Yöntem makalesi

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

DOI:

10.3791/56901

⸱

26 Ocak 2018

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrosıvısal teknoloji birçok Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri için kısıtlamaları üstesinden gelir. Toplu-kültür yöntemlerinden farklı olarak, tek hücreli çözünürlük ve nesiller yüzlerce spanning kez uzun gözlem sunar; Özel yastık tabanlı mikroskobu sıkı kontrol Tekdüzen büyüme koşullarına sahiptir. Çünkü bir mikrosıvısal aygıt neden olduğu hücre büyümesi ve metabolizma, otantik değişiklikler gen ekspresyonu ve hücre büyümesini yanıt olarak yerel kimyasal ortamdaki öngörülemeyen varyasyonlarından hücrelerde büyüme ortamının sürekli akışı ayırır belirli uyaranlara daha güvenle görülebilmektedir. Bacillus subtilis kullanılır burada bir "ana makine" göstermek için bir model bakteriyel türler olarak-yazın için hücresel analiz yöntemi. Biz oluşturmak ve bir mikrosıvısal aygıt çekül, hücrelerle yüklemek, mikroskobik görüntüleme başlatmak ve bir büyüme ortamından diğerine geçiş yaparak bir uyarana yapan hücreleri göstermek nasıl göstereceğim. Stres-duyarlı bir muhabir bu yöntemle elde edilen veri türü ortaya çıkarmak için bir örnek olarak kullanılır. Da kısaca uygulamaları deneyler, bakteriyel sporulation analizi gibi diğer türleri için bu yöntemin daha fazla tartışmak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya'daki yaşam en çarpıcı özelliklerinden biri onun büyük esneklik ve çeşitlilik olduğunu. Moleküler Biyoloji merkezi amacı tarafından hücreleri genler ve proteinler onların büyüme ve fitness çok çeşitli çevresel koşullar altında en üst düzeye çıkarmak için kullanılan mantığı anlamaktır. Bu hedefe ulaşmak için bilim adamları güvenle gözlemlemek mümkün olmalıdır nasıl, tek tek hücreleri büyümek, bölmek ve onların genler belirli bir koşullar kümesi altında hızlı hücre kendi ortamlarında sonraki değişiklikler nasıl yanıt verdiklerini kaydetti. Ancak, Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri ele alınabileceği soru türleri etkiler teknik kısıtlamalar bulunmaktadır. Örneğin, toplu kültür tabanlı analizler yıllar içinde çok yararlı olmuştur henüz anlamlı hücre hücre çeşitleri veya daha küçük alt nüfus toplam nüfusunun hücrelerinin davranışlarını maske yapabilirsiniz nüfus düzeyinde veri sundukları. Tek hücreli analizleri üzerinde ışık mikroskobu göre yaşayan bakterilerin tek hücreli davranışı ortaya ama aynı zamanda teknik olarak sınırlıdır. Bakteri genellikle büyüme orta, içeren özel yastıkları immobilize ama büyüme ve bölünme kalabalıklar mikroskobik görünümü hücre ve gözlem zaman1önemli ölçüde sınırlayan bir kaç hücre döngüsünden sonra kullanılabilir besin tüketir, 2. Ayrıca, besin yerel tükenmesi ve hücre büyümesi nedeniyle metabolik yan eşlik eden birikimini sürekli yerel hücre büyüme çevre değişiyor yollarla ölçmek ya da tahmin etmek zordur. Özel pedleri kullanarak bu tür çevresel değişiklikler için çalışmalar kararlı durum davranışları veya hücresel yanıt büyüme koşulları3belirli değişiklikler için bir sorun teşkil.

Bir sıvı orta sürekli microfabricated cihazlar aracılığıyla akıtılana mikrosıvısal, klasik deneysel sınırlamalar bir çözüm sunar. Büyüme orta akış sürekli hücreleri ile taze besin sağlar ve metabolik yan ve aşırı hücreleri, böylece son derece düzgün bir büyüme oluşturma uzak yıkar bir mikrosıvısal aygıt tek tek hücreler pozisyon için yaşamak-cep mikroskobu saklayabilirsiniz çevre. Sürekli büyüme koşullar altında çevresel faktörler, hücre iç mantık Engelsiz bir görünümünü izin etkisi düşük yalıtım modunda hücre davranışlar görülebilir. Hücrelerle kalabalık olma mikrosıvısal cihaz sıvı akışını engeller, tek hücre soy onlarca veya yüzlerce nesiller için gözlem olası4,5olur. Böyle uzun gözlem kez aksi takdirde belirlenemeyen uzun vadeli veya nadir cep davranışları tespiti izin. Son olarak, aygıt akıyor, değiştirilebilir orta bileşimi olacak, onlar bir stres başlangıcı veya giriş veya belirli bir bileşik kaldırılması için yanıt olarak uyması gereken hücreler izin.

Havacilik zaten önemli uygulamaları bir dizi kazanmıştır. Örneğin, doku, organ- veya vücut-on-a-chip aygıt, birden fazla insan hücre türü bir vivo içinde durumu6benzetimini yapmak için işbirliği kültürlü olduğu içinde kullanılmıştır; microstructured ortamlar7nematodunun hareketi incelenmesi için; Bakteriyel biyofilmler (örneğin, 8); arasındaki etkileşimler incelemek için ve için saklama ve işleme küçük hacimli hücreleri veya kimyasal maddeler (örneğin, 9). Mikrosıvısal cihazlar da özellikle onların fiziksel olarak (için mükemmel yorumları, bkz: 10 ve 11), Mikrobiyoloji alanında giderek daha popüler hale gelmiştir ve akış özellikleri doğal mikrobiyal nişler12' ye uyumlu. Örneğin, havacilik son zamanlarda microbiologists tarafından bu tür amaçlar için tam olarak patojen hareketi16analiz hücre büyüme ve bölüm13,14,15, ölçüm olarak istihdam edilmiştir, çekirdek algılama17 ve fizyolojik geçişler18izleme ve protein için sayma19, birçok diğer örnekler arasında. Burada sunulan yöntem suşları ya türü birleşimlerini yerine tek bakteri hücre soy analizi için özel olarak tasarlanmıştır. "Ana makine" tasarım4hangi hücreleri tek dosya büyüdü, bir varyasyon aşağıda gösterildiği mikrosıvısal aygıt kullanır içinde bir mikrosıvısal siper bir kapalı ucu ve bir açık uçlu; hücre büyümesi ve bölünme iter döl hücreleri yukarı ve dışarı açık ucu sıvı akışı. Bizim analizler genellikle yalnızca açmanın kapalı sonunda sınırlı "anne" hücre odaklanmak. Biz bu yöntemi önceki ışık mikroskobu tabanlı tek hücreli analitik teknikler, Hücre immobilizasyon üzerinde özel yastıkları gibi üzerinde bir gelişme düşünün. B. subtilis bir model olarak kullanılırken, yöntem aynı zamanda diğer bakteriyel türler için geçerlidir (Escherichia coli başka bir ortak modeli, farklı hücre boyutlarını veya türleri morfoloji ile bazı türler yeni cihazlar imalatı gerektirebilir farklı boyutları ile). Floresan gazetecilere hücreleri işaretlemek için ve gen ekspresyonu değişimler görselleştirmek için kullanımı genetik olarak uysal türlerin kullanımını gerektirir; Ancak, hücre büyümesi ve Morfoloji bile floresan işaretleri mümkün analizlerdir.

Mevcut iletişim kuralı fotolitografi, başka bir yerde yaygın olarak tanımlanmıştır5kullanarak silikon asıl imalatı işlemi hariç; ustalar da microfabrication tesislerinden kolayca dış kaynaklı olabilir. Güçlendirilmiş silikon ana PDMS aygıttan kalıplama içerir; kapak cam parçası aygıta bağlar; mikrosıvısal giriş ve çıkış sıhhi tesisat montaj, orta geçiş izin vermek için de dahil olmak üzere çimdik vanalar; Cihazın pasivasyon, bakteri hücreleri hazırlamak ve bakteri hücreleri ile aygıt yükleme; su tesisatı için aygıt ekleme ve hücreleri sıcaklığına; ve üzerine floresan mikroskop için düşsel aygıt yükleme. Çünkü birçok farklı resim alma ve işleme yazılımı araçları görselleştirmek ve faiz4,5farklı veri analiz etmek için kullanılabilir, örnek resimler gösterilir, ama görüntü yakalama yöntemleri bu protokol için dahil değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PDMS aygıt döküm

  1. Tozsuz bir ortamda mix PDMS polimer ve kür Ajan 10:1 oranında ve en az 10 dk için vakum altında degas.
  2. Kırılmamış alüminyum folyo parçası üzerinde bir silikon ana (veya bunların bir epoksi veya poliüretan yineleme) polistren bir Petri tabağına yerleştirin. Degassed PDMS karışımı bir derinlik, yaklaşık 5 mm. Degas Petri tabağı en az 10 dk. kullanım için asıl yüzey kabarcık kırmak için hava yumuşak akışı dökün.
    Not: Kullanılan iki katmanlı cihazın boyutları eşlik eden CAD5 dosya sağlanır (bkz. ek dosya 1). Bir plastik çoğaltma ana gaz giderme sırasında kısmen savrulabilir; Bu durumda, çoğaltma temiz plastik bir aplikatör ile itin.
  3. 60 ° c fırında en az 1 h için PDMS tedavi ve oda sıcaklığında serin. Ana ve tedavi PDMS Petri plaka içeren alüminyum folyo kaldırın. Alüminyum folyo asıl arkasından dikkatle akasındaki sonra dikkatli bir şekilde ana PDMS soyma.
    Not: Alternatif olarak, PDMS gecede oda sıcaklığında giderildi. Bir silikon gofret ustanın göreli kırılganlık kalıcı olarak 1/16 inç gofret bağ için epoksi yapıştırıcı kullanarak aşmak-kalın alüminyum disk gofret olarak aynı boyutta.
  4. Bir gofret genellikle birkaç mikrosıvısal aygıt (bkz. ek dosya 1) biraz farklı boyutları ile içerir gibi temiz, keskin neşter kullanarak boyutlandırmak için tek bir aygıt kesti.
    Not: B. subtilis iş alışılmış çalışma yöntemi için C veya F eşlik eden CAD dosyası ile işaretlenmiş 1.0 µm çapında hücre siperleri ile cihazlar kullanın.

2. aygıt Delme ve bağlama

  1. Yer biteviye-in yarı saydam office desenli özellikleri görünürlüğünü artırmak için aygıt desenli yan tarafa teyp ( Tablo malzemelerigörmek). Giriş ve çıkış bağlantı noktaları görünür sıvı kanalları (şekil 1) ters ucunda dairesel alanları olarak tanımlanır. Ne zaman içinde belgili tanımlık aygıt giriş ve çıkış pins için delik delme onların görünürlüğünü artırmak için ince uçlu bir işaretleyici kullanarak nokta ile giriş ve çıkışları işaretleyin.
    Not: giriş ve çıkış sabitleyicileri kalabalık değildir emin olmak için her kanal, kanal hemen altında aygıtın alfabetik göstergesi ile başlayan yumruk.
  2. Böylece desenli yan aşağı PDMS aygıt flip ve aygıt için bir 0,75 mm biyopsi yumruk kullanarak işaretli nokta üzerinden yumruk; punchings atın.
    Not: biyopsi yumruk tarafından oluşturulan delik genellikle biraz nerede yumruk polimer girer alevlendi çünkü belgili tanımlık aygıt desenli tarafı yumrukladı. Cihazın bir ters yönde Delme desenli tarafında delik keskin bir kenarlığı vardır sağlar.
  3. Bir stereomicroscope kullanarak, delikli delik cihazın giriş ve çıkış alanları ile üst üste emin olun. İnce uçlu cımbız PDMS herhangi bir yabancı parçaları delikli delik kaldırmak için kullanın.
  4. Yapışkan bant toz yeri ve aygıt her iki tarafından bir temiz polistren Petri plaka kaldırmak için kullanın. 22 mm x 40 mm kapak cam % 100 izopropil alkol ile ıslatma ve temiz oda temizleme işlemi ile sürtünme hazırlayın; Kuru bir dere tozsuz hava veya azot ile.
  5. Delikli PDMS aygıt özelliği yan birlikte temizlenir cam bir oksijen plazma temizleyici yerleştirin.
    1. Plazma-aşağıdaki ayarları cihazla tedavi: vakum, 70 mTorr; O2 basınç, 200 mTorr; süresi, 15 s; Hemen plazma tedavi süresi sona erdikten sonra güç, 30 W. aygıt ve cam plazma temizleyici çıkarın.
    2. PDMS ters çevir ve desenli yan cam rehber kapak cam ortasına yerleştirin; (giriş ve çıkış alanları arasında çalışan) besleme kanalları kapak cam uzun ekseni ile hizalandığından emin olun. Çok yavaşça PDMS mühürler cama emin olmak için bastırın.
  6. Bir fırın montajı aygıt için en az 1 h 60 ° C'de pişirin Pişirme sonra el ile PDMS cam cihazın bir köşede hafifçe iterek gümrüklü doğrulayın.
    Not: bir kez belgili tanımlık aygıt bağlı, polimer ile artan yaşam süresi plazma tedaviden sonra giderek hidrofobik hale olarak 24 saat içinde kullanılmalıdır.

3. mikrosıvısal sıhhi tesisat hazırlık

  1. Polimer (kullanılıyorsa) anahtarlama cihazları şırınga pompa ulaşmak için uygun uzunlukta ve mikroskobunun monte edildiğinde cihaz (iç çap (ID) 0,02 inç, dış çap (OD) 0,06 inç) boru uzunlukları kesti. Mikrosıvısal yolları gibi birçok uzunlukları kesti.
  2. Y kavşak çimdik vanalar için kesme ve esnek silikon üst barbs "G" ve "G" alt barb için silikon tüp uzunlukları 1 cm (0.03 inç kimliği, 0,065 inç OD) boru uzunlukları 2 cm ekleme tarafından (kullanılıyorsa) monte
  3. Polimer boru uzunlukları 10 cm (veya uygun) kesme; "G" alt barb 1 cm silikon tüp kesimlerinde içine ekleyerek anahtarı Kavşağı için bir ucunda bağlamak Bunları plastik şırınga adaptörleri ve bent yaklaşık 90 ° yaklaşık 9 mm iğne sonundan itibaren kaldırılmıştır 21 G iğneler için diğer ucunda bağlayın.
  4. 21 G künt iğneler şırınga iğneleri boru içine ekleyerek anahtarı aparatı çalışır boru parçaları bir ucunu bağlayın. Y kavşak giriş barbs silikon tüp kesimlerinde her boru uzunluğu diğer ucunu takın.
    Not: bir tür cihazlar çimdik vanalar ve kavşak tutmak için kullanmak; Bu micropipette uç kutusu (şekil 2B) kolayca yapılabilir.
  5. Cihazın prizinden atık atık bir ölçek için yürütmek için polimer boru uzunlukları kesti. Onları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan bükülmüş 21 G iğneler için bir ucunda bağlayın. Tüpler diğer ucunu atık bir ölçek teyp.
  6. 0.1 mg/mL sığır serum albumin (BSA) içeren ortama uygun miktarda hazırlamak ve şırınga sayısını ve istediğiniz boyuta doldurun. BSA yüklü şırınga giriş boru ve yük şırınga şırınga pompa bağlı hazırlanan 21 G iğneler bağlayın.
    Not: cihazın 5 kanalları kullanılır, tipik deneyler için her biri 20 mL şırınga. Hangi orta açık olduğundan bir deney 5 şırıngaların 2 bankalar gerektirir. Burada, içeren ilk banka pompa Faz-1 pompa olarak adlandırılır ve içeren sonrası anahtarı orta ile ikinci banka pompa Faz-2 pompa olarak adlandırılır.
  7. Hava giriş sıhhi tesisat üzerinden bir yüksek akış hızı enjektör pompaları çalıştırarak tasfiye (> 500 µL/dak), başlangıç şırınga pompalar dikey yönlendirme ve üst hava kabarcığı getirmeyi şırıngaları dokunarak. Bir kez hava şırınga temizlendi, şırınga pompa yatay konuma getirin ve aşamalı olarak dokunun veya şırıngaları polimer satırlarından çıkarmak ve hava kabarcıkları tasfiye anahtarı aparatı flick. Eğer (medya anahtarlama) şırınga ikinci banka için bu işlemi yineleyin.
  8. Hava kabarcıkları temizlenir sonra Faz-2 şırınga pompa ayarla (Yani, kullanılacak olan orta ile anahtarından sonra ikinci) 1,5 µL/dk, sonra akışını duraklatır. İkinci orta aşamasına karşılık gelen Y kavşak kolu küçük bağlayıcı klipleri esnek boru parçaları üzerine yerleştirin. İkinci orta giriş boru üzerinden temizlemek en az 30 dakika için bir mütevazı akış hızı (örneğin, 10 µL/dak), faz-1 enjektör pompa çalışmaya devam aşağı Y kavşak.

4. hücre kültür hazırlama

  1. Bir preculture büyük ilgi istenen orta yük gecede, durağan faz için büyümek. Bakteriyel zorlanma böylece hücreleri cihazın kanalları dışında yüzmem hücreleri hareketsiz, işler bir mutasyon içermelidir.
    Not: Bu protokol için bakteriyel yük B. subtilis 3610 olduğunu bir cadıA233V ikame, (Bu mutasyon neden düz Helisel, önleme hücre hareketliliği yerine olmak kamçı) içeren bir PrsbV- mNeonGreen muhabiri hücre stres ve bir kurucu Phyperspank- mNeptune (kırmızı) muhabir hücreleri vurgulamak için. LB Lennox orta örnek protokolü kullanılır. Tipik suşları havacilik deneyler için bir veya daha fazla floresan transkripsiyon gazetecilere ve yapısal üretilen, sitoplazmik floresan protein hücrelerinin otomatik algılama kolaylaştırmak için içerir. Büyüme kusurları LB Lennox zengin Orta kullanılmıştır, ancak en az medya B. subtilis büyüme mikrosıvısal koşullar altında salgılanan çünkü inhibe siderophores uzağa tarafından orta akış yıkanır tespit edildi değil. Bu durumda, büyüme sodyum sitrat ve orta ferrik klorid eklenmesiyle S750 orta11için rapor olarak geri yüklenebilir.
  2. Deneme, sabah B. subtilis hücreler büyüme ortamının 25 mL içeren bir şaşkın 250 mL şişe 1:50 oranında seyreltin. 1'den büyük bir optik yoğunluğunun 37 ° C'de kültür sallayarak içinde 5-6 h için hücreleri büyümek.
    Not: sabit faz B. subtilis vardır daha küçük ve daha az sık sık bulunan hücre hücreleri çünkü yoğun hücre kültürü tercih edilir zincirleri, aygıt yükleme kolaylaştırmak. Farklı bakteri türleri diğer Orta veya büyüme koşulları için en uygun yükleme gerektirebilir.
  3. 5-µm gözenek boyutu filtre ile donatılmış bir şırınga kullanarak, hücre kültürü yaklaşık 15 mL ( E. coli için gereksizdir ve diğer türler ile gerekli olmayabilir) B. subtilis hücre zincirleri kaldırmak için bir 15 mL konik tüp içine filtre uygulama.
    Not: Görece az sayıda hücre kaldırılması gerektiğini; filtrate bulanık olmalıdır.
  4. Filtre uygulanmış kültür için 4.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Eğer hücre süspansiyon pipetting kolaylaştırmak için gerekli taze orta yaklaşık 500 µL ekleme tüpte kalan kalan süpernatant sıvı hücre Pelet resuspend ve süpernatant dökün.

5. aygıt yükleme

  1. Yavaşça boş ince jel-yükleme micropipette koyun mikrosıvısal cihazın çıkış deliklere İpuçları ( Tablo malzemelerigörmek).
  2. İnce jel-yükleme ipuçları P200 micropipette ile kullanarak, aygıt 1 mg/mL BSA giriş deliklere dolum mikrosıvısal kanal (şekil 2A) izlemek için çıkış delikleri ipuçlarında gözlemleyerek içeren orta enjekte edilerek passivate. Cihazın oda sıcaklığında yaklaşık 5 min için kuluçkaya.
    Not: BSA genellikle onun hydrophilicity artan ve diğer proteinlerin veya hücre (hücre yüzey molekülleri) üzerinden bağlama azaltarak PDMS polimer hidrofobik yüzeye bağlayan bir engelleme veya pasivasyon ajan olarak kullanılır.
  3. İnce jel-yükleme ipuçlarını kullanarak, aygıt (şekil 2B) hücreleri ilerlemesini izlemek için çıkış kanalda ipuçlarını kullanarak her kanal ile resuspended hücrelerden (Bölüm 4), yük.
    Not: Yükleme P200 micropipette en fazla 200-µL hacmi ayarlayıp sonra hücre küçük hacimli (yaklaşık yarım hacmi pipet ucu ince bölümünü) aspirating önce hava yastığı aspirating kolaylaştırılmıştır. PDMS aygıt hacmi micropipette göre küçük olduğu resuspended hücre hacmi kesin, olması gerekmez. Hücre süspansiyon cihazın içine pipetted sürece resuspended hücre yoğunluğu için üst sınır yoktur biliyoruz. Hücre kümeleri cihazın yapışmasına neden olabilir ve tam pipetting ve/veya girdap karıştırma tarafından kaçınılmalıdır.
  4. Yavaşça jel-yükleme ipuçları teker teker cihaza zarar önlemek için çalışma çıkış delikleri kaldırın.
  5. Santrifüj kapasitesi yaklaşık 6.000 x g de bir uygun rotor adaptör bir tezgah üstü microcentrifuge cihazda 10 dk (şekil 2C).
    Not: bir microcentrifuge rotor (şekil 2C) uyacak şekilde tasarlanmış bir özel işlenmiş alüminyum rotor adaptör kullanılan; farklı santrifüj modelleri uygun rotor adaptörler ile kullanılabilir. Önemli özelliğidir adaptörü, böylece hücreleri yan kanallarına zorlama hücre siperler, kapalı uçları yönünde yanal kuvvet sağlamasıdır.
  6. (Şekil 3) mikroskop altında başarılı yükleme doğrulayın ancak cihazın slayt tutucu/sahneye yapıştırılması olmadan eklemek.
    Not: Bu protokol için bir 60 X, 1.4 NA Ph3 petrol-daldırma amaç bu aşamada her iki doğrulama için sonraki görüntüleme için kullanılır.

6. cihaz montaj, denge ve montaj

  1. Dikkatle PDMS sahne Ekle alt tarafındaki kapak cam taping tarafından yüklenen aygıt sahne Ekle üzerine monte (Yani, aygıtı eklemeden önce sahne Ekle ters çevir). Böylece PDMS karşı karşıya olduğu sahne Ekle-aygıt montaj ters çevir ve tozsuz mendil (şekil 2B) gibi yumuşak bir yüzeye yerleştirin.
  2. 35 µL/dak Faz-1 enjektör pompa akış hızı ayarlamak bir yol, bir anda çalışıyor, giriş iğne ve sonra çıkış iğne ekleyin (Yani, çalışan atık kabı için; Şekil 2E).
  3. Uzak aşırı herhangi bir ortamda temiz tozsuz mendil ile silin ve cihazın kaçakları kontrol edin. Aşırı hücreleri (genellikle bulanık bir çizgi görünür) ve yavaş yavaş atık kabı doğru hareket edecek orta Menisküs görünümünü çıkış boruları inceleyin.
  4. Cihazın 35 µL/dk için yaklaşık 15-30 dakika, tüm bağlı yolları atık kabı boşaltılmasına kadar çalıştırmak için izin verir.
  5. Faz-1 enjektör pompa 1,5 µL/dak için ayarla ve akışını duraklatır. Tüm pompa ve aygıt aparatı (Bu işlem destekli tüm çalışırken bir at arabası yerleştirerek) mikroskop getirmek ve Faz-1 1,5 µL/dak, Orta Akış dikkatle cihazın üzerine bir ters Floresans mikroskobu ile sahne Ekle mount yeniden kullanma giriş ve çıkış boru yönlendirmek için gereken bant.
  6. İstenilen pozisyonlar için düşsel aygıt bulun ve istediğiniz gibi görüntüleme başlar. Not hücreleri genellikle gerektirir kararlı durum üssel faz büyüme ulaşmak için birkaç saat (yaklaşık 10 nesil) ve resim alma başlangıcı olarak gecikebilir görüntüleme denge döneminden sonra başlamasını istediğiniz.
    Not: Kararlı durum büyüme üstel aşamasında düzenlenen hücre sonraki görüntü analizi sırasında hücre bölünmesi kez izleme ve sürekli en az değeri ulaştınız sağlanması doğrulanması gerekir.

7. orta arasında geçiş yapma

  1. Arasında art arda gelen mermi görüntüleme Faz-1 enjektör pompa akış duraklatın. Dikkatle boru, Y kavşak Faz-1 Şubesi her silikon tüp hareketli Faz-2 silikon üzerinden bağlayıcı klipleri çöz. BM-pause Faz-2 akışını (Bu adım 3.8 1,5 µL/min ayarlandı) pompa şırınga ve görüntüleme devam.
    Not: polimer aşağı boru, 10 cm uzunluğunda 1,5 µm/min, Y kavşak ikinci aşama orta cihazın yaklaşık 50 dakika içinde ulaşır. Cihazın vakti floresan izleyici parçacıkları içeren medyayı kullanarak ampirik olarak test edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yükleme, faz kontrast mikroskopi tarafından aygıta mikrosıvısal sıhhi tesisat eklemeden önce değerlendirildi gibi başarılı ilk hücre veya neredeyse tümünü içeren bir veya daha fazla bakteri hücreleri ( mikrosıvısal yan Kanallar sahip olarak düşünülebilir Şekil 3A). En uygun yükleme her kanalda birkaç hücreyi gösterir ama kanalları yine de hücreleri hücre büyüme denge döneminde (şekil 3B) nedeniyle değeriyle doldurur. Zavallı, han...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adımlardan kullanımı belirli türler veya zorlanma veya belirli bir amaç için en iyi duruma getirmek için değiştirilebilir bu havacilik Protokolü esnek olmamasıdır. Nitekim, bu protokol için kullanımı B. subtilisile optimize etmek için orijinal "ana makine" kavramı4 değişiklikler yapılmış. Çoğu zaman, bu protokol için hücreleri çevreleyen sığ bir kanal ile iki katlı hücre siperler, kullanın, ancak hangi hücrelerin sınırlı olan siperler bir tek katmanlı özelliği oluşturmaktadır. İki katmanl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje GM018568 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Bu iletişim kuralı için Nano sistemleri (CNS), bir üye, ulusal nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi bir parçasıdır. Çok teşekkürler Thomas Norman ve Nathan Lord nedeniyle hamile kalma ve burada ve orijinali cihazları binada gösterilen aygıtlar için kullanılan ana şablon imalatı işlerini içindir. Biz de Johan Paulsson onun değerli ortak tavsiyeler için teşekkür ederiz ve üyeleri laboratuarına onların tavsiye ve bakteriyel mikrosıvısal için aygıtlar için sürekli iyileştirmeler için teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning(240)4019862Bu, protokolde PDMS olarak anılır. 10:1 oranında karıştırılan 2 bileşen vardır
0,75 mm biyopsi zımbasıWorld Precision Instruments504529
22 x 40 mm, No. 1.5 kapak camı,VWR48393, 172
Plazma Aşındırma, PE-50Plazma Aşındırma, A.Ş.PE-50Oksijen plazma tedavisi kullanarak PDMS'yi cama yapıştırmak için kullanılan alet
Tygon esnek boru ID 0.02 ", OD 0.06"Saint-Gobain PPL Corp.AAD04103Borunun ana kısmı için, örneğin iğnelere bağlı
Silikon Boru, 0.04 "ID, 0.085" ODHelixMark Standart Silikon Boru60-795-05Sıkıştırma valfleri ve Y-bağlantı bağlantısı için
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA7906-100GPasivasyon ajanı olarak kullanılır
ART Jel Pipet Uçları (P200)Moleküler BiyoÜrünler2155Cihazı orta ve hücrelerle yüklemek için
Acrodisc 32 mm şırınga filtresi 5-μ m Supor membranPall Life Sciences4560Cihaz yüklemeden önce kültürleri filtrelemek için
21 ga künt iğneler, 1 "McMaster-Carr75165A681
200 serisi dikenli Y konektörü, 1/16" ID boru, polipropilenNordsonMedical Y210-6005Şirket AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E ters mikroskopNikonBu ünite üretici tarafından durduruldu ve Ti 2 E ile değiştirildi.
LB LennoxSigma-AldrichL3022
Mikrofüj 18Beckman Coulter367160
Bacillus subtilis suşu NCIB3610Bacillus Genetik Stok MerkeziBuprotokolde gösterilen deneylerde kullanılmak üzere modifiye edilmiş vahşi tip ebeveyn suşu PDMS'yi
yerçekimi konveksiyonlu fırınVWR414005-106 cihazlar
Scotch-Weld Epoksi Kiti3M2216 B/Abir silikon gofreti bir alüminyum destek plakasına bağlamak için kullanılabilir
Scotch Magic bant, 3/4" genişlik3M,PDMS cihazlarındaki tozu temizlemek ve görünürlüğü artırmak için özelliklerin üzerine yerleştirmek için (protokolde "ofis bandı" veya "yapışkan bant" olarak gösterilir)
StereomikroskopNikonSMZ800Nburada örnek olarak listelenmiştir; hemen hemen her stereomikroskop
İzopropil alkolSigma-AldrichW292907Kapak camını temizlemek için
Şırınga pompası, 6 kanallıNew Era Pompa Sistemleri A.Ş.NE-1600
KimwipesKimberly-Clark34120bir tozsuz mendil markası
: , , kürlemek ve monte etmek için,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  3. Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
  4. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  5. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
  6. Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
  7. Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
  8. Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
  9. Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
  10. Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
  11. Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
  12. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  13. Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11(2017).
  14. Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
  15. Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
  16. Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
  17. Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
  18. Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
  19. Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641(2016).
  20. Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
  21. Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
  22. Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
  23. Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroak kan CihazTek H cre AnaliziAna MakinePDMS Ba lamar nga PompasFloresan Raporlay cBakteriyel Spor lasyonFaz KontrastH cre Soy Hatt

İlgili makaleler