Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Özet

Burada, mekanik çalışma içinde in vitro ve in vivoiçin bir besleyici-Alerjik farklılaşma sistemi kullanılarak gen susturmak fare NK hücreleri toplu üretim için bir protokol mevcut.

Özet

Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olan ve ilk satır anti-kanser bağışıklık savunma; Ancak, tümör microenvironment görüntülenmez ve altta yatan mekanizma hala büyük ölçüde bilinmiyor. NK hücre tutarlı ve güvenilir bir kaynak eksikliği NK hücre dokunulmazlık araştırma ilerlemesini sınırlar. Burada, yüksek kalite ve kemik iliği türevi fare NK hücreleri besleyici-Alerjik bir koşulda miktarı sağlayabilir bir vitro sistem raporu. Daha da önemlisi, biz da siRNA aracılı gen susturmak başarıyla E4bp4 bağımlı NK hücre olgunlaşma bu sistemi kullanarak engeller olduğunu göstermektedir. Böylece, sistem ayırt bu roman vitro NK hücre dokunulmazlık araştırma için bir biomaterial çözümdür.

Giriş

Kanser ilerleme dahil olmak üzere ana bilgisayar kaynaklı immunocytes, örneğin, NK hücreleri tümör microenvironment^1,2' de, büyük ölçüde bağlıdır. Çeşitli çalışmalar intratumoral NK hücreleri ile tümör ilerleme^3,4olumsuz correlated gösterdi. Buna ek olarak, klinik çalışmalar NK hücre evlat edinen tedavisi kanser^5,6,7,8,9için olası bir strateji olduğunu gösterdi. NK hücre tabanlı kanserli hastalarda son zamanlarda solid tümör için bir tedavi seçeneği olarak önerildi ama immünsüpresif sitokinler salgılanmasını ve downregülasyon ligandlar solid tümör ^{microenvironment içinde etkinleştirme nedeniyle sorunlar yok 10,11}. Dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) karsinojenezis içinde baskılayıcı bir rol oynamaya önermek, ama garip bir şekilde kanser hücrelerinin da tümör gelişimi^12,13,14 desteklemek için TGF-β1 üretmek ^{, 15}. TGF-β sinyal NK hücreleri aşağı düzenleyen interferon responsiveness ve CD16 aracılı interferon-gamma (IFN-γ) üretim vitro^{16,17, via cytolytic faaliyet bastırmak 18}.

TGF-β tümör microenvironment sinyal kesintileri kanserleri ortadan kaldırmak için olası bir yol olabilir, ancak tamamen TGF-β sinyal engelleme anti-inflamatuar fonksiyonu, nedeniyle otoimmün hastalıklar gelişimi tarafından kanıtlanan neden olur olumsuz yan etkileri sistemik inflamasyon da dahil olmak üzere, kardiyovasküler kusur ve otoimmünite Mouse modelleri¹⁹. Böylece, TGF-β-aracılı immünosupresyon çalışma mekanizması anlama kanser tedavisi için erişilebilir bir terapötik hedef tanımlaması sağlayacaktır.

NK hücre gelişimi için gerekli moleküler olayları aydınlatmak için fare kemik iliği hematopoetik kök hücreler NK içine ayırt²⁰hücreleri için Williams ve ark. bir vitro sistemi kurdu. Bu sistem mekanik çalışma kimliği roman ataları NK hücreleri²¹de dahil olmak üzere NK hücre gelişimi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ancak, kemik iliği ataları OP9 stromal hücreler bir besleyici katman^20,21destekleyici sistemdeki kültürlü ve bu türdeş olmayan hücre nüfus büyük ölçüde gen engellemeden, daha fazla uygulama sınırları araçları (örneğin, gen siRNA aracılı susturmak) ayırt NK hücreleri için özel olarak uygulanan.

Burada, daha fazla Williams ve ark²⁰in vitro sistemi değiştirerek geliştirilmiştir besleyici-free sistemi açıklanmaktadır. Sistemimizde, OP9 stromal besleyici hücreler gerekli değildir, ve bunun yerine Koşullu orta NK hücreleri vitrove bu farklılaşma son zamanlarda etkilemeden kullanılır OP9 bizi TGF-β kanser ilerlemesi yoluyla teşvik yapabiliyor ortaya çıkarmak için tümör microenvironment²²E4bp4 bağımlı NK hücre gelişimi bastırmak. Bu yeni sistem başarıyla NK hücre gelişimi belirli koşullar altında moleküler mekanizması elucidating bir ücretsiz arka plan yöntem sağlar (örneğin, yüksek TGF-β1, gen siRNA aracılı susturmak, vs.) vitro.

Protokol

Alma ve kemik iliği türevi NK ayırt (BM-NK) hücreleri için protokolü daha önce yayımlanmış yöntemleri^20,21,22dayanır. Fareler ile tüm yordamlar tarafından hayvan etik deneysel Komitesi (AEEC) Hong Kong Çin Üniversitesi'nde onaylanmış olması.

1. OP9 koşullu orta hazırlanması

1. Fare stroma hücre hattında OP9 Alfa-MEM %20 FBS, 100 U/mL penisilin G ve hava/CO₂ oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin içeren kültür (% 95: % 5).
   1. Bir hemasitometre, o zaman tohum 2 x 10⁶ OP9 hücrelerin her 75 cm² kültür şişesi ile orta 15 mL içeren hücreleri saymak. Kültür 48 h için.
   2. Kültür % 80 izdiham ulaştığında, PBS 10 mL ile şişeye yıka ve düz Alfa-MEM orta (olmadan FBS ve antibiyotik) flask başına 20 mL ekleyin.
2. Kültür balon, 24 h OP9 durumu orta toplamak, 0.25 µm polyethersulfone (PES) filtresi ile hücre artıkları kadar temiz ve 4 ° c (2 hafta içinde kullanım) korumak.

2. izolasyon fare kemik iliği hücrelerinin

1. Bir pentobarbitone aşırı doz (100 mg/kg, mayi enjeksiyon) 12 haftalık C57BL/6J fareyle ötenazi. Nefes, eksikliği nedeniyle ölüm onaylamak sonra uyluk kemikleri ile cerrahi bıçak kesim kavşak kemikleri arasında hasat ve nazik çizilmemesi tarafından bıçakla kalan kas kaldırın.
2. Kemikleri soğutulmuş steril Alfa-MEM içeren bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin ve sonra bir biyogüvenlik kabini içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
3. Alfa-MEM orta atmak ve kemikler için %30 70 etanol ile durulayın s.
4. Kemikler iki kere kalan etanol temizlemek için buz gibi steril PBS ile yıkayın.
5. 5 mL buz gibi PBS de içeren bir harç kemiklerde aktarmak ve yavaşça kemikleri bir havaneli ile fragmentize (onları ezmek değil).
6. Kemikleri hafifçe kemik iliği hücre PBS serbest bırakmak için havaneli dönen tarafından tahrik. PBS içeren kemik iliği hücreleri yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne toplamak.
7. Beyaz renkli kemik parçaları haline kadar 2.6 için dört kez tekrarlayın.
8. Tüp 4 ° C'de 5 min için 465 x g, santrifüj kapasitesi sonra süpernatant atmak.
9. Pelet 18 mL steril distile su ile resuspend ve o 30 için stand izin s kırmızı kan hücreleri kaldırmak için.
10. Buz gibi 10 2 mL ekleyin X reaksiyon durdurmak için PBS daha sonra karışımı lysed kırmızı kan hücreleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre uygulayın.
11. Tüp 4 ° C'de 5 min için 465 x g, santrifüj kapasitesi Pelet buz gibi PBS 20 mL ile resuspend.
12. Hücreleri adım 2.11 ikinci kez tekrar ederek yıkayın.
13. Bir 100-mm steril Petri 20 ile desteklenmiş çanak içine 10 mL OP9 koşullu orta adım 1.2 ile hücre Pelet transfer % FBS ve 0,5 ng/mL karışımı fare IL-7, 30 ng/mL fare SCF ve 100 U/mL fare flt3L.
14. Çanak %5 CO₂ 2 h. Transfer için 37 ° C'de ekli olmayan hücreleri bir yoğunluğu 5 x 10⁵ canlı hücre/mL (hemasitometre trypan-mavi dışlama ile tarafından hücreleri hesaplama), yeni bir kültür kaba adım 2,13 olduğu gibi aynı orta formülüyle kuluçkaya ve % 5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya.
15. 4 günde değişiklik OP9 koşullu orta kültür durumuna FBS ve fare IL-2 2.000 U/mL % 20 ile desteklenmiştir.
16. Kültür orta 3 günde yeniler; Olgun NK hücreleri gün 7 tarafından elde edilen ve 4 bölümde olduğu gibi nitelikli.

3. siRNA aracılı Gene Silencing ayırt NK hücre

1. SiRNA veya saçma denetim (NC) ürün kılavuzuna göre bir transfection maddesi ile premix.
2. 3.1 herhangi bir zamanda noktada 0 günden beri adımıysa.
3. 50 ekleyin siRNA veya hücreleri NC karışıma adım 2,14 nM.
4. 3.1 her orta ferahlık (örneğin, 0, 4 ve 7 gün) üzerinde deneysel son noktaya kadar adımları yineleyin.

4. NK hücre farklılaşması kullanarak Akış Sitometresi Analizi

1. Bir uygun zamanda noktada hücreleri ayırt süspansiyon toplamak ve buz gibi PBS ile yıkayın.
2. Hücreleri hücre fiksasyon arabelleği ürün kılavuzuna göre ile düzeltmek.
3. Buz gibi PBS sabit hücrelerle yıkama ve Akış Sitometresi boyama arabellek içeren Cy3 Birleşik Anti-fare NKp46 100 µL hücrelerde 1 x 10⁶ ve seyreltme oranı 1: 100 anti-fare CD244 antikor PE Birleşik resuspend.
4. Örnek 2 h için oda sıcaklığında karanlık leke.
5. PBS, 300 µL lekeli örnekleriyle resuspend sonra FACS veri elde etmek ve Cytobank platform²⁰ ile (http://cytobank.org/) analiz.

Sonuçlar

Temsilcisi sonuçları açıklanan protokol sonrası elde edilir. Toplam kemik iliği süspansiyon hücre farklılaşma besleyici-Alerjik sistemi altında 11 gün boyunca ekili; nükleer silahların yayılmasına karşı oranı önemli artış gün 7 gün 0 (şekil 1A) toplam hücre sayısı ile karşılaştırıldığında tarafından gözlenmiştir. Olgun NK hücreleri sitoplazmik için nükleer oranı yüksek ve granül-zengin sitoplazma Morfoloji sistemi (şekil ...

Tartışma

Mevcut çalışma, kemik iliği türevi fare NK hücreleri içinde vitroüretimi için yeni bir yöntem anlatmıştık. Özgün sistem^21,22 cep besleyiciye başarıyla büyük ölçüde daha farklılaşma sistem istikrarlı OP9 hücreleri koşullu medyum tarafından değiştirilir. Buna ek olarak, sistem yüksek miktar üretebilir ve olgun NK saflığı vitro hem de in vivo hücre deneyleri, mekanik çalışma gibi insan hastalıkları NK hücreleri translasyonel araştırma kola...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
OP9 hücre hattı	ATCC	ATCC ® CRL-2749 ve ticaret;
MEM α, nükleosit yok	Gibco	22561021
Fetal Sığır Serumu	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Rekombinant Murin IL-7	PEPROTECH	217-17
Rekombinant Murin SCF	PEPROTECH	250-03
Rekombinant Murin Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
Rekombinant Murin IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi	Invitrogen	1377815
IC Fiksasyon Tamponu	eBioscience	00-8222-49
Akış Sitometrisi Boyama Tamponu	eBioscience	00-4222-26
PE konjuge anti-fare CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3 konjuge anti-fare NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Anlamsız kontrol (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA fareye karşı E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& asal;