Method Article

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısırlık klinikler beceriksiz yumurta gelişim yetkili vs böylece genel gebelik sonucu artırmak non-invaziv yordamları kullanarak seçmek için yeteneğinden yararlanırlar. Biz son zamanlarda geliştirilen sitoplazmik hareketleri analiz tarafından takip metafaz II sahneye germinal vezikül (GV)--dan onların vitro olgunlaşma sırasında fare yumurtalar, mikroskobik canlı gözlem dayalı bir sınıflama yöntemi hızlandırılmış bu dönemde meydana gelen. Burada, bu yordamın ayrıntılı protokolleri mevcut. Yumurtalar köklerin antral folikül izole ve 37 ° C ve % 5 CO2hızlandırılmış analiz için donatılmış bir mikroskop içinde 15 h için kültürlü. Resimler 8 dk aralıklarla alınır. Görüntüleri hesaplar, her yumurta için sitoplazmik hareket hızları (CMVs) kültür süresince meydana gelen profil partikül imaj velosimetri (PIV) yöntemi kullanılarak analiz edilir. Son olarak, her tek yumurta CMVs gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz %91.03 bir hassasiyetle olmak bir gamet olasılığını öngörür bir matematiksel sınıflandırma aracı (Feed-ileri yapay sinir ağı, FANN), üzerinden beslenir. Bu iletişim kuralı için fare, kurmak, şimdi insanlar da dahil olmak üzere diğer türlerin yumurta üzerinde test olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kadın kısırlığı kadınlar giderek artan sayıda etkiler bir patoloji olduğunu. Dünya Sağlık Örgütü göre çiftlerin % 20 civarında infertil kadın infertilite nedeniyle % 40 ile. Buna ek olarak, kanser tedavisi gören kadınların üçte biri (300.000/yıl ve 30.000/yıl ABD yada İtalya, sırasıyla) erken yumurtalık yetmezliği geliştirmek.

Kanser hastalarında infertilite önlemek için bir strateji yalıtım ve dondurma vitro olgunlaşma (IVM) tarafından takip Onkolojik tedavi öncesi yumurtalık köklerinin GV yumurta MII sahneye (GV MII geçiş) olmuştur. Non-invaziv işaretleri oosit gelişimsel yetki durumu gübreleme ve gelişim süreçleri ve genel gebel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım ve Pavia Üniversitesi, etik Komiteler tarafından kabul edildi. Hayvanlar 22 ° C, % 60'ı hava nemi ve 12:12 saat ışık/karanlık döngüsünü koşullar altında muhafaza.

1. yumurtalık yalıtım

  1. İntraperitoneally 2 dört onbir haftalık CD1 dişi fareler 10 U folikül uyarıcı hormon bir steril 1 mL insülin şırınga ile enjekte.
  2. 46-48 h bekleyin.
  3. Fare tartmak ve 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina ve Zolazepan cloridrate) bir kas içi enjeksiyon ile anestezi. Servikal çıkığı tarafından ötenazi.
  4. Diseksiyon forseps bir çift kullanarak karın duvarı kaplayan deri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 bir temsilcisi gelişimsel olarak yetkili ve beceriksiz oosit sırasıyla (GV) başında ve sonundaki (MII) IVM yordamı gösterir. Köklerin fare yumurta IVM 15 h kültür sırasında oluşur. Hızlandırılmış gözlem mayoz ilerleme kaydeder ve GVBD ve Ekstrüzyon ilk kutup vücudun da dahil olmak üzere önemli segregasyonun olayları algılar.

Analiz ve daha--dan iki - yüz beceriksiz yumurta gelişim yetkili

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir fare yumurta yanı sıra bu diğer türler ile bu iletişim kuralı yaparken dikkat çekmek birkaç kritik adım vardır. Arkadaşı kümülüs ayrılması Tetikleyicileri hücreleri gibi bir zamanlar onların köklerinin yumurtalar hemen kayıt damla aktarılması gerektiğini GV MII geçişin başlangıcını. Olası bir değişiklik mevcut iletişim kuralına COCs yalıtımı için kullanılan M2 orta 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ek olabilir. IBMX hemen GV MII geçiş tetikleyen engeller ve yumurtalar tamamen deneysel grup bir senkronizasyon sağlar........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser tarafından destek sayesinde mümkün yapıldı: Pavia Üniversitesi FRG 2016; Parma Üniversitesi FIL 2014, 2016; ve bu çalışma taşımak için gerekli plasticware temini için Kinesis. Dr. Shane Windsor (Mühendislik Fakültesi, University of Bristol, İngiltere) Cell_PIV yazılım sağlamak için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02Hormonal tedavi
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Oosit heterokromatin boyama için
Hücre kültürü Petri kabı 35 mm x 10 mm Corning 430165COC izolasyonu için
EmbryoMax M2 Ortamı (1X), Sıvı, fenol kırmızısı ileMerck-MilliporeMR-015-DCOC izolasyonu için
MEM Alpha ortamı (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Oosit in vitro olgunlaşma için
Hücre kültürü Petri kabı 35 mm cam tabanlı WillCo GWSt-3522Görüntüleme deneyleri için
BioStation IM-LM NikonMFA91001Canlı hücre tarama sistemi 
Pasteur pipetiDelchimica Scientific Züccaciye6709230Folikül manipülasyonu için
Mineral yağSigma-AldrichM8410Kontaminasyonu ve orta buharlaşmayı önlemek için
Penisilin / StreptomisinYaşam Teknolojileri15070063 Orta kontaminasyonu önlemek için 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichML16141079Makyaj ve alfa için; MEM orta 
L-Glutamin Yaşam Teknolojileri25030Makyaj & MEM orta 
TaurineSigma-AldrichT0625Makyaj ve alfa için; MEM orta 
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA3310Makyaj ve alfa için; MEM ortamı
Sodyum piruvat Sigma-Aldrich  P4562Makyaj ve alfa için; MEM media
Zoletil (Tiletamina ve Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9Fareler için anestezi
Cell_PIV yazılımı Nazikçe Dr. Shane Windsor, Bristol Üniversitesi, İngiltere                             -                             -
MATLABMatematik Çalışmaları, Natick, MA                              -Çok paradigmalı sayısal hesaplama için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles