Yöntem makalesi

Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

13.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56767

⸱

11 Nisan 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

Bu makalede

Özet

Aşağıdaki iletişim kuralı hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu (STS) birincil kültürünün kurulması üzerinde duruluyor. Bu model bize moleküler arka plan ve bu nadir maligniteler farmakolojik profil daha iyi anlamak için yardımcı ve daha fazla STS yönetimi iyileştirme amaçlı araştırma için bir başlangıç noktası temsil edebilir.

Özet

Yumuşak doku sarkomları (STS) heterojen maligniteler zor tanı, sınıflandırma ve yönetimi ile bir spektrum temsil eder. Bugüne kadar 50'den fazla histolojik alt türlerinden bu nadir solid tümör tespit edilmiştir. Böylece, onların olağanüstü çeşitlilik ve düşük insidansı nedeniyle, bu tümörlerin biyoloji anlayışımız hala sınırlıdır. Hasta kaynaklı kültürler STS patofizyolojisi ve Farmakoloji eğitim için ideal bir platform temsil eder. Böylece tümör numuneler cerrahi rezeksiyon uygulanan hastalardan hasat itibaren STS insan preklinik modeli geliştirdik. STS hücre kültürleri hasta türetilmiş cerrahi numuneler collagenase sindirim tarafından elde edilen ve filtrasyon tarafından izole. Hücreleri sayılır, tohumlari ve 14 gün içinde standart monolayer kültürler için yaptı ve ardından aşağı akım analizi ile. Moleküler veya ilaç analizleri gerçekleştirmeden önce STS birincil kültürler kurulması ile cytomorphologic özellikleri ve, ne zaman elde edilebilir, değerlendirme doğrulandı immunohistokimyasal işaretleri. Bu yöntem 1) bu kötü keşfedilmeyi maligniteler Doğal Tarih çalışmaya ve 2) bir çaba daha fazla eylem mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için farklı ilaçlar etkilerini sınamak için yararlı bir araç temsil eder.

Giriş

Yumuşak doku sarkomları (STS) bir spektrum Mezenkimal kökenli muhasebe bütün solid tümör1,%21'için türdeş olmayan lezyonların içerir ve Yeni Dünya Sağlık Örgütü sınıflandırma 50'den fazla varlığı tanır farklı alt türlerinden3. Bunlar arasında en yaygın histotypes adipocyte sarkomu veya Liposarkom ve Leyomiyosarkom, % 15 ve tüm yetişkin STS, sırasıyla4,%511'i için muhasebe vardır. STS-ebilmek gelişmek vücudun farklı bölgelerinde de, ekstremitelerde ve retroperitoneum % 60 ve % 20 olgunun, sırasıyla6meydana gelen en yaygın siteleri vardır.

Adjuvan ve neoadjuvan kemoterapi faydaları hala pek açık değildir ve yalnızca seçili durumda7' olarak kabul edilir ise lokalize hastalığın tedavisinin geniş cerrahi rezeksiyon, temel taşıdır. Metastatik ortamda kemoterapi standart tedavi ama sınırlı sonuçlar8gösterir. STS moleküler biyoloji daha iyi bir anlayış geçerli ayırıcı tanı geliştirmek, mevcut uygulamaları en iyi duruma getirmek ve tedavisi için yeni hedefler belirlemek için yardımcı olacaktır.

Bu bağlamda, kanser araştırması ölümsüzleştirdi hücre hatları9kullanarak uzun yıllar sahne aldı. Bu deneysel modeller normalde standart monolayer destekler kültürlü veya10 in vivo xenograft modeller kurmak için immünyetmezligi kemirgen implante. Ölümsüzleştirdi hücre hatları ile araştırma deneyler yeterli sayıda gerçekleştirileceği bir yönetilebilir ve mağaza kolay malzeme temsil eder. Onlar, aslında, en ucuz ve en çok kullanılan aracı preklinik çalışmalar11'.

Ancak, hücre bulundurarak kanser modelleri de bazı sınırlamalar var, uzun süreli örneğin pasajlar sayısının artmasıyla birlikte monolayer sistem kültüründe fenotipik indükler ve genetik sürüklenme, hücreleri yapımı daha az muhtemel anahtar tümör özetlemek için özellikleri. Ayrıca, hücre satırı kültürleri hücre hücre etkileşim ve tümörlerin biyolojik davranışını taklit ve tümör microenvironment karakterize sinyal molekülü crosstalk çoğaltmak başarısız. Bu sorunlar preklinik ve klinik sonuçları12arasında varolan boşluğu oluşturmaktadır.

Yukarıda bahsedildiği, birincil kültürler hasta kaynaklı ilgi13artmıştır. Nitekim, kötü huylu ve normal doku eksizyon kanser hücre fenotip ve heterojenlik, böylece daha fazla temsilcisi tümör microenvironment, başlangıç materyali sunan kaybetme riskini azaltır. Ayrıca, cerrahi rezeksiyon uygulanan hastalardan hasat taze tümör örnekler kullanımı tek tümörler araştırmak ve bir hastanın vücut14aynı kısmından farklı lezyonlar karşılaştırmak için bize sağlar. Yukarıdaki nedenlerden dolayı doku kaynaklı hücre kültürleri tümör patofizyolojisi ve Farmakoloji15,16,17, özellikle'STS hangi ticari olarak mevcut sarkomu hücre hatlarında çalışmaya değerli bir malzeme sağlar. sınırlı18' dir. Biz böylece en iyi duruma getirilmiş hasta kaynaklı STS birincil hücre kültürü cerrahi olarak eksize tümör doku13,19,20ila başlayan bir yöntem. Bizim yöntem bir tek hücre süspansiyon elde etmek için gece enzimatik doku ayrılma tarafından takip küçük doku parçaları içine tümör numune disaggregating oluşur. Ertesi gün, Enzimatik sindirim taze kültür medya ekleyerek durdurulur ve elde edilen süspansiyon doku parçaları, hücre-toplamları ve aşırı matris malzeme veya enkaz kaldırmak için filtre uygulanır. Son olarak, bir izole tümör hücreleri cytospinned cam slayda, sabit ve STS birincil kültür kurulması onaylayan cytomorphological, immunohistokimyasal ve Moleküler Sitogenetik değerlendirme amaçlı aşağı akım analizi için depolanan bölümüdür (örneğin balık analizi ile MDM2 amplifikasyon temsil eden standart ayırıcı tanı için iyi farklılaşmış Liposarkom ve dediferansiye Liposarkom) 4. kalan hücrelerin gen ifade profil oluşturma ve farmakolojik çalışmalar için bir standart monolayer kültür içine tohumlari. Tüm deneyler düşük kullanarak gerçekleştirilen belirli kanser subclones seçim önlemek için birincil kültürlerin geçiş ve deneyimli sarkomu patolog tarafından analiz. Biz böylece tamamen insan STS ex vivo modeli13,19,20oluşturduk. Bu çok yönlü, kolay kolu modeli preklinik araştırma, örneğin tanı ve teşhis için yeni moleküler işaretleri veya faaliyet daha derin bir anlayış ve mekanizmaları kazanmak için farklı türleri için yararlı bir araç temsil eder eylem STS yönetiminde kullanılan standart ve yeni ilaçların.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

STS hücreler tümör kütlesini cerrahi hastaların STS ile eksize etkilenmezsiniz. İletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve iyi klinik uygulama yönergeleri ve Helsinki Deklarasyonu göre gerçekleştirilir. Tüm hastalar yazılı çalışmaya katılmak için onay verdi. Cerrahi örnek bir deneyimli sarkomu patolog tarafından analiz ve cerrahi 3 saat içinde işlenir.

1. tümör numune toplama ve işleme:

  1. DMEM düşük glikoz orta parafin film ile kapalı 50 mL 100 mL steril idrar kapsayıcısında bir sarkomu patolog yardımıyla ile tümör örnekler toplamak.
  2. En fazla 3 h 4 ° C'de örnekleri tümör rezeksiyonundan sonra saklamak.
  3. Steril doku kültürü başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. % 70 etanol ile örtünün sterilize ve steril eldiven giymek.
    2. Çelik Inox cımbız % 70 etanol (kullanım steril bir gazlı bez) ile sterilize.
    3. Parafin film idrar kapsayıcıdan kaldır ve atın.
    4. Dış idrar kabı % 70 etanol ile yıkayın.
    5. Kare bir petri açın.
    6. İdrar kabı açın ve tümör örnekler steril çelik Inox cımbız kullanarak kare petri kabına aktarın.
  4. Tümör numuneler PBS ile iki kez yıkayın.
  5. Steril cerrahi neşter açın.
    1. İnce tümör örnekler 1-2 mm3 parçalar halinde bile olmamalı.
    2. Dörtte birini 2 mL tüp içinde toplam örnek toplamak.
    3. 1 mL trizol reaktif (tüp satın) ekleyin ve hemen-80 ° c (örnek aşağı akım analizde STS gen ifade değerlendirme için kullanılacak) dondurma.
  6. İnce rendelenmiş tümör malzeme 15 mL tüp içinde kalan toplamak.
    1. Collagenase 4 mL ekleyin çözüm (4 µg/mL konsantrasyonu PBS içinde çözünmüş collagenase tip) yazın.
    2. Collagenase seyreltik çözüm DMEM yüksek kültür ortamının 4 mL ile yazın (son konsantrasyonu collagenase ben türüdür 2 µg/mL).
    3. 15 mL tüp kapatın ve tutkal ile parafin film.
    4. Çalışırken bir shaker bir kuluçka 15dk sindirimi harekete geçirmek için karıştırma koşullarında 37 ° C'de 15 mL tüp koy.
    5. 15 dakika sonra koşullar gecede oda sıcaklığında karıştırma altında çalışırken shaker tüp depolamak.
  7. Ertesi gün 15 mL tüp steril başlık altında koymak.
  8. Yavaşça hücre süspansiyon 50 mL tüp tepesine bağlı 100 µm steril filtre ile filtre.
  9. Filtre DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile yıkayın.
  10. 100 µm steril filtre atmak, oda sıcaklığında 5 dakika 50 mL tüp ve santrifüj 225 x g de yakın.
  11. Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atmak.
  12. Hücreleri 1-2 mL DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya ile yeniden askıya alma.
    Not: Birimin işlenen tümör örnek miktarına bağlıdır.
  13. Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
    1. Örnek 1:2 trypan mavi'sulandırmak ve seyreltme 10 µL hücreleri saymak için kullanın.
    2. En az iki kez saymak ve hücreleri toplanan toplam ortalama sayısını çoğaltır ortalamasını hesaplamak.
  14. 80.000 hücreler/cm2yoğunluğu bir standart monolayer kültür plaka hücrelerde.
    Not: Her zaman deneylerde denetimleri içerir. En az 3 teknik çoğaltır her koşul için gerçekleştirin. En az 2 biyolojik çoğaltır gerçekleştirin. Preklinik Farmakoloji, gen ekspresyonu ve protein ifade analizleri için deneyler kültür pasajlar düşük bir sayı ile hücre kanser hücre fenotipleri kaybetmemek için tohum, 30-45 gün içinde yapılmalıdır.
  15. Saytolojik numune hazırlama.
    1. DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile takıma 200 µL 100.000 hücreleri toplamak.
    2. Pipet çözüm (200 µL pipet) tek kullanımlık bir huni içine bir filtre ile donatılmış ve bir cam slayt ile monte.
    3. Cytocentrifuge açın ve örnekleri yerleştirin.
    4. 18,6 x g 20 dk için cytocentrifuge çalıştırın.
    5. Filtre ile donatılmış huni atmak.
    6. Slaytları aseton 10 dk 5 min için kloroform ardından fix.
    7. -20 ° C'de slaytları depolama
      Not: Çözülme ve örnekleri boyama önce hidrat ve üreticinin yönergeleri izleyerek boyama gerçekleştirmek. En az 3 teknik çoğaltır hazırlayın.

2. STS hücre kültürleri:

  1. Medya haftada (DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya) değiştirin.
    1. Kültür bir 200-1000 µL pipet kullanarak orta atın.
    2. Yeni taze orta 200-1000 µL pipet kullanarak ekleyin.
    3. Hücre geçiş:
      1. Ne zaman % 90 civarında görkemlidir hücre bağlantısını kesin:
        Not: STS hücre kültür amplifikasyon haftada bir kültür koşullara göre yapılmalıdır.
      2. Orta atmak, PBS ile yıkayın ve tripsin 1 2-3 mL ekleyin PBS x
        Not: Kullanılan tripsin hacmi kültürlü hücreleri elde edilen miktarına bağlıdır.
      3. 3-5 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya
      4. Müstakil hücreleri 200-1000 µL pipet kullanarak plaka toplamak.
      5. 15 mL tüp içine müstakil hücreleri pipette ve DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve enzimatik reaksiyon durdurmak için penisilin/streptomisin % 1 ile 4 mL ekleyin.
      6. 225 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
      7. Süpernatant atmak.
      8. Hücre Pelet 1 mL DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya ekleyerek yeniden askıya alma.
      9. Yeni bir kültür plaka veya üreticinin yönergelerine göre son bir hacim ile bir şişesi hücrelerde tohum.
        Not: Hücreleri 1:3 daha fazla bölünmüş değil.

3. aşağı akım analizleri:

Not: Farklı deneyler çeşitli bu model (aşağıya bakın) kullanarak yürütülen olabilir. Bu, bu nedenle, yeterli sayıda örnekleri ve çoğaltır hazırlıklı hangi analizleri gerçekleştirilen çalışmanın tasarım aşamasında karar vermek önemlidir.

  1. MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür gibi proliferasyon deneyleri
  2. Apoptotik deneyleri terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) gibi (tünel) tahlil etiketleme sonunda nick
  3. İmmunohistokimyasal analizi
  4. Gen ifade analizi
  5. Western blot analizi
  6. ELISA tahlil
  7. Floresans aktif hücre (FACS) analiz sıralama
  8. Vivo xenograft modeli

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması elde edilir ve burada bir örnek bir belirli STS histotype13tarihinde elde edilen sonuçları raporu için basit bir yöntem tasarlanmıştır. Protokol farklı STS histotypes iyi farklılaşmış Liposarkom dahil olmak üzere birincil kültürleri kurulması için kullanılan Liposarkom, myxoid Liposarkom, Pleomorfik Liposarkom farklılaşmamış myxofibrosarcoma, dediferansiye Pleomorfik sarkomu, özü ve desmoid Fi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İyi tanımlanmış preklinik modelleri Tümörlerinin moleküler arka plan aydınlatmak, kötü prognoz tahmin ve kanser hastaları için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için ihtiyaç vardır. Bu yüksek olan heterojen Morfoloji açısından özellikle STS gibi nadir tümörler için önemlidir, saldırgan potansiyel ve klinik davranış STS Biyoloji ve hasta yönetimi21anlayışımızı meydan okuyor. Ayrıca, kullanılabilir birkaç ticari sarkomu hücre hatları bu grup Mezenkimal tümörler18preklinik ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Yazarlar Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM Yüksek GlikozEuroCloneECB7501L
Fetal sığır serumuEuroCloneECS0180D
GlutaminGibco25030-024
Paraformaldehit% 4 sulu çözelti, EM dereceliElektron Mikroskobu Bilimleri157-4-100
Penisilin streptomisinGibco15140122
Triazol reaktifiAmbion Life-Technologies15596018
TripsinEuroCloneECB3052D

Kaynaklar

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hasta kaynakl K lt rKollagenaz SindirimiSitosantrif gasyonFloresan n Situ HibritlemeMDM2 AmplifikasyonuSitomorfolojik zelliklermm nohistokimyasal Mark rlerGen Ekspresyon ProfillemesiSitotoksisite Analizi

İlgili makaleler