçülen arka plan okumalarını çıkarın ve kullanılan 14 C-IPP yüzdesini hesaplayın.
  6. Toplam 14 C-IPP katılma oranını her bir zaman noktasında hesaplayın, toplam 14 C-IPP konsantrasyonları ve sonuçları zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Net 14 C-IPP katılımının zamanla artması beklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada kullanılan yapıya genel bir bakış ve saflaştırma süreci Şekil 1'de gösterilmektedir. Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin kademeli olarak arıtılmasını gösterir ve sonuç olarak yüksek saflıkta bir ürün elde edilir. Şekil 3 , saflaştırılmış enzimin analitik SEC sonuçlarını göstermektedir, bu protein sadece bir homodimer olara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

E. coli hücrelerindeki işlevsel insan DHDDS'sinin saflaştırılması için burada açıklanan protokol, basit ve etkili olup uygun bir yapı elde edildiğinde 3-4 gün içinde proteini fazla ifade ve saflaştırmaya izin verir. Protein saflaştırma için bu gibi protokoller, böylece protein seviyesinde 19 de patojenik mekanizmalar karakterize etmek için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç, bir çok hastalık 18. genetik ilişkin bilgilerin bolluk mesafede genom...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Yapısal Hücre Biyolojisi (1775/12) 'da İsrail Bilim Vakfı Araştırma Mükemmellik Merkezi (I-CORE) ve İsrail Bilim Vakfı tarafından 1721/16 ve 2338/16 (YH) ve 825/14 (DK) hibeleri ile finanse edildi. ). Fields Estate Vakfı'nın DK'ya desteği çok takdir edilmektedir. Bu çalışma, Ilan Edri ve Michal Goldenberg tarafından Tel Aviv Üniversitesi Sackler Tıp Fakültesi'nin MD tez şartlarının kısmen yerine getirilmesiyle gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pET-32bNovagen69016-3
T7 Ekspres  lysY  Yetkili  E. coli  (Yüksek Verimlilik)NEBC3010I
cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü KokteylRoche11873580001
TALON-süper akışlı reçineGE Healthcare28-9574-99
HiPrep 26/10 tuz giderme kolonu GE Sağlık17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Sağlık28989335
superdex-200 artışı 5/150 GL GE Sağlık28990945
14C-İzopentenil pirofosfatPerkin-ElmerNEC773050UC 
trans, trans-Farnezil pirofosfatSigma44270-10MG

Kaynaklar

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DHDDS A r EkspresyonuProtein Safla t rmaEnzimatik Aktivite AnaliziKodon OptimizasyonuKobalt Afinite KromatografisiBoyut D lama KromatografisiSDS PAGE AnaliziRetinitis Pigmentosazoprenoid Sentezi
Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.