Method Article

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi (MS) birçok olağanüstü gelişmeler yaptık-sıvı Kromatografi (LC) belirli teknik ilerleme ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve izobarik etiketleme çoğullama kapasite birleştiğinde proteomik dayalı. Burada, bir geniş LC/LC-MS/MS platform ve doğru bir şekilde tüm proteomes quantitate için sonrası MS Hesaplamalı girişim düzeltme ile etiketleme 10-plex tandem toplu etiket (TMT) birleştiren bir derin-proteomik profil oluşturma protokolü tanıtmak. Bu iletişim kuralı aşağıdaki temel adımları içerir: protein ayıklama ve sindirim, TMT etiketleme, 2-boyutlu (2D) LC, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve sayısal veri işleme. Kalite kontrol adımları sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için dahil edilir. 10.000'den fazla proteinler memeli örnekleri arasında güvenle bu iletişim kuralı ile quantitated. Bu iletişim kuralı küçük değişiklikler ile sonrası translasyonel modifikasyonlar Nefelometri için uygulanabilir. Bu çoğaltılmış, sağlam yöntemi karmaşık örnekleri, hücre kültürü, hayvan doku ve insan klinik örnekler de dahil olmak üzere çeşitli proteomik analiz için güçlü bir araç sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni nesil sıralama teknolojisindeki ilerlemeler biyolojik sistemleri ve insan hastalık çalışmak için yeni bir manzara açmıştır. Bu ölçümler genom, transcriptome, Proteom, metabolome ve diğer moleküler sistemlerin somut olmak için çok sayıda izin vardır. Kütle spektrometresi (MS) analitik kimya en hassas yöntemlerinden biridir ve proteomik uygulaması hızlı bir şekilde insan genomu sıralama sonra genişledi. Proteomik alanında, son birkaç yıl içinde MS tabanlı kantitatif analizleri, izobarik etiketleme ve araçları yanı sıra kapsamlı sıvı Kromatografi ile birlikte yeteneği çoğullama da dahil olmak üzere önemli teknik gelişmeler vermiştir , daha hızlı, daha doğru ölçümler için daha az örnek malzeme gerekli izin ilerler. Nicel proteomik proteinler ve ardından değişiklikleri son derece karmaşık biyolojik örnekleri1,2,3,4 , on binlerce profil oluşturma için genel bir yaklaşım haline gelmiştir , 5 , 6.

Çoğaltılmış izobarik etiketleme gibi yöntemleri izobarik etiketi göreli ve mutlak Nefelometri (örneğin, iTRAQ) ve tandem kitle etiketi (TMT) MS için büyük ölçüde örnek işlem hacmi geliştirilmiş ve tek bir analiz örnekleri sayısı arttı 1,6,7,8deneme. Yanı sıra diğer MS tabanlı Nefelometri yöntemleri, etiket içermeyen Nefelometri ve kararlı izotop amino asitler (örneğin, SILAC), hücre kültüründe ile potansiyel proteomik teknikler etiketleme gibi önemli9 alandır ,10,11. Örneğin, TMT yöntemi 10 protein örneklerini birlikte 1 deneyde 10-plex reaktifler kullanarak çözümlenmesi için izin verir. Bu yapısal olarak özdeş TMT etiketleri aynı genel kitle var, ama ağır izotoplar differentially böylece göreli Nefelometri etkinleştirme her etiket, MS/MS parçalanma sırasında bir benzersiz muhabir iyon kaynaklanan karbon veya azot atomu dağıtılır 10 örnekleri arasında. TMT strateji rutin olarak biyolojik yollar, hastalık ilerleme ve hücresel12,13,14çalışmaya uygulanır.

Önemli teknik gelişmeler sıvı Kromatografi (LC)-MS/MS sistemleri, LC ayırmaları ve Nefelometri doğruluk ödün vermeden protein tanımlama en üst düzeye çıkarmak için MS parametreleri açısından hem de gelişmiş var. İlk boyut peptidler ikinci boyutu için yüksek dikeylilik ile ayırma tekniği ile20maksimum sonuçlar elde etmek için av tüfeği proteomik yöntemi bu tür kritik ayrılmasıdır. Yüksek pH ters fazlı sıvı Kromatografi (RPLL) geleneksel güçlü katyon değişim Kromatografi20daha iyi performans sağlar. Yüksek pH RPLL düşük pH RPLL ikinci bir boyut ile birleştirildiğinde, hem analitik dinamik alan ve protein kapsamı, Bütün-Proteom analizleri15 işlemi sırasında toplu ifade proteinlerin tanımlama yeteneği içinde kaynaklanan artırıldı ,16,17,18. Diğer teknik gelişmeler küçük C18 parçacıklar (1.9 µm) içerir ve genişletilmiş uzun sütun (~ 1 m)19. Ayrıca, diğer önemli iyileştirmeler hızlı tarama hızları, geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük20ve MS veri madenciliği21sofistike Biyoinformatik boru hatları ile Kütle Spektrometreleri yeni sürümlerini içerir.

Burada, duyarlılık ve işlem hacmi, kalite kontrol mekanizmaları deneme boyunca odaklanan geliştirmek için değişiklikler ile en son metodolojiler birleştirmek detaylı bir protokol açıklayın. Protokol protein ayıklama ve sindirim, 10-plex TMT etiketleme, temel pH ve asit pH RPLL ayırma, yüksek çözünürlüklü MS algılama ve MS veri işleme (şekil 1) içerir. Ayrıca, sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için çeşitli kalite kontrol adımları uygulayın. Bu ayrıntılı iletişim kuralı düzenli olarak tanımlamak ve doğru bir şekilde proteinler üzerinden bir lysate binlerce quantitate araştırmacılar yeni alana yardımcı olma amacını taşıyan veya doku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dikkat: tüm ilgili güvenlik veri sayfaları (Yani, MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamaları bu iletişim kuralını kullanırlar.

Not: 10 örnekleri Proteom Nefelometri için kullanılan bir TMT 10-plex izobarik etiket reaktif küme Bu protokol için.

1. hazırlık hücreler/doku

Not: düşük sıcaklıkta proteinlerin biyolojik durumlarına içinde tutmak için en az sürede örnekleri toplamak için çok önemlidir.

  1. 10 cm 10 mL buz iki kez plakalı (örneğin, HEK 293 hücreleri) yıkama yapışık hücreleri soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS). Scrape ve PBS 1 mL (~ 2 x 10 6 hücreler) hücrelerde toplamak. Aktarım için 1,5 mL tüpler ve 600 x g 4 ° C. mağaza hücre granül-80 ° C'de, 5 min için de Santrifüjü lizis kadar sonra PBS kaldırmak.
    Not: Bir pilot deney genellikle protein verim incelemek için gerçekleştirilir. Yaklaşık 1 mg protein çıkarılan 10 x 10 6 memeli hücreleri veya bir 15 cm tabak ile % 80 izdiham.
  2. Alternatif olarak, yıkandıktan sonra plaka doğrudan lizis arabelleği ekleyerek onların plaka üzerinde yapışık hücreleri parçalayıcı. Lysates 1.5 mL tüpler içine toplamak ve protokol açıklama adım 2.5 kullanın.
    3. 15 mL tüpler, iki kez yıkama
  3. toplamak süspansiyon hücrelerde buz soğuk PBS 10 mL ile 1,5 mL tüpler içine aktarmak ve santrifüj kapasitesi 600 x g de PBS kaldırmak için. PBS tamamen lizis tampon maddeler istenen konsantrasyonu korumak için yıkama adımlardan kaldırın. Saklamak hücre granül-80 ° c kadar lizis.
  4. Toplamak ve dokularda hızla tartın. Dokulara sıvı azot diseksiyon ve mağaza hemen sonra devam-80 ° C.
    Not: Dokulara protein verimini yaklaşık % 5 için % 10 doku ağırlığının olduğunu
  5. homojen doku boyutlarını ve anatomik bölgeler için 10 örnekleri örnek heterojenite azaltmak için kullanın. Kan kirlenme örnekleri buz soğuk PBS protein Nefelometri ve aşağı akım veri analizi etkileyen son derece bol kan proteinleri önlemek için 1 mL ile iki kez durulama tarafından kaldırmak.

2. Protein çıkarma, kalite kontrol Western Blot, çözüm sindirim ve peptid Desalting

Not: her 10 işleme aynı şekilde önce TMT etiketli örnekleri havuzu azaltmak için gerekli kadar herhangi bir adımı sırasında örnekleri varyasyon.

  1. Olun lizis arabellek (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M üre ve % 0,5 sodyum deoxycholate) denemenin gün.
    Not: Kısmi proteini denatürasyon örnek lizis sırasında protein sindirimi verimliliği etkiler.
    2. Numune hacmi arabelleğe oranı 10:1 ve cam boncuk (0.5 mm çapında) son hacminin ~ %20 hücre topakları veya doku (örneğin, arabellek ve örnekleri arasında 10: 1 hacim oranı) son protein konsantrasyonu 5 elde etmek böylece
  2. Ekle lizis tampon 10 mg/mL. Kullanılan hücre sayısı veya doku örnekleri ağırlığını dikkate alarak tüm 10 örnekleri aynı konsantrasyonu tutmak.
  3. Koru üre konsantrasyon için örnek katı üre ekleyerek 8 m. Hücre Pelet veya doku hacmi 8 M toplama ulaşmak için örnek eklemek için katı üre miktarını hesaplarken dikkate unutmayın.
    Not: Un taze üre arabellek yapay kimyasal değişiklik (örneğin, protein carbamylation) tanıtmak ve tespit peptidler sayısını olumsuz yönde etkiler. Üre hatırı sayılır bir hacim kaplar (üre 100 mg ~ 73 µL çözümde kaplar).
  4. Çözünmez enkaz lysate sindirim çözünmez proteinler 23 izin vermek için devam.
  5. Lyse hızda 8 4 ° C'de 30 s, 5 s ve yineleme boyunca'bir karıştırıcıda örnekleri 5 kere veya örnekleri homojenize oluncaya kadar. Örnekleri de 30 vortexing tarafından lysed (RT) oda sıcaklığında 30 s s ~ 10 döngüleri için buz dönemi soğutma. Lizis koşulları örnek türüne bağlı olarak gerektiği gibi ayarlayın.
  6. Lysate iyi Santrifüjü olmadan ve 2 küçük aliquots (~ 15 µL her). Ölçü protein konsantrasyonu 1 aliquot ve 1 aliquot western blot analizi gerçekleştirerek olumlu denetim doğrulama gerçekleştirmek için kullanın. Kalan büyük aliquot proteomik analizi için devam.
  7. Ölçü protein konsantrasyonu bir standart protein Nefelometri tahlil veya bir Coomassie lekeli kısa Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel (% 10) 22 sığır serum albumin (BSA) ile standart olarak. BSA standart bilinen konsantrasyon doğruluğu yüksek bir derece ile kullanın. En yüksek doğruluk düzeyine ulaşmak için BSA standart amino asit analizi gerçekleştirin.
    Not: Diğer doğru standartları mevcut olabilir. Protein konsantrasyonları da hücre sayıları veya doku ağırlıkları tarafından tahmin edilebilir. Protein (100 µg/örnek) 1 mg önerilir, ancak analizi ile protein (10 µg/örnek) kadar az 100 µg gerçekleştirilebilir.
    8. %10 ACN ve LysC proteaz son derece RT koşulları 2 h 1 için denaturing altında protein sindirimi (w/w) 1: 100 bir enzim Substratı oranında son bir konsantrasyon elde etmek için
  8. Ekle % 100 Asetonitril (ACN). Son bir konsantrasyon disülfür bağları proteinlerde azaltmak ve 1 h. gerçekleştirmek LysC sindirim, 7.2 M üre son bir konsantrasyon için kuluçkaya 1 mm dithiothreitol (DTT) ekleyin.
  9. 2 M üre ile 50 mM HEPES (pH 8,5) örnekleri ve daha fazla Özet örnekleri 3 h için RT, tripsin ile seyreltik veya bir tripsin protein oranı 1:50 (w/w) vasıl gece. Tripsin 100 µg protein ve yaklaşık 10 ng/µL tripsin konsantrasyon için kullanım yaklaşık 2 µg.
    Not: verimsiz tripsin sindirim için yol açabilir pH sorunları, etkin olmayan tripsin veya enzim substrat için uygunsuz bir oranını kullanımı faktörlerdir.
  10. DTT 1 mM verim ve peptidler RT. 2 h için daha da azaltmak için Ekle
  11. Ekle iodoacetamide (IAA) 10 mM elde etmek için. RT peptidler Cys içeren alkylate için karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
  12. 30 mM ulaşmak için ve dik, 30 dk için kuluçkaya DTT ekleyerek unreacted IAA gidermek
  13. Küçük bir aliquot her örneği inceleyerek tripsin sindirim verimliliğini kontrol edin. Ölü boşluk içinde gömülü Kromatografi medya ile 10 µL pipet ucu kullanarak üreticiye göre desalt ' s protokolü. Her örneğini analiz LC-MS/MS. LC-MS/MS tarafından adım 5, degradenin 10 dk 23 ' tür istisna ile aynı parametreleridir.
  14. Bir arama parametresi olarak 4 cevapsız nefrette kullanarak MS ham veri (bkz. Adım 6 daha fazla detay) için bir veritabanı arama gerçekleştirmek.
    Not: kesim sayısını cevapsız ise > % 10, eksik tripsin sindirim gösterebilir. Bu akış aşağı sonuçları olumsuz etkiler. Bu kritik kalite kontrol (QC) adımdır.
  15. Sindirmek örnekleri tekrar cevapsız bölünme ise > % tripsin ek bir 10 µL örnekleri için ekleyerek 10.
  16. Örnekleri trifluoroacetic asit (%1 konsantrasyon ulaşmak için TFA) ekleyerek acidify. PH pH şerit kullanarak ölçün. PH bahis doğrulayın2 ve 3 ween. Doğru pH elde kadar gerektiği gibi daha fazla TFA damla bilge (1 µL) ekleyin.
  17. 10 dk ve süpernatant toplamak için RT de 20.000 x g, santrifüj.
  18. Yıkama 60 0,5 µg kapasite spin C18 ters fazlı reçine 0.25 mL metanol ile 100 µg örnekleri kullanıyorsanız içeren sütunlar. 0.03 30 µg kapasite spin sütunları ile %60 0.25 mL yıkama ACN/0.1% 10 µg örnekleri kullanıyorsanız TFA. 500 x g 30 spin sütunların santrifüj kapasitesi s.
  19. 0,5 mL %0.1 TFA ve Kaldır sütunlarla 500 x g 30 için de centrifuging tarafından equilibrate s.
  20. Yük örnekleri sütunlarda ve örnekleri Santrifüjü 100 x g 3 dk ya da tüm örnek sütunu boyunca geçene kadar tarafından sütunları bağlayın.
  21. %0,1 0.5 mL ekleyin TFA sütunları ve santrifüj 500 x g, 30 s.
  22. Ekleyin 125 µL % 60 ACN/0.1% TFA her sütun için ve 100 x g 3 dk. emin olun tüm çözüm sütunu boyunca geçti de centrifuging elute.
  23. Vakum yoğunlaştırıcı eluents kuru. Örnekleri tamamen kuru ve Hayır sıvı kalır tüpler içinde olduğundan emin olun. -80 ° c daha fazla analiz kadar mağaza.

3. TMT etiketleme peptidler

Not: tüm örneklerini TMT reaktifler tarafından tam olarak etiketlenir sağlamak için önemlidir. Çeşitli faktörler (örneğin, miktarı kullanılan TMT reaktifler, pH değeri ve protein Nefelometri doğruluğunu) olumsuz tüm aşağı akım sonuçları değiştirecek verimliliği etiketleme TMT etkileyebilir.

  1. Sulandırmak her 50 mM HEPES tampon (pH 8,5) 50 µL peptid örnek desalted. PH kontrol edin ve 7 ile 8 arasında olduğundan emin olun.
    Not: Örnek tamamen etiketleme verimliliği etkiler desalting adımdan sonra kurutulmuş değil Eğer asidik olabilir.
  2. ~ 1 µg etiketlenmemiş her örneği için bir sonraki TMT etiketleme verimliliği test, 3.3 adımda anlatıldığı gibi devam.
  3. Dağıtılması susuz ACN TMT reaktifler ve üretici takip ederek peptid örnekleri etiket ' s yönergeleri. 1 h. RT, Kimyasalları kuluçkaya
    4. Desalting ~ 1 µg TMT etiketli ve - etiketsiz her örneğinin tarafından üretici göre katıştırılmış Kromatografi medya ile 10 µL pipet ipuçlarını kullanarak bir QC TMT etiketleme verimliliği test
  4. gerçekleştirmek ' s protokolü. TMT etiketli ve etiketsiz örneklerini LC-MS/Bayan tarafından
    Not: LC-MS/MS parametre ile bölüm 5, degradenin 10 dk. olduğunu istisna ile aynıdır
  5. Ham veri etiketlenmemiş peptidler etiketli örnekleri tam etiketleme verimliliği ( Şekil 2) sağlanması, tespit edilmedi emin olmak için incelemek. 6-10 ayrı peptidler etiketleme etkinliğini doğrulamak için bunu.
  6. 4 µL % 5 hydroxylamine ekleyerek tepki gidermek ve 15 dk. için kuluçkaya
  7. Küçük ve eşit birim (2 µL) aliquot TMT etiketli her örneğinin karıştırın. Katıştırılmış Kromatografi medya ile 10 µL pipet ipuçlarını kullanarak desalt. 3.4. adımda açıklandığı gibi örnekleri LC-MS/MS tarafından analiz. ATLAMA yazılım programına (peptidler ve proteinler listesine tandem MS raw dosyalarını dönüştüren bir açık kaynak veritabanı arama algoritması) tarafından tüm TMT etiketi yoğunluklarda tüm 10 örneklerini göreli yoğunlaşmasını oranını belirlemek için tanımlanan peptidler.
    Not: Bu QC Premiks oran testi eşit final havuzu önce karıştırma için doğru oranını belirlemek yararlıdır, pipetting hatalar oluşabilir gibi bu konsantrasyonları değişecek ve protein Nefelometri adım her zaman doğru olmayabilir. O da her biri son karıştırmak için kullanılan 10 örnekleri miktarı eşit bir oranında tüm 3.5 adımda anlatıldığı gibi olması için en iyi yoldur.
  8. 1:1 oran tüm 10 örnekler üzerindeki ulaşmak için gereken birçok kez yineleyin.
  9. Eşit Premiks oran testi sonuçlarına göre 10 örnekleri karıştırın. 9 diğer örnekleri birimleri ayarlamak için temel olarak en düşük konsantrasyon ile örnek kullanın.
  10. Desalting tarafından havuza alınan TMT etiketli örnek su verme tepki yan kaldırmak.
  11. Yıkama 1 mL katı fazlı ayıklama kartuşları 50 mg jelleştirici sütun ile 1 mL/0.25 mL metanol başına 100 µg örnekleri kullanıyorsanız içeren. 0,5 - 60 µg kapasite C18 spin sütunları ile 1 mL/0.25 mL % 60 yıkama ACN/0.1% 10 µg örnekleri kullanıyorsanız TFA. Santrifüj kapasitesi 500 x g 30 sütun s.
  12. 0,5 mL %0.1 TFA ve Kaldır sütunlarla 500 x g 30 için de centrifuging tarafından equilibrate s.
  13. Yük örnekleri sütunlarda ve bağlamak vasıl 100 x g 3 dk ya da tüm örnek geçti kadar sütunu boyunca aralıklarla tarafından.
  14. %0,1 0.5 mL ekleyin TFA sütunları ve santrifüj 500 x g, 30 s.
  15. Ekleyin 125 µL % 60 ACN/0.1% TFA her sütun için ve 100 x g 3 dk. emin olun tüm çözüm sütunu boyunca geçti de centrifuging elute.
  16. Vakum yoğunlaştırıcı eluents kuru. Örnekleri tamamen kuru ve Hayır sıvı kalır tüpler içinde olduğundan emin olun. -80 ° c daha fazla analiz kadar mağaza.

4. Geniş yüksek çözünürlüklü, temel pH LC Prefractionation

  1. Set up 2 bağlı C18 sütun Köprülü etilen hibrid parçacıklar (4.6 mm x 25 cm 50 cm toplam alma, 3,5 µm partikül büyüklüğü) içeren ve microliter akışı yüksek performanslı LC pompa için kullanın ayırma.
    Not: 2 sütun kullanımı peptid yükü artırır ve mutlaka Kromatografi iyileştirmez. Numune içeren ≤ 200 µg peptidler, 1 sütun yeterli.
  2. Sonraki eklemeler 300 µL her metanol, su ve arabellek A (10 mM amonyum format, pH 8.0) ile 100 µL döngü yıkayın.
  3. Sütunları 100 µL eşit karma isopropanol, metanol, ACN, ve su ile yıkama ve % 95 arabellek 2 h. A sütununda equilibrate
  4. Solubilize desalted havuza alınan TMT etiketli peptid örnek 65 µL arabelleği A. örnek pH ~ 8.0 olduğunu doğrulayın. Hala asidik, amonyum hidroksit 8,0 pH ayarlamak için kullanın.
    5. Aşağıdaki degrade ile tampon B kullanarak
  5. Fractionate örnek (tampon bir artı %90 ACN): 15dk için % %15 20, 100 min için % %20 35 ve % 35 ila %50 30 dakika süreyle her 2 yükleme süresi de dahil olmak üzere min kesirleri toplamak için kesir toplayıcı ayarla. Akış hızı 0.4 mL/dk için ayarlayın. Bkz: bir temsilcisi Kromatografik için başvuru 29 ve şekil 1.
  6. Toplam 80 kesirleri toplamak ve 40 kesirler (her diğer kesir) tam kuruluk için vakum yoğunlaştırıcı ile kuru.
  7. LC-MS/MS analiz için 40 kurutulmuş örnekleri kullanır.
  8. Tüm 80 kesirler Ultra derin Proteom kapsama alanı elde etmek için LC-MS/MS tarafından analiz.

5. LC-MS/MS hazırlık ve parametreleri

Not: Nefelometri içinde TMT tabanlı, peptid iyonları izobarik ve 1 seviye bir MS1 inceden inceye gözden geçirmek, son olarak görünür. Peptid iyon daha yüksek enerji çarpışma ayrılma (HCD) ile parçalanmış sonra ancak, onlar muhabir iyonları (10 benzersiz muhabir iyonları) yoğunluğuna göre MS/MS tarama quantitated. TMT muhabir iyon oranları TMT etiketli iyonları 24 ortak elüsyon bastırılmış. İyon yalıtım pencere 25, gaz fazlı arıtma 26, MultiNotch MS3 yöntemi 27 veya çok boyutlu LC ve uzun gradyanlar (4-8 h) ile geniş ayırma daralma 28 alternatif yaklaşım vardır.

  1. Pack 75 µm iç çapı (ID) boş C18 reçine için 30-40 cm uzunluk (~1.3 µL yatak cilt) 1.9 µm sütunlarla.
  2. Backpressure azaltmak ve ultra-yüksek-baskısı baskı üzerine önlemek için bir kelebek portföy ısıtıcı ile sütunları 65 ° c ısı sıvı Kromatografi (UPLC) sistemi. Sütunun tamamını Yatak uzunluk ısıtılır emin olmak için 2-3 kat kelebek ısıtıcı içinde sütun Kangal. Sütun üzerinde ısıtıcı içinde sıcaklık sensörü teyp değil dikkatli olmak ısıtıcı içine teyp.
    Not: Kelebek portföy ısıtıcı monte ve pleksiglas araç XYZ aşamasına bağlı özel yapım bir parçası üzerine bantlanmış.
  3. Hazırlama bir (% 3 Dimetil sülfoksit ve %0,2 formik asit) tampon ve B tampon (artı % 67 arabellek ACN) ve sütunları % 95 arabellek B. ile iyice yıkayın O zaman, tam olarak sütun % 95 arabellek A (en az 3 sütun birimler) equilibrate. Bir akış hızı ~0.25 µL/dk ve 280-320 bara backpressure kullanın
  4. İncelemek LC-MS/MS sistem kalitesini 100 çalıştırarak ng sıçan beyin peptidler (veya standart bizim seçim) TMT etiketli örnekleri analiz daha önce iki kez. Sık sık yüksek kaliteli veri toplama emin olmak için aşağıdaki parametreleri denetleyin: MS sinyal yoğunluğu (e8 ve temel en yüksek yoğunluk için e9) arasında anket MS/MS spectra (y ve b iyonlar iyi bir temsil), en yüksek Genişlik (12-22 s), genel saklama süresi, kalite LC sistem basıncı (basınç yükselmesi > 50 barlar gösterir bir kirli sütun veya tıkanmış emitör ipucu) ve koş koş değişkenliği (aynı tepeler-meli var olmak < 30 s arasında çalıştırır).
    Not: 10-plex TMT reaktifler (6,32 mDa fark) yakınındaki izobarik muhabir iyonları gidermek için MS/MS çözünürlük için en az 30.000 400 m/z olarak ayarlanmalıdır. İyon kapanı aletleri indüklenen çarpışma ayrılma (CID) uygulandığı üçte kural tabi değildir gibi PİLGRİM6A TMT10-plex muhabir iyon parçalanma için genellikle kullanılan.
  5. Temiz ve düzenli olarak MS enstrüman kalibre ve sistem performansını artırmak için taze LC arabelleklerini kullan.
  6. % 5 temel pH ayrılması kurutulmuş peptidler reconstitute TFA.
  7. ~0.2 µg akan %5 arabellek A. süre sütun üzerinde yük
  8. Elute ile % %15 45 arabelleği B 150 dak. Aşağıdaki degradenin başlangıç noktası olarak kullanın: 0, arabellek B %5; zaman zaman 2, arabellek B %15; 135, arabellek B %45 zaman, 145, arabellek B %70 zaman; ve 150, arabellek B %95 zaman. Temel pik chromatograms inceledikten sonra biraz erken ve geç temel pH RPLL kesirler için degrade ayarlayın.
  9. Veri bağımlı modunda Kütle Spektrometre iyon kapanı kitle çözümleyici (400-1600 m/z; 60.000 çözünürlük; 1 x 10 6 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef; 50 ms Maksimum iyon süresi; ve centroid modu)'bir anket tarama ile çalışır. 20 MS/MS yüksek çözünürlüklü taramaları (60.000 çözünürlük, 1 x 10 5 AGC hedef, ~ 100 ms Maksimum iyon süresi, 35 normalleştirilmiş PİLGRİM6A çarpışma enerji, 0.4 m/z yalıtım pencere ve 20 s dinamik dışlama) gerçekleştirmek.
    Not: ETD bölünme siteleri PİLGRİM6A farklı olduğu için elektron transferi ayrılma (ETD) TMT10-plex Kimyasalları muhabir iyon birbiri üzerine çakışması sonucu tavsiye edilmez. Çünkü tryptic peptidler genellikle + 2 şarj edilmiş Birleşik oluşturmak ve ETD daha verimli daha yüksek ücret Birleşik PİLGRİM6A olduğu gibi Ayrıca, ETD etkili değildir.

6. MS veri analizi

Not: veri analizi atlama yazılım programı ile açıklanmaktadır. Ancak, diğer ticari olarak kullanılabilir veya ücretsiz programlarla veri analizi gerçekleştirilebilir.

  1. Etiket tabanlı melez ile Kütle Spektrometre süreç raw dosyaları arama bir desen tabanlı veritabanı arama ve duyarlılık ve özgüllük geliştirmek için bir etiket tabanlı de novo sıralama birleştiren motoru atlama 21,.
  2. MzXML için convert ham veri biçimlendirmek ve MS2 spectra yanlış bulma oranı (FDR) hesaplamak için hedef-yem UniProt insan veritabanı (veya diğer uygun species-specific veritabanı) karşı arama.
  3. Gerçekleştir habercisi ve parça iyonları için 10 ppm kitle tolerans kullanarak arar. 2 en fazla cevapsız nefrette, başına peptid 3 en fazla değişiklik siteleri ve atama , b, ve peptidler puanı için y iyonları ile tam olarak tryptic kısıtlama için diğer arama parametrelerini ayarlayın. Lys artıkları ve N termini TMT Etiketler statik değişiklikler ayarlayın (+229.162 Da) ve Cys kalıntılarının carbamidomethylation (+57.021 Da). Ayarla Met oksidasyon eklemek için dinamik değişiklikler (+15.994 Da), örnek işleme kaynaklanan ortak bir peptid eseri olduğu.
  4. Tarafından aşağıdaki verilere filtre uygulama ölçütleri: 7 amino asit en az peptid uzunluğu, m/z doğruluk (örneğin, 5 ppm) ve eşleşen puanları (J puanı ve deltaCn). Grubuna göre peptid uzunluğu, trypticity, peptidler ve şarj devlet.
  5. Puanları eşleştirerek filtreleme ek bir düzeyi protein FDR için % 1 aşağıda azaltmak için kullanın. Bir tek spektral sayısına göre tespit proteinler gerektiren eşleşen puanı ne kadar yüksekse.
  6. 1 Grup eşleşen protein üyeler birden fazla protein ailesi üyeleri tarafından paylaşılan peptidler küme için.
    Not: cimrilik ilkesine göre grup atanan peptidler en yüksek sayıda protein ve benzersiz peptidler 1 tarafından eşleşen diğer proteinler tarafından temsil edilir.
  7. Tüm eşleşen peptid spektrum maçlar (PSMs) arasında atlama yazılım paketi içine inşa edilmiş bir program kullanarak muhabir iyon sayıları toplayarak proteinler quantitate.
  8. Her PSM kabul için ayıklamak ve TMT muhabir iyon yoğunluklarda etiketleme reaktifleri ve küresel PSM Nefelometri verilerden hesaplanan yükleme önyargı izotopik dağıtımını göre doğru. PSMs sırasında Nefelometri ile düşük yoğunluklu ve yüksek gürültü seviyesi kullanıcı tarafından tanımlanmış eşikleri ile filtre.
  9. Ortalaması tüm 10 gazeteci iyonlar arasındaki her muhabir iyon göreli sinyal hesaplayın. PSMs göreli sinyaller saptanan proteinler için toplamı. Bu göreli sinyaller ilk 3 PSMs karşılık gelen proteinler ortalama muhabiri iyon yoğunluğunu çarparak mutlak sinyallere dönüştürmek.
  10. Önlemlerden sonrası MS Hesaplamalı yaklaşımı kullanın. Y 1 iyon yoğunluğu muhabir iyon yoğunluğu için orantılı olduğunu varsayarak, temiz taramaları doğrusal ilişki hesaplamak ve gürültülü taramaları 23 yılında kirlenmiş y1ion yoğunluk girişim düzeyi türetin.
    Not: TMT etiketli tryptic peptidler için K-TMT ve R artıkları 2 y 1 iyonlar türleridir (376.27574 Da ve 175.11895 Da, sırasıyla) MS2 taramaları. Yalnızca 1 y 1 iyon algılanır ve tanımlanan peptid ile tutarlı, MS2 temiz tarama ( şekil 3A) olarak kabul edilir. Her iki y1ions algıladıysa, gürültülü bir tarama MS2 sayılır.
  11. Protein Nefelometri değerler daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo yazılım programına dışa aktarın. İkili karşılaştırmalar veya bir Varyans analizi differentially ifade edilir proteinler tanımlamak için kullanın.

7. MS veri doğrulama

Not: MS verilerin kalitesini değerlendirmek için en az 1 yöntemi doğrulama zaman alan biyolojik deneyler işlemine devam etmeden önce gerçekleştirilmelidir.

  1. El ile MS/MS spectra peptit dizisi ve TMT muhabir iyon Nefelometri doğrulamak ilgi proteinlerin inceleyin.
  2. Protein Nefelometri veri bilinen kullanım MS sonuçları onaylamak için.
  3. Doğrula protein değişiklikleri antikoru tabanlı yaklaşımlar (örneğin, weste ileRN leke ve immünhistokimya analizi).
  4. Kimyasal olarak faiz peptidler sentez ve onları olarak kendi standartlarına yerli peptidler tanımlaması onaylamak için kullanın.
    Not: MS/MS desen ve tutma zamanı LC-MS/MS sırasında aynı olması gerekir.
  5. Protein değişiklikleri bir hedeflenen MS yaklaşımla doğrulamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan türler arası peptid mix sistematik olarak oranı sıkıştırma pre-MS ayırma, MS ayarları ve post-MS düzeltme23gibi 3 büyük protokolü adımda etkisini analiz için kullanılan. Pre-MS ayırma değerlendirilir ve bir temel pH RPLL kombinasyonu ve asidik pH RPLL kullanarak en iyi duruma getirilmiş. Post-MS analiz için sadece species-specific peptidler kabul edildi. Biz bu girişime model bir dizi parametre LC/LC-MS/MS2 yalıtım pencere, online LC çözünürlük, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yüksek üretilen iş iletişim kuralı olan çeşitli yayınları12,13,14' te,32 başarıyla uygulanan bir 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin Nefelometri için tarif . Bu protokol için ilâ 10 farklı biyolojik protein örnekleri 1 denemede analiz edebiliriz. Düzenli olarak tanımlamak ve 10.000 Eh proteinler yüksek güven ile quantitate. İzobarik etiketleme proteinler quantitate için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar tüm diğer laboratuar ve tesis üyeler yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ve ALSAÇ verir. MS analizi St. Jude çocuk Araştırma Hastanesi proteomik tesiste, kısmen desteklenen NIH Kanser Merkezi destek grant P30CA021765 tarafından seslendirildi. Yazarlar Nisha Badders el yazması düzenleme konusunda yardım için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1220 LC sistemAgilentG4288B
%50 HidroksilaminTermo Bilimsel90115
AsetonitrilBurdick & JacksonAH015-4
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Kelebek Portföy IsıtıcıPhoenix S & TPST-BPH-20
C18 ipuçlarıHarvard Aparatı74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Formik asitSigma94318
Fraksiyon ToplayıcıGilsonFC203B
Cam BoncukSonraki İlerlemeGB05
HEPESSigmaH3375
İyodoasetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MetanolBurdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA Protein Test kitiThermo Scientific23225
Kütle SpektrometresiThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 reçine, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self Pck SütunlarıYeni HedefPF360-75-15-N-5
Sodyum deoksikolatSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex İzobarik etiket reaktifiThermo Scientific90110
Trifloroasetik asit (TFA)
SigmaU5378
Xbridge Kolonu C18 kolonuSular186003943
Fermuar uçları C18Millipore ZTC18S096
SepPak 1cc 50mgSularWAT054960
Tripsin Promega V511C Üre 400003 Uygulanan Biyosistemler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464(2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171(2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

Related Articles