Method Article

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Larva mikroenjeksiyon Protokolü 2011N000127 altında Massachusetts genel hastane alt Komisyonu araştırma hayvan bakım tarafından kabul edildi.

1. cihaz imalat

Not: Burada açıklanan fotolitografi maskeleri tasarlamak için kullanılan tüm bilgisayar destekli çizim (CAD) dosyaları (şekil 1) elde edilebilir için download. Malzemeler tablo bağlantıları için bkz.

  1. Bir sınıf 1.000 temiz oda standart photolithographic teknikleri7kullanarak ana kalıp gofret imal. Mikroyapı diziler ve kanallar için üreticinin yönergelerine göre sıralı olarak 3 ayrı maskeleri kull....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yaklaşım geliştirme (şekil 1) ve photolithographic (Şekil 2) ve yumuşak tekniğinde (şekil 3) teknikleri kullanarak 2 dpf Zebra balığı ile kullanılacak cihazların üretim gösteriyor. Bu yöntem birçok tasarım yineleme ve değişiklikler hızlı test sağlar ve değişiklikler ve Mikroyapı boyutları diğer gelişim aşamasında Zebra balığı ile kullanılacak duruma getirilmesi onların uygulama uzata.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.

MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeksiyon iğne mantar conidia veya teslimi için .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon'ın Laboratuarı'ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner'ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dow Corning Sylgard 184 Polidimetilsiloksan (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KİTİ 0.5KGCihazları dökmek için. Kit, PDMS monomer ve Başlatıcı içerir
Düşük jelleşme sıcaklığı agarozSigma AldrichA9414-10GAgaroz cihazlarının dökümü için
PFDTS silanSigma Aldrich448931-10GNegatif PDMS kalıplarının dökümü için
Trikain (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GZebra balığını uyuşturmak için
Rhodamine Dextran 70.000 DaThermoFisherD1818Mikroenjeksiyonları izlemek için
Lökotrien B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Nötrofil kemoatraktan
N-Formilmetiyonin-lösil-fenilalanin (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNötrofil kemoatraktan
15 cm Petri kabıFisher scientific08-757-148Ana gofretten Döküm için
Cam tabanlı 6 oyuklu plakalarMatTekP06G-0-20-FGörüntüleme cihazları için
Borosilikat cam mikrokılcal damarlarWorld Scientific InstrumentsTW-100-4Mikroenjeksiyon iğneleri için
Transfer pipetleriSigma AldrichZ350796Zebra balığı embriyolarını aktarmak için
Mikro yükleyici uçlarıFisher scientificE5242956003Mikroenjeksiyon iğnelerini yüklemek için
Harris Uni-Core 1,5 mm zımbaTed Pella A.Ş.15111-15PDMS görüntüleme cihazlarında bağlantı noktalarını delmek için
No. 11 NeşterGüzel Bilim Araçları10011-00PDMS
Dumont'u kesmek için No. 5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-10Embriyoları dekoryonlamak ve mikroenjeksiyon iğne uçlarını kırmak için
Marzhauser MikromanipülatörASIMM33-RMikroenjeksiyon iğnesini manipüle etmek için
Manyetik standMSCSPI - 87242624Mikromanipülatörü
MPPI-3 monte etmek için Picopump kontrol cihazıASIMPPI-3Mikroenjeksiyon hacmini ve zamanlamasını kontrol etmek için
EVOS ters floresan mikroskobuThermoFisherEVOS FLEnjekte edilen embriyoları görüntülemek için
Diseksiyon mikroskobuNikonSMZ745Mikroinjecion AutoCAD
yazılımı AutodeskAutoCAD dosyalarını şuradan indirin: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 ve ZFIN topluluk protokolleri wiki sayfasından: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  
için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish MicroinjectionMicrostructured DevicesEmbryo OrientationImaging ChannelsPDMS BlockHair Loop ManipulationPICO PumpFluorescent MicroscopyOtic VesicleNeutrophil Recruitment

Related Articles