Yöntem makalesi

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

8.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56780

⸱

20 Şubat 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Bu makalede

Özet

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Özet

Onlar birçok insan hastalıkları içinde yer alan ve terapötik müdahale için iyi doğrulanmış hedefleri içerir gibi ilaç endüstrisi için büyük önem G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır. Keşif kurşun bileşikleri, özellikle reseptör'ın işlevi inhibe, küçük sentetik moleküller de dahil olmak üzere uyuşturucu gelişiminde önemli bir ilk adımdır ve hassas, belirli ve güçlü hücre tabanlı deneyleri üzerinde dayanır. Burada, biz Kinetik bir hücresel tahlil ile öncelikle CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) etkinleştirme uyarılmış intrasellüler Ca2 + serbest inhibe özel reseptör antagonistleri tanımlamak için tasarlanmış bir floresan okuma tarafından açıklamak onun endojen ligand CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12). Ayrıca tarama Iç agonistik özellikleri (örneğin, intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu yokluğunda CXCL12 bir artış alabilme bileşikleri) veya bileşikler ile donatılmış bileşiklerin sağlar Bu yöntemin önemli bir avantajı olduğunu reseptör'ın işlevi allosteric bağlayıcı siteleri ile etkileşim yoluyla oransal (Yani, pozitif ve negatif allosteric modülatörler (PAMs ve NAMs, sırasıyla)). Aşağı tarafta, autofluorescent bileşikler böylece güvenilir veri yorumu engelleyici tahlil'ın okuma ile etkileşebilir. Büyük olasılıkla bu tahlil, en az uyarlamalar ile jenerik ilaç keşif tahlil için birçok diğer GPCRs hangi bir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak için belgili tanımlık harekete geçirmek yol olarak uygulanabilir.

Giriş

GPCRs önemli bir üst aile cep yüzey proteinlerin sinyal iletim cascades ekstraselüler ligand taşıması üzerine harekete geçirmek vardır. Çeşitli hücre içi sinyal yolları ve sonunda biyolojik yanıt-e doğru1,2 başlatma sonuçları uyaranlara peptidler, protein hormonlar, Biojenik aminler ve lipidler, dahil olmak üzere büyük bir çeşitlilik tarafından etkinleştirilebilir . Ayrıca, GPCRs birçok, eğer tüm, gelişimsel ve fizyolojik süreçler söz konusu ve birçok insan hastalıkları işlevsiz GPCR sinyal veya reseptör overexpression ile ilişkilidir. GPCRs bu nedenle tıp1,3en doğrulanmış farmakolojik hedefler arasında bulunmaktadır.

Genellikle, küçük moleküller, Monoklonal antikor ve belirli bir GPCR etkinlik modüle peptidler gibi bileşiklerin kimliği etkinleştirme hücresel tarama deneyleri GPCR ilaç keşif iş akışı başlar. GPCR ilaç keşfi, böyle bileşikler için aramak için farklı türlerde deneyleri mevcut olan en orta - için yüksek-den geçerek tarama kampanyaları ile uyumludur. En çok kullanılan deneyleri reseptör bağlama deneyler, dahil floresan veya ışıldama göre sözde ikincil haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (AMP)), fenotipik düzeyde dalgalanması tespit deneyleri tarama testleri ve β-arrestin işe alım deneyleri4. Tahlil belirli bir türü için seçim birden fazla faktöre bağlı olabilir, ama aynı zamanda belirli bir GPCR sinyal özellikleri ile ilgili ön bilgi tarafından belirlenir. Bir GPCR bağlama agonist guanidin nükleotittir (GSYİH) guanidin trifosfat (GTP) için exchange katalizlerler konformasyonal değişim α-alt heterotrimeric G protein neden olmaktadır. Daha sonra Gα-GTP alt birimi Gβγ alt birimi ayrışıp ve her iki alt birimleri daha fazla sinyal yolları başlatacaktır. Hidroliz GTP-molekül ve sonraki yeniden Derneği Gα- GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein onun etkin olmayan uyum5,6geri yükler. Dayalı sıra Gα alt birim benzerliğini G proteinlerin farklı türleri tanımlanmıştır (Gs,benG, Gq, G12/13)7. Via Gα sinyal alt birimi verir artış artış gibi birkaç tipik yanıt için (Gs) veya (Gben) siklik AMP üretim ve intrasellüler Ca2 + seferberlik (yolu ile Gq) azaltmak5 ,7. Gβγ alt birimleri Ayrıca hücre içi efektör yolları ikna edebiliyoruz. Örneğin,benG aktivasyonu üzerine-eşleşmiş GPCRs, Gβγ doğrudan fosfolifaz açıklaması, Ca2 + hücre içi mağazaları7 tetikleyen C (PLC-β) inositol trifosfat (IP3) üretmek için teşvik . Reseptör aktivasyonu, β-arrestins ile etkileşimi teşvik GPCR kinaz (GRKs) tarafından GPCRs fosforile. Bu işlem G protein sinyal sonlandırır ve reseptör duyarsızlaştırma ve sonunda içselleştirilmesi yol açar. Β-arrestins da diğer sinyal yolları8sinyal G protein bağımsız tetikleyebilir çok moleküler komplekslerin oluşturmak edebiliyoruz.

Kemokin reseptörleri, Gbenalt familya içinde-eşleşmiş CXCR4 çok ilgi ilaç keşfi için umut verici hedef olarak yükseltti GPCR olduğunu. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) 1 için büyük bir co reseptör olarak kurulan rolünü verilen viral giriş ve enfeksiyon, CXCR4 hedefleme bileşikler başlangıçta Anti-HIV ilaç adayları9olarak geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kanıt büyüyen bir vücut için önemli bir rol CXCR4 için yapım o iyi doğrulanmış bir terapötik hedef Onkoloji de tumorigenesis ve kanser metastaz içinde10işaret etmiştir. CXCR4 son derece insan kanseri ve denetimleri tümör hücre sağkalım, nükleer silahların yayılmasına karşı ve geçiş yanı sıra angiogenez tümör ile ilgili10yirmiden fazla türünde de ifade edilir. Farklı kimyasal sınıfların CXCR4 antagonistleri daha önce açıklanan11,12, ama sadece küçük molekül AMD3100 şu anda Lenfoma tedavi sırasında kullanılan kök hücre seferberlik ajan olarak klinikte kullanımı için onaylanan olmuştur ve Miyelom hastaları13,14. Klinik çalışmalarda emniyet ve birkaç diğer CXCR4 antagonistleri farklı insan hastalıkları, ama Onkoloji12güçlü bir odaklanma ile etkinliğini değerlendirmek için devam etmektedir. Birçok potansiyel uygulama CXCR4 antagonistleri için göz önüne alındığında, geliştirilmiş farmakokinetik özellikleri, Gelişmiş bioavailability veya potansiyel olarak daha az yan etkileri ile roman bileşikler için arama garanti kapsamındadır.

Burada, Kinetik bir floresan tabanlı hücresel tahlil için öncelikle kullanılan ekran CXCR4 inhibe yeteneğine sahip bileşikler için açıklanmıştır. Bu yöntemin floresan ölçüm CXCR4 harekete geçirmek onun endojen agonist Kemokin ligand (stromal hücre türetilmiş gibi faktör 1α (eski adıyla CXCL12 tarafından uyarılmış intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu geçici artış dayanır SDF1-α)) ve bu CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt tarafından belirli bileşikler potansiyel inhibisyonu. Bu tahlil U87 insan glioblastoma hücreler stabil insan CXCR4 reseptör ifade kullanılır. Aynı zamanda, bu hücreler CXCR7, ayrıca CXCL1215,16,17bağlar ilgili Kemokin reseptör endojen ifade eksikliği. CXCR7 daha önce de heterodimers CXCR4 ile şekillendirme yeteneğine sahip olması dolayısıyla bu ikinci reseptör18sinyal özelliklerini oransal gösterilmiştir. Düzeyi tarafından CXCR4 aracılı hücre içi Ca2 + dalgalanmalar CXCR4 yükleyerek izlenir+ hücreleri ile fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, bir hücre geçirgen yüksek afinite floresan Ca2 +-boya bağlama. Fluo-2 490 heyecanlı bir tek dalga boyu floresan molekül olduğu kendi emisyon Floresans 520 ölçülür ise nm nm. Ca2 + bağlama, büyük bir Dinamik Aralık arasında Ca2 +ile üzerine bu emisyon Floresans artırır-bağlı ve devlet ilişkisiz. Floresan sinyal artış geçicidir, birkaç dakika, bir zaman aralığında meydana gelen ve daha sonra çürük. Floresan emisyon daha fazla ilişkilendirir pik yüksekliği reseptörü harekete geçirmek düzeyine sahip. Tahlil kendisi tahlil pipetting adımları standardizasyonu sağlayan entegre bir pipetting sistem sahip bir yoğun CCD (ICCD) kamera ile donatılmış bir floresan Mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) . Buna ek olarak, aynı anda bir Mikroplaka bütün Wells floresan sinyal kullanılır Floresans okuyucu bir diğer önemli avantajı ölçümdür. İlk soruşturma (örneğin, sabit bir konsantrasyon veya bir seyreltme dizisinde küçük moleküllerin bir panel) altında bileşikler fluo-2 AM eklendi tahlil bir parçası CXCR4 yüklenen+ U87 hücreleri tarafından izlenen bir ~ 10 dk kuluçka dönemi sırasında gerçek zamanlı olarak sürekli bileşikler potansiyel agonistik etkisi ölçülür. O zaman, endojen agonist (örneğin, CXCL12) hücrelere bir CXCR4 aracılı geçici düzeyinde artış intrasellüler Ca2 +uyandırmak eklenir. Bu testin bir parçası sırasında test edilen bileşiklerin potansiyel antagonistik etkinlik değerlendirilebilir. Tahlil'ın genel iş akışı şematik bir bakış şekil 1' de sunulmuştur.

Bu Ca2 + seferberlik tahlil öncelikle tanımlamak ve rekabetçi CXCR4 antagonistleri (Yani, bağlama ve reseptör teşvik endojen agonist önlemek bileşikler), inhibitör potens belirlemek için yolculuklarında uygulanmış olsa o da reseptör agonistleri belirleyebilir ve buna ek olarak, maddeler ve birleşimler işlevlerine göre bağlama (Yani, arazi endojen agonist tarafından işgal orthosteric bağlama site farklı siteleri) allosteric sitelerdeki uygulamayın. Allosteric agonistleri ve PAMs ve NAMs19,20ikinci kategoriye bileşiklerin örnekleridir. NAMs yanı sıra özel reseptör antagonistleri CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibe ise, PAMs bu yanıtı artıracak (Ayrıca bkz: tartışma bölümü). Tahlil burada özellikle hedefleri CXCR4 açıklanan rağmen bu yöntem en az optimizasyonu çaba ile diğer GPCRs için en az uygulanabilir öngörülmektedir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak yolu ile isaret edersem.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Bölüm 1 ve 2 altında açıklanan tüm adımları laminar akışı kabine steril koşullarda yapılmaktadır.

1. U87 bakım. CD4.hCXCR4 hücreleri

  1. T75 kültür şişeler 37 ° C ve % 5 CO2 oksijen kuluçka hücrelerinde büyür.
    Not: Bu protokol için kullanılan vitro hücre kültürünü stabil küme 4 farklılaşma (CD4) ve insan ifade bir U87 glioblastoma hücre çizgidir CXCR4 ve yukarıda açıklanan17oldu. CD4 ve CXCR4 hücre yüzey ifade sürekli Akış Sitometresi tarafından takip ve ifade düzeyleri zaman içinde sabit kalır (~ % 100 CD4+ ve ~ %100 CXCR4+ hücreleri). Kullanılan hücre ve reseptör ifade düzeyleri araştırmak için Akış Sitometresi yordamı üretimi ayrıntılı bir açıklamasını bu protokol kapsamında değil.
    1. Alt kültür hücreleri % 80-85 confluency. Hücre kültürü çalışmalarının daha önce oda sıcaklığında (RT) ulaşmak tüm reaktifler izin.
    2. Hücrelerdeki şartına kültür orta kaldırmak ve hücre monolayer kez 5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın.
    3. 3 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve eşit olarak hücre monolayer dağıtın. Ardından tripsin-EDTA fazlalığı kaldırmak ve hücreleri ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de 5 dakikaya kadar kuluçkaya.
    4. 10 mL taze tam büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) + %10 Fetal sığır Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + uygun seçimi aracıları) ekleyin. Hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından resuspend. Hücre süspansiyon steril 50 mL tüp aktarın.
    5. Seçtiğiniz yöntemi kullanarak hücrelerin sayısını saymak. U87 glioblastoma hücreleri söz konusu olduğunda, genellikle canlılığı ulaşır ~ % 100.
      Not: Hücre sayıları çeşitli şekillerde belirlenebilir. Trypan ( Tablo malzemelerigörmek) Boyama mavi dayalı bir otomatik hücre analiz sistemi düzenli olarak kullandığımız standart yordamlar, ancak diğer terbiye işleme göre eşit derecede iyi çalışması gerekir.
    6. 2 x 106 veya 3 x 106 () hücrelerin 25 mL taze büyüme aracı olarak bir T75 kültür şişesi son hacmi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
      Not: 3 x 106 hücreler kullanılır hücreleri % 80-90 confluency 2 gün sonra ulaşacak. 2 x 106 hücre kullandıysanız, aynı confluency 3 gün sonra ulaşacak. Diğer hücre hatları kullandıysanız hücrelerin büyüme oranı ilk ampirik olarak tespit edilmelidir.

2. Ca2 + seferberlik tahlil için tohum hücrelerini

  1. Hücre ceket siyah duvarlı polistren 96-şey plakaları ve netlik (0 gün), passaging gününde % 0,1 jelatin çözüm ile hücre eki kolaylaştırmak için (bkz. Tablo reçetesi) alt.
    Not: Eğer piyasada bulunan (bakınız Tablo reçetesi) olan ön kaplamalı plakalar, kullanılan jelatin ile 96-şey plakaların kaplama ihmal. Bu iletişim kuralı ile devam etmeden önce soruşturma altında her hücre satırı yerine el ile kaplama ön kaplamalı plakalar kullanımına değerlendirmek için tavsiye edilir.
    1. Jelatin çözüm 100 mL % 1 çözüm elde etmek için PBS 1 g jelatin ekleyerek hazırlayın. Tarafından daha fazla kullanımdan önce PBS ile 10 x oranında seyreltin. Jelatin çözünürlük artırmak için çözüm ile 37 ° c ısı
    2. 100 µL % 0,1 jelatin çözüm bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plaka kuyu başına ekleyin. Dik 2 h için kuluçkaya
  2. Bu arada, hücreleri kaplamalı 96-şey plaka tohum için hazır olun.
    1. Kültür şişeye hücrelerden ayırmak, onları taze büyüme aracı olarak resuspend ve bunları kabul trypan yöntemi boyama mavi kullanarak.
    2. Spin aşağı 50 mL tüp RT. de 400 x g, 5 min için hücrelerde
    3. Taze büyüme orta hücrelerde resuspend (DMEM + %10 FBS + % 1 HEPES, hiçbir antibiyotik) x 106 (uygun) hücre/mL 0.1 hücre yoğunluğu elde etmek için.
  3. Jelatin çözüm açık alt siyah duvarlı pilakalar plaka üzerinde saygısız ve bir doku üzerinde kurutma tarafından kaldırın. 200 µL/iyi aşırı jelatin kaldırmak ve plaka üzerinde yeniden çevirmek için PBS ekleyin.
  4. Jelatin kaplı 96-şey plaka bir kuyu başına 200 µL (0.2 x 105 hücreleri karşılık gelen) hücre süspansiyon dağıtmak (şu andan itibaren bir tabak daha fazla için "ölçüm plaka" ifade edilecektir).
  5. Gece saat 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.

3. yükleme ile bir floresan Ca2 + hücre-hassas boya

  1. Gün 1 numaralı seribaşı hücre ile floresan Ca2 +yükleme ile başlayan gerçek Ca2 + seferberlik tahlil, gerçekleştirmek-bağlama boya fluo-2 AM.
    1. Tahlil arabellek 40 mL HEPES (1 M) ekleyerek 200 mL Hank'in dengeli tuz solüsyonu için (HBSS, 10 x, yok fenol red, hiçbir sodyum bikarbonat) hazırlayın. 2 L son hacmi edinmek ve 4 g sığır Serum Albumin (BSA) eklemek için ultrasaf su ekleyin. BSA manyetik karıştırma üzerinden geçiyoruz. PH 7,4 (NaOH ile) için ayarlamak ve çözüm filtre.
      Not: tüm aşağıdaki adımları sırasında "tahlil tampon" anılacaktır aynı arabellek kullanılır.
    2. Stok çözeltisi (Dimetil sülfoksit (DMSO) 4 mM) floresan Ca2 +hazırlamak-duyarlı boya fluo-2 AM. Işığa karşı aşırı maruz kaçının. 1 mg fluo-2 dağıtılması AM (Moleküler ağırlığı: 1,061 g/mol) 235,6 µL DMSO içinde.
    3. Fluo-2 AM çalışma çözeltisi hazırlamak. Bir 96-iyi tahlil plaka için 12.5 µL fluo-2 AM hisse senedi çözüm (4 mM) ve 12.5 µL Nonyonik yüzey aktif Poliol (örneğin, pluronic f-127) çözüm mix (%20 ağırlık/hacim DMSO, bkz: Malzemeler tablo). Bu karışımdan 22 µL 11 mL tahlil arabellekte bir 15 mL tüp ekleyin. Son fluo-2 AM 4 µM bölgedir.
      Not: Nonyonik yüzey aktif fluo-2 AM ve sonuç hücre yükleme geliştirmek için sulu çözünürlük artırmak için dispersiyon ajanı kullanılır. Yüzey aktif DMSO içinde solubilize için örnek 37 ° C ve karışımı düzenli olarak homojen bir çözüm elde etmek için ısı.
    4. Büyüme orta 96-şey ölçüm plaka daha önce sağlanan hücrelerden plaka üzerinde saygısız ve bir kağıt havlu kurutma çıkarın.
    5. Boya çözüm bir çok kanallı pipet kullanarak iyi başına yükleme 100 µL ekleyin ve karanlıkta, RT 45 dk için kuluçkaya.

4. Kemokin Ligand CXCL12 veya soruşturma altında bileşikler içeren hazırlanması 96-şey polipropilen levhalar

  1. Yuvarlak alt polipropilen (PP) 96-şey tabak ( Tablo malzemelerigörmek) edinin.
    1. CXCL12 hisse senedi çözüm izin (1 mg/mL) ve RT. equilibrate izlemeye bileşiklerin hisse senedi çözüm
      Not: CXCL12 hisse senedi çözüm %0.01 Tween20 ile desteklenmiş ve tek kullanımlık aliquots-20 ° C'de depolanan ultrasaf su hazırlanır.
    2. 5 x CXCL12 konsantre çözüm içinde tahlil tampon hazırlamak (31,25 eşit 250 ng/mL nM) ve 5 x konsantre seyreltme her bileşik (içinde tahlil tampon).
    3. Önceden tanımlanmış plaka düzen göre uygun 96-şey plaka içine stok çözümleri dağıtmak. 75 µL/iyi içinde CXCL12 içeren plaka dağıtmak ("Kemokin plaka"), 50 µL/iyi içinde bileşikleri ("bileşik plaka") içeren plaka dağıtmak.
      Not: Her ikisi de bileşikleri ve nihayet olmak CXCL12 olacak seyreltilmiş ölçüm plaka dağıtımı üzerine 5 x. Negatif kontrol wells bileşik plaka yanı sıra, hem Kemokin plaka arabellekte sadece tahlil içeren eklemek önemlidir. Ayrıca pozitif kontrol wells dahil edilmesi gerekir (Yani, kuyuları CXCL12 Kemokin plaka ile ama tahlil arabelleği bileşik plaka karşılık gelen Wells ile).

5. iletişim kuralı ayarları Floresans Mikroplaka okuyucu

Not: Bu protokol için kullanılan Floresans Mikroplaka okuyucu Malzemeler tablobaşvurulur.

  1. İlk floresan plaka okuyucu soğutucu birimi kapatın ve floresan okuyucu kendisi açın. Birkaç dakikalığına başlatmak ve sistem yazılımı açık bırak.
  2. Tahlil'ın Protokolü aşağıdakileri içerir sürükle ve bırak menüsünü kullanarak oluşturun:
    1. "Ayarlar" kutusunda, 'Read_Mode' uyarma dalga boyu ile seçin: 470-495 nM; emisyon dalga boyu: 515-575 nM.
      Not: Seçilen dalga boyu ile Ca2 +kullanım için uygundur-hassas boya fluo2.
    2. Aygıtın kaynak 2 konumunda koyacağız bileşik plaka, bileşiklerin otomatik karıştırma için ise "Mix ile TF" (transferi sıvı) kutusu içerebilir (bkz. Adım 6.4). Çözüm 15 µL her şey otomatik olarak emişli ve üç kez karışık için seçin. Pipet ipuçları, sıvı yüzeyinin altında 20 µL yüksekliğini ayarlayın. Aspirasyon ve 50 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
      Not: Pipet ipuçları yüksekliğini pipet İpuçları altında yaptı birimi anlamına gelir. Bileşik bir tabak kuyu 50 µL içeriyorsa, örneğin, 30 µL yüksekliğini sıvı yüzeyinin altında 20 µL karşılık gelir. Karıştırma sırasında bileşik çözüm mix için geçen, karıştırma hızı, pipet konumunu hacmi ipuçları ve döngüleri karıştırma sayısını tüm belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanılarak ayarlanabilir.
    3. O 20 µL her "Sıvı Transfer" kutusunda tanımlayın bileşik plaka kuyudan ölçüm plaka transfer. Pipet ipuçları 20 µL pozisyon sıvı Yani, Yükseklik 30 µL bileşiklerin aspirasyon sırasında ve yükseklik 60 µL ölçüm plaka dağıtımı sırasında yüzey. Aspirasyon 50 µL/s hızı ve 25 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
      Not: Bileşik plaka çözüm iyi başına 50 µL içerir (bkz. Adım 4.1.3), 30 µL yüksekliğini bir pozisyon 20 µL sıvı yüzeyinin altında böylece karşılık gelir. Ölçüm plaka başına iyi tahlil arabellek 80 µL içerir (bkz. Adım 6.3), böylece 60 µL yüksekliğini ipuçları benzer bir konuma karşılık gelir.
    4. "Okuma ile TF" düğmesini seçin. İlk aralığında 10 okuma bileşikler ölçüm plaka dağıtımı önce kaydedilir ve daha sonra 50 okur 1 s. tanımla okuma aralığı süresi ile 60 okuma (floresan ölçüler) seçin. 30 okuma aralığı süresi ile ikinci aralığı tanımlamak s ve 18 defa okundu.
      Not: Bu adımı sırasında Floresans kinetically (tanımlanmış zaman aralıklarında) için ölçülen olacak ~ toplam 10 dak.
    5. "Yıkama İpuçları" düğmesini iletişim kuralında dahil üç kere. Her yıkama adım içinde sıvı türünü seçin: sıvı (ultrasaf su) ya da sıvı B yıkama döngüsü (1), pompa sayısı (% 70 etanol), hız (hızlı) ve vuruş (5) her boyunca sayısı adım yıkayın.
      Not: İlk ve son yıkama adım akıcı A, B kullanılan ikinci yıkama adım sıvı sırasında kullanılır.
    6. "Pause Pipettor" işlevi bulunur. 300 için duraklatmak için pipettor ayarla s.
      Not: Bu adım iletişim kuralında dahil ederek, Floresans plaka okuyucu cihazda entegre edilmiştir, pipettor baş 5 min için protokol devam etmeden önce duraklatılır.
    7. Aygıtın kaynak 3 konumda yerleştirilmiş olacaktır Kemokin plaka, CXCL12 çözümünde otomatik karıştırma sağlamak için "Mix ile TF" kutusunu içerir (bkz. Adım 6.4). Çözüm 15 µL her şey otomatik olarak emişli ve üç kez karışık için seçin. Aspirasyon ve karıştırma sırasında pipet ipuçları 20 µL sıvı yüzeyinin altında yerleştirin. Aspirasyon ve dağıtımı hız 50 µL/s ayarlanır.
      Not: Bu parametreler benzer adım 5.2.2 gelince, ayarlanabilir.
    8. Sonraki "Sıvı Transfer" kutusunda her 25 o µL tanımlayın de Kemokin plaka ölçüm plaka aktarılır. Pozisyon 20 µL ipuçları sıvı Yani, yüksekliği 55 µL 75 µL/iyi içerir Kemokin plaka aspirasyon sırasında yüzey (bkz. Adım 4.1.3) ve yüksekliği 80 µL ölçüm plaka dağıtımı sırasında. Aspirasyon 50 µL/s hızı ve 25 µL/s dağıtım hızını ayarlayın.
    9. "Okuma ile TF" düğmesi ekleyin. İlk aralığında 5 okuma CXCL12 ölçüm plaka dağıtımı önce kaydedilir ve daha sonra 140 okur 1 s. tanımla okuma aralığı süresi ile 145 okuma seçin. 6 s seçeneğini belirleyip bir okuma aralığı süresi ile ikinci aralığı tanımlamak 20 defa okundu.
      Not: birlikte, ele alındığında boyunca tüm protokolünün 243 okuma (floresan ölçüler) kaydedilir: adım 5.2.4'ten ve 165. adımı 5.2.9 78.
    10. 5.2.5 adım, "ipuçları yıka" düğmesi dahil üç kere protokol için benzer.
      Not: Protokolü'nün sonunda bu adım dahil ipuçları ipuçları değiştirmek gerek kalmadan başka bir tahlil gerçekleştirmek için yeniden kullanılabilir sağlar.
  3. Cihazın sıcaklık 37 ° C'de "sahne sıcaklık ayarla" düğmesini tıklatarak ve 37 ° c seçerek ayarlayın

6. çalışan Floresans tahlil

  1. Ölçüm sonra plaka 45 dk için arabellek yükleme ile inkübe (bkz. Adım 3.1.5), plaka üzerinde saygısız tarafından arabellek kaldırmak ve bir doku üzerinde kuru.
  2. 150 µL/iyi tahlil arabelleği ekleyerek numaralı seribaşı hücreleri yıkama ve 2 min için kuluçkaya.
  3. Arabelleğin yeniden plaka üzerinde saygısız kaldırın. 80 µL/iyi tahlil arabelleği çok kanallı pipet ile ekleyin.
  4. Tüm plakaları uygun konumlarına cihazın içine koymak: 2 kaynağı konumundaki bileşik plaka, kaynak 3 pozisyonda Kemokin plaka ve ölçüm plaka okuma konumunda. Bir kutu siyah ipuçları kaynak 1 ipuçları konumda koy. Cihazın kapıyı kapat ve 5 min için protokol devam etmeden önce kuluçkaya.
  5. Plaka üzerinde arka plan göreli ışık birimleri (RLUs) ve floresan farkı belirlemek için "İletişim kuralı sinyal testi" düğmesini seçin. Yeni bir pencere açılır. "Sinyali Test" seçin.
    Not: Bu adım sırasında arka plan RLUs floresan okuyucu cihazın optik bölme entegre ICCD kamera tarafından belirlenir. Bu RLUs Ca2 +uyarma neden-hassas boya (fluo-2) ışık yayan diyotlar (LED'ler) tarafından (LED çıkış dalga boyu 470-495 nm). 8.000-10.000 RLUs değerleri de bu uygulama için uygundur. RLUs gerekirse, uyarma yoğunluğu (Exc. yoğunluğu seçin) veya kamera kapıyı (seçin kapısı açık) değiştirerek adapte edilebilir. Varyans plaka üzerinde ideal % 7.5'den az olmalıdır.
  6. 8.000-10.000 RLUs arka plan değerlerini elde edilen "Update" seçin. Ana protokol kaydetmek için Kaydet düğmesini tıklatarak.
    Not: Böylece, protokolü sinyali test ayarlarından ana protokole devredilmesini.
  7. Tahlil "Çalıştır" düğmesine basarak çalıştırın.

7. veri analizi ve kalite

  1. Tahlil tamamlandıktan sonra sistem yazılım "Analiz" kutusunu açın.
    1. "Düzeltmeleri yapılandırmak" ve "yanıt Bankası hattı üzerinden" seçmek için gidin. Temel ölçüm 1 ve 5 ölçüm sonunda başlatmak için hat 1 tanımlamak; ortalama Floresans her iyi ölçüm 1 ile 5 arasında hesaplanır.
      Not: Belirli bir gelen tüm daha fazla ölçüleri de bu şey özel taban çizgisinin 1 tarafından ayrılır.
      1. Temel ölçüm 78 ölçüm 83 kadar başlatmak için hat 2 tanımlamak (CXCL12 ölçüm 83 sonra reçete; yine ortalama Floresans her şey arasında ölçüm 78 ve 83 ve bu düzeltme faktörü takip tüm ölçümler için uygulanan hesaplanır Ölçüm 83).
    2. Onay kutusunu etkinleştirmek "yüzde olarak göster" ve "arka plan çıkarmak".
    3. "Kinetik azaltma yapılandırmak için" gidin. CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibitör etkisi bileşiklerin değerlendirmek için Max-Min ölçüm 84 (Yani, sonra CXCL12 reçete ilk ölçüm) 243 (Yani, son ölçüm) başlangıç seçin.
      Not: Ölçüm 84 ve ölçüm arasındaki temel üzerinde minimum ve maksimum yanıt arasındaki farkı Max-Min seçerek 243 bildirilmektedir. Max-Min ölçüm 11 ve ölçüm 78 arasında başlayan seçilirse, temel temel 1 göre üzerinde minimum ve maksimum yanıt arasındaki farkı bildirilmektedir. Bu değer kullanılabilir bileşikler potansiyel agonistik etkinliğini analiz etmek, konuyabakın).
    4. Verileri sistem yazılım görüntülenmeyecektir. Gerekirse, ek analiz ve görselleştirme diğer ortak analiz yazılım paketleri için ham veri verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CXCL12 uyarım intrasellüler Ca2 + mobilizasyon U87 üzerinde etkisi. CD4.CXCR4+ ve U87. CD4 hücreleri Ca2 + seferberlik tahlil ile değerlendirilmesi. Yerine 20 µL normalde Protokolü (şekil 1) pipetting ilk adımında eklendi test bileşik tahlil arabellek eklendi fluo-2 AM U87 yüklü. CD4.CXCR4+ hücrelerde ölçüm plaka. İkinci dağıtım adımı, CXCL12 farklı konsantrasyonları (0.2-102,4 nM, son konsantrasyonu) ölçüm plaka re...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ca2 +-burada açıklanan seferberlik tahlil tanımlamak ve CXCR417hedefleme reseptör antagonistleri karakterize etmek için değerli bir araç olarak daha önce gösterildi. Ancak, bu yöntem daha genel olarak bir sitozolik Ca2 + serbest bırakılmasıyla onların harekete geçirmek, tetikler diğer GPCRs büyük bir grup için ilgili Kemokin reseptör CCR5 gösterildiği gibi uygulanabilir olduğunu tahmin edilmektedir. CCR5 durumunda tam olarak aynı deneysel koşullar uygulanabilir ise birkaç adı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Eric Fonteyn ve Geert Schoofs mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fluo-2Abcamab142775floresan Ca2 + hassas boya
Pluronic F-127SigmaP2443-250Gpluronik asit
JelatinSigma G9391
AMD3100SigmaA5602-5 mgspesifik CXCR4 antagonisti
MaravirocAnorMedantiretroviral ilaç, CCR5 antagonisti
Kemokin ligandı CXCL12PeproTech300-28A
Kemokin ligandı CCL5PeproTech300-06
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco (Yaşam Teknolojileri)10270-106
Sığır Serumu Albümini (BSA)SigmaA1933-25G
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco (Yaşam Teknolojileri)41965-039
HBSS (10 x), kalsiyum, magnezyum, fenol içermez kırmızıGibco (Yaşam Teknolojileri)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Yaşam Teknolojileri)15630-056
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısıGibco (Yaşam Teknolojileri)25200-056
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)Gibco (Yaşam Teknolojileri)14190-094
Falcon tüpleri, 50 mLGreiner Bio-One227 261
Doku kültürü şişesi (T75)Corning353024
Siyah plaka, 96 oyuklu, şeffaf alt, kapaklıCostar/Fisher Scientific10530753tahlil plakası (96 oyuklu), hücre tohumlama için
Polipropilen (PP) plakalarThermo Scientific (VWR)732-2661plakaları plakalar, yuvarlak alt
FLIPR Tetra yüksek verimli hücresel tarama sistemiMoleküler CihazlarEntegre pipet kafası ve ICCD kameralı floresan plaka okuyucu
FLIPR Tetra LED Modülü 470 - 495 nmMoleküler Cihazlar0200-6128Floresan Ca2+ hassas boyanın uyarılması için ışık yayan diyotlar
FLIPR Tetra Emisyon Filtresi 515 - 575 nmMoleküler Cihazlar0200-6203floresan boya ile uyumlu emisyon filtresi
FLIPR Tetra 96 KafaMoleküler Cihazları0310-453696 kuyulu pipetleyici kafası, floresan plaka okuyucuya entegre
Vi-CELLBeckman Coulterhücre canlılık analizöründe
Corning CellBIND 96 Kuyu Düz Şeffaf Tabanlı Siyah Polistiren Mikroplakalar, Kapaklı, SterilCorning3340Tahlil plakasının manuel olarak kaplanması için bir alternatif teşkil edebilecek önceden kaplanmış 96 kuyulu tahlil plakaları.
tür hediyesi Bileşik plakaları ve kemokini hazırlamak için kullanılan edilmiştir FLIPR Tetra veri analizi ve görselleştirme için kullanılan ScreenWorks Molecular Devices yazılım paketi

Kaynaklar

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

GPCR AnaliziKalsiyum MobilizasyonuFloresans Tabanl AnalizCXCR4 Antagonisti TaramasGPCR la Ke fiKinetik Floresans AnaliziH cre i Kalsiyum Sal n mAllosterik Mod lat r TespitiAgonist Antagonist Tan mlamaCXCL12 Stim lasyonu

İlgili makaleler