Method Article

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısırlık klinikler beceriksiz yumurta gelişim yetkili vs böylece genel gebelik sonucu artırmak non-invaziv yordamları kullanarak seçmek için yeteneğinden yararlanırlar. Biz son zamanlarda geliştirilen sitoplazmik hareketleri analiz tarafından takip metafaz II sahneye germinal vezikül (GV)--dan onların vitro olgunlaşma sırasında fare yumurtalar, mikroskobik canlı gözlem dayalı bir sınıflama yöntemi hızlandırılmış bu dönemde meydana gelen. Burada, bu yordamın ayrıntılı protokolleri mevcut. Yumurtalar köklerin antral folikül izole ve 37 ° C ve % 5 CO2hızlandırılmış analiz için donatılmış bir mikroskop içinde 15 h için kültürlü. Resimler 8 dk aralıklarla alınır. Görüntüleri hesaplar, her yumurta için sitoplazmik hareket hızları (CMVs) kültür süresince meydana gelen profil partikül imaj velosimetri (PIV) yöntemi kullanılarak analiz edilir. Son olarak, her tek yumurta CMVs gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz %91.03 bir hassasiyetle olmak bir gamet olasılığını öngörür bir matematiksel sınıflandırma aracı (Feed-ileri yapay sinir ağı, FANN), üzerinden beslenir. Bu iletişim kuralı için fare, kurmak, şimdi insanlar da dahil olmak üzere diğer türlerin yumurta üzerinde test olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kadın kısırlığı kadınlar giderek artan sayıda etkiler bir patoloji olduğunu. Dünya Sağlık Örgütü göre çiftlerin % 20 civarında infertil kadın infertilite nedeniyle % 40 ile. Buna ek olarak, kanser tedavisi gören kadınların üçte biri (300.000/yıl ve 30.000/yıl ABD yada İtalya, sırasıyla) erken yumurtalık yetmezliği geliştirmek.

Kanser hastalarında infertilite önlemek için bir strateji yalıtım ve dondurma vitro olgunlaşma (IVM) tarafından takip Onkolojik tedavi öncesi yumurtalık köklerinin GV yumurta MII sahneye (GV MII geçiş) olmuştur. Non-invaziv işaretleri oosit gelişimsel yetki durumu gübreleme ve gelişim süreçleri ve genel gebelik başarı1,2artıracak.

Supravital fluorochrome Höchst 33342, ile boyama sonra gözlenen onların Kromatin yapılandırmasına göre memeli köklerin yumurtalar bir çevrili çekirdekçik (SN) veya değil çevrili çekirdekçik (NSN)3olarak sınıflandırılır. Onların farklı Kromatin organizasyon yanı sıra yumurta bu iki tür pek çok morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar3,4,5,6,7,8 görüntülemek. ,9onların segregasyonun ve gelişimsel yeterlilik dahil olmak üzere,. Yumurtalıktan izole ve olgunlaştı vitro, her ikisi de yumurta eriþiminden MII sahne yazın ve sonra sperm tohumlama, 2-hücre Sahne Alanı'na geliştirmek, ama sadece bu SN Kromatin kuruluş ile dönem9' a gelişebilir. İyi olmamakla birlikte yetkili vs beceriksiz yumurta seçmek için bir sınıflama yöntemi, en büyük dezavantajı fluorochrome kendisi ve her şeyden önce onun algılama için kullanılan UV ışık hücreleri üzerinde olabilir mutajenik etkisi olduğunu.

Tüm bu nedenlerden dolayı aynı yüksek sınıflandırma doğruluğu korurken Höchst kullanımı yerine olabilir SN veya NSN Kromatin uyum ile ilişkili diğer non-invaziv işaretçileri için aradık. Sitoplazmik hareket hızları (CMVs) hızlandırılmış gözlem bir özellik olarak hücre durumu farklı çıkmaktadır. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda zamanda gübreleme ve fare ve insan zigotları kapasitesi tam Preimplantasyon ve tam dönemlik geliştirme10,11CMVs arasındaki ilişkiyi kaydedilen gösterdi.

Bu daha önceki çalışmalar üzerinde bağlı olarak, biz burada gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta5,6,7,8tanınması için bir platform tanımlamak. Platform üzerinde üç ana adım dayanmaktadır: 1) antral folikül izole yumurta ilk olarak çevrili çekirdekçik (SN) ya da değil-çevrili çekirdekçik (NSN); onların Kromatin yapılandırmasına ya göre sınıflandırılır 2) her tek yumurta GV MII geçişi sırasında meydana gelen CMVs hızlandırılmış görüntülerini alınır ve analiz partikül imaj velosimetri (PIV); ve 3) PIV ile elde edilen veriler ile bir besleme ileri yapay sinir ağı (FANN) kör sınıflandırma12,13analiz edilir. Fareyi test ve diğer memeli türler için (Örneğin, sığır, maymun ve insanlar) kullanılan mevcut hazır yapmak için tasarlanmış yordam en kritik adımları ayrıntılarını ver.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım ve Pavia Üniversitesi, etik Komiteler tarafından kabul edildi. Hayvanlar 22 ° C, % 60'ı hava nemi ve 12:12 saat ışık/karanlık döngüsünü koşullar altında muhafaza.

1. yumurtalık yalıtım

  1. İntraperitoneally 2 dört onbir haftalık CD1 dişi fareler 10 U folikül uyarıcı hormon bir steril 1 mL insülin şırınga ile enjekte.
  2. 46-48 h bekleyin.
  3. Fare tartmak ve 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina ve Zolazepan cloridrate) bir kas içi enjeksiyon ile anestezi. Servikal çıkığı tarafından ötenazi.
  4. Diseksiyon forseps bir çift kullanarak karın duvarı kaplayan deri kavramak. Cilt ve vücut duvar makas çifti ile kesmek ve belgili tanımlık kesme Forseps ile çekerek açın.
  5. Bir çift cımbız kullanarak, cesaret bir yana, rahim boynuzları kesin olarak belirlemek ve onların ekstremite, yumurtalık yerelleştirmek taşıyın.
  6. Yavaşça saatçi forseps kullanarak yumurtalık tutun ve onun bağ rahim kesmek için makas kullanın. Diğer yumurtalık ile yineleyin.
  7. Toplanan yumurtalık içine önceden 37 ° c, % 5 CO2 havada sıcak M2 yalıtım orta 1 mL içeren 35-mm hücre kültür Petri kabına aktarın.
  8. Yağ ve bir stereomicroscope altında iyi makas kullanarak ovidukt kaldırın.

2. izolasyon Cumulus oosit kompleksleri

  1. Antral kümülüs oosit kompleksleri (COCs) pasif serbest kadar steril cımbız ve 1 G steril insülin iğne kullanarak yumurtalık yüzey delik.
  2. Üçten fazla katmanları bir ağız kontrollü el çekti Pasteur micropipette (çapı 200 µm) kullanarak kümülüs hücreleri ile COCs toplamak ve taze M2 orta 300 µL damla aktarabilirsiniz.
  3. Bir el çekti Pasteur micropipette (çapı 80 µm) kullanarak yumurta çevreleyen kümülüs hücreleri yavaşça girip kaç saniye pipetting tarafından kaldırmak,
  4. Kümülüs hücreleri tamamen ortadan kalkar kadar tekrar tekrar yumurta M2 orta 20 µL damla--dan başka bir, aktarabilirsiniz.

3. Kromatin organizasyon tabanlı oosit sınıflandırma

  1. Höchst 33342 boyama çözüm 0,05 µg/mL olarak 5 mg/mL 1 x PBS içinde seyreltilmiş bir anne çözümden M2 orta başlayarak nihai bir konsantrasyon, hazır olun.
  2. 3.5 µL çözüm bir 35 mm Petri kabına kapak altındaki boyama Höchst mikro damlacıkları yerleştirin.
  3. Her tek yumurta bırakma boyama bir Höchst aktarmak, Önceden ısıtılmış (37 ° C) ısıtma yüzeyi üzerine tabak yerleştirin ve ışık Fuar önlemek için karanlık bir kapak ile kapak.
  4. Kuluçka oda sıcaklığında 10 dakika sonra yumurtalar için en fazla 1-2 s ile floresan mikroskop altında UV ışık (330-385 nm), 10 X büyütme, gözlemlemek.
  5. Höchst pozitif Kromatin çekirdekçik çevreleyen bir yüzük varsa yumurta çevrili çekirdekçik (SN) (şekil 1A), sınıflandırmak.
  6. Yumurta onların çekirdekçik Höchst pozitif Kromatin tarafından çevrili değil ve gösterir (şekil 1B) çekirdeği heterochromatic noktalar dağıtmak değil çevrili çekirdekçik (NSN), sınıflandırmak.

4. sinirsel ağ tabanlı oosit sınıflandırma

  1. Dört hazırlamak %5 ısı inaktive fetal sığır serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM taurin, 100 U/mL penisilin, 75 µg/mL streptomisin ve 23.5 µg/µL sodyum pyruvate 35-mm cam içine ile takıma α-MEM orta 2 µL damlacıkları Petri kabına alt ve onlarla kapak Önceden ısıtılmış (37 ° C) ve orta buharlaşma önlemek için önceden dengelenmiş madeni yağ.
    Not: canlı bir hücre-tarama sistemi kullanılıyorsa, damla belirli bir mesafede 7 x 7 mm çizilmiş bir kılavuz bir kılavuz olarak kullanarak kalmasını sağlayın.
  2. Transfer 3 - 4 yumurta her damla için.
  3. Hızlandırılmış kayıt yazılımı ile donatılmış bir canlı hücre-tarama sistemi cam alt Petri kabına yerleştirin ( Tablo malzemelerigörmek, gözlem oosit olgunlaşma dengeli sıcaklık (37 ° C) ve CO2 olan bir ortamda sağlayan) konsantrasyonu (% 5).
  4. Hızlandırılmış kayıt yazılımı açın. Ekranda sol taraftaki oosit ve sağ taraftaki tüm ayar düğmeleri canlı bir atış ile bir pencere görüntülenir.
  5. Ekran Merkezi'nde konumlandırmak için oosit Merkezi'ni seçin. Odağı ayarlayın.
  6. Ph düğmesini seçin ve DIA lamba 192 ayarlayın; pozlama süresi için 1/125 s; kazanmak için 1,99; ve 1600 x1200 Çözünürlük .
  7. FL2 seçin ve DIA lamba 5olarak ayarlayın; pozlama süresi için 3 s; kazanmak için 2.37; ve 1600 x1200 Çözünürlük .
  8. Kültür damla içindeki yumurta konumunu kaydetmek için Yenigelin düğmesini seçin. Kültür damla içinde her yumurta için aynı yordamı yineleyin.
  9. Zaman seçin ve satın alma döngüsü 8 dk ve 15h Toplam süre ayarlayın.
  10. Kayıt döngüsü başlatmak için hızlandırılmış Başlat ' ı seçin.
  11. MATLAB yazılımını açın ve yazmak >>cell_piv; ve PIV aracınıseçin.
  12. Kaydedilmiş filmi içeren klasörü seçin ve tüm görüntü sırası yüklemek için .jpeg dosyalarını seçin. Her yumurta için faiz (ROI) bölgenin alanı aracını seçintıklatarak seçin.
  13. İşlem PIV Dosya menüsünden seçin. Görüntüleyicisi aracı düğmesini seçin.
    Not: Program hız vektörel çizimler içinde yatırım Getirisi hesaplar ve otomatik olarak bir .mat dosyası olarak kaydedilmiş bir veri dosyası oluşturur.
  14. .Mat dosyayı açmak için seçin. Düğmesini seçin ROI aracını seçin ve oosit anahattı çevresinde bir daire çizin. Dosya menüsünde Kaydet'i tıklatın.
    Not: Bu bölgedeki vektörel çizimler, şimdi görüntülenir ve ortalama büyüklükte veri grafik penceresinde bu yeni yatırım Getirisi için güncelleştirildi.
  15. Açık bütün zaman atlama kare toplanan ortalama büyüklükte veri ile kare dizisinin satırları üzerinde ve sütunlar, bir elektronik tabloya analiz her tek yumurta kaydetti.
  16. NSN ve SN yumurta verileri 10 alt grupları düzenlemek.
  17. Besleme-ileri yapay sinir ağı yinelemeli olarak eğitmek için 9 alt grupları kullanın (FANN) ve kör test etmek için 1 alt grubu.
    1. Başka bir yineleyin 9 kez, kör test örnek (10 kat çapraz doğrulama) değiştirme.
  18. MATLAB açın, ana özel komut dosyası çalıştırma ve talebi üzerine, eğitim veri (train.txt), (genellikle, üzerinden analiz edilecek eğitim ve hızlandırılmış aralığı için kullanılan NSN ve SN yumurta sayısı ile dosya adını Ekle # 112-113 Çerçeve çerçeve 1-2).
  19. Eğitim gerçekleştirmek için girmek tuşuna basın.
  20. Sınama verileri (test.txt) ile dosya adını ekleyin.
  21. Vektör test_outputs_cyt MATLAB çalışma alanında açın.
    Not: Bir pencere, ilk satırda, gerçek pozitif (TP veya gerçek NSN) ve yanlış pozitif (FP veya yanlış NSN) NSN ve SN yumurtalar için sırasıyla elde etmek için olasılık gösterilen ekranda görünür; Bunun yerine, ikinci sıra, yanlış negatif (FN veya yanlış SN) ve yumurta, NSN ve SN için doğru negatifleri (TN veya gerçek SN) sırasıyla elde etmek için olasılık.
  22. Formülünü kullanın: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), yüzde ifade edilen FANN doğruluk hesaplamak için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 bir temsilcisi gelişimsel olarak yetkili ve beceriksiz oosit sırasıyla (GV) başında ve sonundaki (MII) IVM yordamı gösterir. Köklerin fare yumurta IVM 15 h kültür sırasında oluşur. Hızlandırılmış gözlem mayoz ilerleme kaydeder ve GVBD ve Ekstrüzyon ilk kutup vücudun da dahil olmak üzere önemli segregasyonun olayları algılar.

Analiz ve daha--dan iki - yüz beceriksiz yumurta gelişim yetkili

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir fare yumurta yanı sıra bu diğer türler ile bu iletişim kuralı yaparken dikkat çekmek birkaç kritik adım vardır. Arkadaşı kümülüs ayrılması Tetikleyicileri hücreleri gibi bir zamanlar onların köklerinin yumurtalar hemen kayıt damla aktarılması gerektiğini GV MII geçişin başlangıcını. Olası bir değişiklik mevcut iletişim kuralına COCs yalıtımı için kullanılan M2 orta 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ek olabilir. IBMX hemen GV MII geçiş tetikleyen engeller ve yumurtalar tamamen deneysel grup bir senkronizasyon sağlar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser tarafından destek sayesinde mümkün yapıldı: Pavia Üniversitesi FRG 2016; Parma Üniversitesi FIL 2014, 2016; ve bu çalışma taşımak için gerekli plasticware temini için Kinesis. Dr. Shane Windsor (Mühendislik Fakültesi, University of Bristol, İngiltere) Cell_PIV yazılım sağlamak için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02Hormonal tedavi
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Oosit heterokromatin boyama için
Hücre kültürü Petri kabı 35 mm x 10 mm Corning 430165COC izolasyonu için
EmbryoMax M2 Ortamı (1X), Sıvı, fenol kırmızısı ileMerck-MilliporeMR-015-DCOC izolasyonu için
MEM Alpha ortamı (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Oosit in vitro olgunlaşma için
Hücre kültürü Petri kabı 35 mm cam tabanlı WillCo GWSt-3522Görüntüleme deneyleri için
BioStation IM-LM NikonMFA91001Canlı hücre tarama sistemi 
Pasteur pipetiDelchimica Scientific Züccaciye6709230Folikül manipülasyonu için
Mineral yağSigma-AldrichM8410Kontaminasyonu ve orta buharlaşmayı önlemek için
Penisilin / StreptomisinYaşam Teknolojileri15070063 Orta kontaminasyonu önlemek için 
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichML16141079Makyaj ve alfa için; MEM orta 
L-Glutamin Yaşam Teknolojileri25030Makyaj & MEM orta 
TaurineSigma-AldrichT0625Makyaj ve alfa için; MEM orta 
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA3310Makyaj ve alfa için; MEM ortamı
Sodyum piruvat Sigma-Aldrich  P4562Makyaj ve alfa için; MEM media
Zoletil (Tiletamina ve Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9Fareler için anestezi
Cell_PIV yazılımı Nazikçe Dr. Shane Windsor, Bristol Üniversitesi, İngiltere                             -                             -
MATLABMatematik Çalışmaları, Natick, MA                              -Çok paradigmalı sayısal hesaplama için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles