Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli
Bu makalede
Özet
Özet
Biomolecules N-glukanlardir için bir ana bilgisayardan uyuşturucu ve lipidler bu teknik analiz eder bu yana matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kullanımı, kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme hızlı bir şekilde, genişledi. Çeşitli örnek hazırlama teknikleri mevcut olmasına rağmen peptidler doku korunmuş formaldehit üzerinden tespit bu tür kitle spektrometrik analizi için en zor sorunlardan biri kalır. Bu nedenle, biz oluşturulan ve ionizable peptidler en fazla alabilme örnek içinde yer alan uzamsal bilgileri korur sağlam bir metodoloji en iyi duruma getirilmiş. Biz de bu maliyet etkin ve basit bir şekilde elde etmek böylece otomatik araçları kullanarak bağlandığınızda oluşabilir potansiyel önyargı veya hazırlık hata ortadan kaldırarak nişan. Sonuçta bir tekrarlanabilir ve ucuz iletişim kuralıdır.
Giriş
Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi (maldı MSI) görüntüleme yirmi yılda1,2biomolecules de dahil olmak üzere bir dizi analiz, bir görüntü dayalı teknik olarak istihdam: lipidler3, peptidler2 ,4, proteinler2,5, metabolitleri6,7, N-glukanlardir8ve tedavi uyuşturucu9,10gibi sentetik moleküller. Bu teknik y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Dikkat: Tüm ilgili güvenlik önlemleri uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (Örneğin, laboratuvar mont, nitril eldiven, koruyucu gözlük, vb) dahil olmak üzere bu yordamı uygularken takip edilmesi gereken
1. hazırlanması reaktifler ve ekipman
-
Çözümler hazırlanması
- Mix Carnoy'nın sıvı 500 mL hazırlamak için % 100 etanol (alkol), kloroform ve buzul Asetik asit 6:3:1 v/v/v oranı temiz cam Schott şişede.
- Sıvı nitroselüloz (NC) yapmak için 40 mg/mL nihai bir konsantrasyon için nazik ajitasyon tarafından düzgün aseton içinde NC membran (western Blot yaygın olarak kullanılan) geçiyor....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Doğru izlediyseniz, bu protokol açıkça olmadan herhangi bir çizik veya diğer deformasyonlar (şekil 1) dokusunun brüt Morfoloji temsil görüntüleri üretir. Doğru gerçekleştirilen numune hazırlama için ideal doğrulama olduğunu molekül olarak değiştirerek farklı fiziksel yapıları birbirinden ayırt yeteneği (Şekil 2) izlendi.
Örnekleri yanlış hazırlanan varsa belirlemek için.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol analitler delocalization ortadan kaldırılması sırasında üretimi ionizable moleküler türlerin en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. En önemli faktörler örnek sindirerek ya da süblimasyon24sonra recrystallizing matris, uygularken aynı geçersiz kılma kuralı kullanarak içerir; Yani, bu buharı, hatta bir birikimi matris veya aksi durumda, oluşturulan saklanır ve gereken. Rekristalizasyon ve sindirim, eşit altında örnek için solvent yıkama pipetting başka bir yerde daha fazla solvent b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir çıkar çatışması veya ifşa etmek ticari faiz yazarlar var
Teşekkürler
Yazarlar bu iş onların doktora burs programı sayesinde Alzheimer hastalığı araştırma ve PKW için layık bir ark keşif hibe (DP160102063) parçası finansman için Sydney Tıp Okulu Vakfı ve Blues ve Vakfı kabul etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | Doku hazırlığı ve kesiti için. |
| İndiyum Kalay Oksit Mikroskobu slaytlar | Bruker | 8237001 | Doku hazırlığı ve kesiti için. |
| Coplin Kavanozları | Sigma Aldrich | S5516 | Doku hazırlığı ve kesiti için. |
| Düdüklü Tencere | Kambrook | KPR620BSS | Doku hazırlığı ve kesiti için. |
| Süblimatör | Kimyasal Cam | NA | Süblimasyon prosedürü için. Tasarım olarak CG-3038'e benzer, ancak özel olarak üretildi |
| Kum banyosu | NA | NA | Süblimasyon prosedürü için. İnce dereceli nehir kumu, katlanmış alüminyum folyoda tutulur, dışarıdan temin edilir, belirli bir şirketten değil, |
| Cam Petri Kabı | Sigma Aldrich | CLS70165100 | Süblimasyon prosedürü için. |
| Süblimasyon | NA | NA | . Eski bir kütle spektrometresinden yedek parça olarak temin edilmiştir. |
| Süblimasyon prosedürü için | soğuk tuzak | Kimyasal Cam | CG-4510-02 |
| Sıcak Tabak | John Morris | EW-15956-32. | Süblimasyon prosedürü için. |
| Süblimasyon prosedürü için | plastik petri kabı | Sigma Aldrich | Z717223 |
| 37 & derece; C inkübatörü | NA | NA | Süblimasyon prosedürü için. Uygulanamaz, kuvöz steril değildir ve 30 yaşın üzerindedir. |
| Kurutma kağıdı | Sigma Aldrich | P7796 | Süblimasyon prosedürü için. |
| Nitroselüloz | Sigma Aldrich | N8395 | Slaytların yıkanması için. |
| Aseton | Sigma Aldrich | 650501 | Slaytların yıkanması için. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | Slaytların yıkanması için. |
| % 100 EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | Slaytların yıkanması için. |
| % 70 EtOH | Sigma Aldrich | NA | Slaytların yıkanması için. % 95 stok etanolden laboratuvarda üretilmiştir ve nbsp; |
| Kloroform | Sigma Aldrich | C2432 | Slaytların yıkanması için. |
| Buzul Asetik Asit | Sigma Aldrich | ARK2183 | Slaytların yıkanması için. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | . 1M'ye kadar yapılan toz ve ardından %32 HCl ila PH 8.8 |
| Milli Q Ultra Saf Su | ile dengeleme Sigma Aldrich | NA | Proteolitik bölünme için. Proteolitik bölünme için sartorious su arıtma sistemi |
| Amonyum Birkarbonat | Sigma Aldrich | A6141 | arıtma. |
| Proteolitik bölünme için | Tripsin | Sigma Aldrich | T0303 |
| kristalleştirme için | CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 |
| Asetonitril | Sigma Aldrich | 1.00029 | Yeniden kristalleşme için. |
| Trifloroasetik Asit (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Yeniden kristalleşme için. |
Kaynaklar
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
