Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

11.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56955

⸱

29 Mayıs 2018

 ,  ,  , 
1Knock Out Mouse Core, NIEHS/NIH

Bu makalede

Özet

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Özet

Bir çaba ES Hücre metodolojileri ile genetik fareler oluşturulmasında verimliliğini artırmak için biz bir uyum geçerli blastosist enjeksiyon protokolü için mevcut. Burada basit bir rotasyon embriyo ve sızdırma Trans-iç hücre kütlesi (TICM) yoluyla chimeric % %31 50'si, hiçbir ek donanımları ile fareler yüzdesi arttı ya da daha fazla eğitim uzman raporu. 26 farklı klonlar yakın akraba evliliğinden doğan ve 35 toplam klonlar bir 9 ay boyunca enjekte edildi. Geleneksel enjeksiyon teknikleri ve TICM arasında anlamlı bir fark gebelik oranı veya embriyo iyileşme oranı oldu. Bu nedenle, enjeksiyon süreci ve blastosist basit bir konumlandırma ve ICM enjekte herhangi bir önemli değişiklik, ES Hücre blastocoel boşluğa bırakmadan potansiyel chimeric üretim ve sonraki miktar artırabilir germline iletim.

Giriş

Yaklaşık 25 yıl için genetik olarak hedeflenen fareler oluşturulması genellikle bir darboğaz tarafından blastokistlerin ES Hücre mikroenjeksiyon aşamada chimeras verici germline üretimi için engel yavaş bir süreç olmuştur. Son gelişmeler, ES hücre ve yüksek üretilen iş ES hedefleme CRISPR/Cas91,2 de dahil olmak üzere hücre üretimi konsorsiyumlar KOMP gibi genetik olarak değiştirilmiş ES hücre üretimi/durumu düzeldi. Ancak, genetik olarak değiştirilmiş fare bu ES hücreleri3,4den oluştururken bir darboğaz germline chimeras nesil kalır. Yüksek işlem hacmi ES hücre üretimi projeleri germline chimeras başarılı oluşturulması için önemlidir ES Hücre kalitesi yüksek değişkenlik tarafından rahatsız olması. Ayrıca, yaygın olarak kullanılan ES Hücre satırlarından bazıları yüksek anöploidi ve germline yetkili chimeras5zor üretim için bilinir.

Fare ya da daha yüksek bir chimera oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiştir veya tamamen ES Hücre fareler6,7,8,9,10türetilmiş. Bu sistemlerin her biri kendi yararları olsa da, onlar da kendi eksiklikleri var. Verimsiz ve outbred satırları 5,6sınırlı iken % 100 ES Hücre üretme fareler, türetilmiş tetraploid chimeras kuşağıdır. Morula enjekte ederek yeni yöntemleri yüksek oranda chimeras, % 100, yaklaşan verim ama genel olarak önemli ek donanımları (lazerler ya da piezos) ve eğitim10,11gerektirir. Nerede bu teknikler zaten yerde laboratuvarlarda, bu yeni yöntem gerek kalmayabilir.

Bu çalışmanın amacı chimera üretme, sonraki fare koloni kurmak için mutant gen aktarımını germline olasılığını artırma oranı artırmak için ortak teknikleri ve hazır ekipman kullanan bir yöntem bulmak oldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemleri fare çekirdek dışarı NIEHS Knock tesisin normal çalışma kapsamında yapıldı. Bütün fareler bir 12:12 tarihinde tutulan s açık: koyu döngüsü ve bir diyet NIH-31 ve su besleme ad libitum. Tüm deneylerin hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü uygun olarak yapıldı.

1. hayvan hazırlık

  1. Doğurmak donör fareler, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, 8-10 hafta-in yaş B6 için doğal olarak (Cg)-Tyr < c-2J > /J erkek fareler arasında 8 ve 26 hafta-in yaş. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.
  2. Alıcı fareler, İsviçreli kadın fareler 6 ve 9 hafta-in yaş arasında doğal olarak vasectomized İsviçre Webster erkek fareler için yetiştirilmiş Webster doğurmak. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.

2. ES Hücre hazırlık

  1. 129-derieved AB2.2 ES hücreler için 15 ile desteklenmiş DMEM hücrelerde kültür % FBS, % 1 glutamin, %1 Penn/strep ve % 0.1 β-mercaptoethanol. ES Hücre tedarikçinin yönergeler, onların önerilen protokolleri kullanarak başına diğer tüm ES hücre kültür.

3. embriyo koleksiyonu

  1. Hayvan diseksiyon
    1. Birkaç 60 mm yemekleri, yaklaşık 1 5 fare artı 10 mL patlama koleksiyonu medya (BCM) ile 3 ekstra hazırlamak (% 10 FBS inç DMEM), ve iyi bir 4 çanak ile 0.5 mL BCM de başına. 37 ° C, % 5 CO2equilibrate.
    2. B6 ötenazi (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, CO2 boğulma, % 10 debi ile kullanarak E3.5.
    3. Ötenazi sonra fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karın % 70 etanol ile iyice ıslak.
    4. Sadece, deri yoluyla ilk kesi kadar geniş açılış yapma karın, orta noktasını yaptırın. Sonraki yeniden yapım belgili tanımlık kesme mümkün olduğu kadar geniş karın duvarından açın.
      Not: iki adımda bunu azaltmak veya kürk kirlenme ortadan kaldırmak yardımcı olur.
    5. Yumurtalık, ovidukt ve rahim, yağ dokusu minimumda tutmak için ekstra bakım alarak bir yumurtalık başlangıç ve yumurtalık yağ yastığı künt forseps ile tutarak dikkatle çıkarın. Rahim bir tek birim olarak veya aşağıdaki yöntemde bir değişiklik ile bireysel boynuzları olarak kaldırın.
    6. Kaldırıldıktan sonra rahim patlama toplama ortamı içeren bir 60 mm çanak yerleştirin.
  2. Embriyo kaldırma
    1. BCM ile dolu bir 10 mL şırınga hazırlamak ve bir 25 G iğne ile uygun.
    2. Her seferinde bir rahim BCM holding çanak çıkarıp, onları aşırı kan kaldırmak ve düşük bir büyütme diseksiyon mikroskop altında 60 mm tabak içinde yerleştirmek için bir doku üzerinde leke.
    3. Dikkatlice ve yavaşça rahim distal sonuna (ovidukt) hemen altında tutarak forseps diseksiyon ile paralel bir uçak mümkün olduğunca olarak iğnede rahmine ortasına yerleştirin. Forseps ipuçları ötesinde iğne yerleştirin.
    4. İğne için rahim tutulacağı pensler biraz baskı uygulamak ve yaklaşık 1 mL BCM ile rahim boynuz sınırdışı.
      Not: şırınga üzerinde çok fazla baskı medya, kontrol edilemeyen bir akışı neden olur bu adımda kez çanak bırakarak özen göstermelidir.
    5. Rahim, 60 mm çanak, başına en fazla 5 bütün uteri kızarma sonra çanak koleksiyonu kadar da kuluçka makinesine koyun.
  3. Embriyo koleksiyonu
    1. Bir el çekilmiş Cam Pipet ve ağzını pipet cihazlar kullanarak, blastokistlerin 25 X ve 35 X arasında parçalanmış bir kapsam altında toplamak. (Şekil 1).
      Not: Ağız pipet aparatı 30-40 cm esnek boru oluşur, 5 mm altında kimlik eklemek bir 1 000 µL pipet ucu, ilk tek bir amaç için nokta ve içindeki Cam Pipet yapıştırmayın. Bir ekli 1 cc şırınga varil, bir ağız parçası hareket etmek hiçbir pistonu ile diğer ucunu bir şırınga filtre ekleyin.
    2. Bulaşık kuluçka makinesi--dan kaldırma ve bir ızgara deseni kullanılarak yemek embriyolar için her bölümünü inceleyin. Embriyo aldı tek tek yukarı ve yer üstünde BCM ikincil bir tabak içinde damla.
    3. Tüm yemekler toplama sonra embriyo bir kez daha taze BCM bir düşüş yıkama ve enjeksiyon beklemek üzere 4 iyi çanak içinde yerleştirin.

4. embriyo enjeksiyon

  1. ES hücreleri tek tek enjeksiyon iğneyi onayı ile seç.
    1. 5-7 mL enjeksiyon medya ekleyerek bir enjeksiyon yemek hazırlamak (DMEM, %10 FBS ve 20 mM HEPES) bir cam alt enjeksiyon yemek için. İğne oda sıcaklığında yapılır.
    2. Bir hava veya yağ microinjector kullanarak, ES Hücre çizmek için enjeksiyon iğne vakum uygulanır. Hücreler arasında mümkün olduğunca az yer olarak tutmak için dikkat ediniz. Burada ya da enjeksiyon adım ES hücreleri saymak.
    3. Orta ve küçük boyutlu hücreler, pürüzsüz bir yüzey ile boşluklar gibi bariz hataları olmadan genel nüfusa göre ES hücreleri seçin.
      Not: ES Hücre popülasyonlarının büyük ölçüde morfolojik kalitesinde değişir ve kullanılan standartlar onlarla ayarlamanız gerekebilir.
  2. Embriyo yaklaşık 15 ES hücrelerle (Şekil 1) enjekte.
    1. Holding pipet eklemek ipucu için ikinci bir hava microinjector ve açılış sahibinin yakınındaki bir embriyo konumlandırın. Embriyo sahibi için güvenli için vakum uygulanır.
    2. Z ekseni için böylece embriyo sadece iyi zona üzerinde odaklanarak takip slayt, dokunuyor holding pipet yukarı veya aşağı taşıyarak ayarlayın. Ardından, ES hücrelerdir ucuna yakın odak enjeksiyon iğne Z ekseni ayarlayın.
    3. Embriyo şimdi hafifçe üst veya alt, ICM istediğiniz konuma koymak için dönen enjeksiyon iğne iterek ayarlayın.
    4. Zona ve ICM veya firma ama kontrollü push kullanarak trofoblast, enjeksiyon iğne yerleştirin. Microinjector enjeksiyon iğne blastocoel çöken düşük tutmak için hafif bir basınç uygulayın.
    5. Bir kez iğne blastocoel nüfuz, ES Hücre embriyo blastocoel için aktarmak için microinjector gelen basınç uygulayın. Basınç embriyo hücreleri tutarken, normale dönmek için izin vermek için embriyo çıkmak Duraklat kısaca iğne eğimi olarak başlar.
      Not: Başvuru grubu ES hücreleri normalde enjekte edildi, geleneksel bir ES takip enjeksiyon Protokolü9ICM dokunmamaya dikkat çekici, hücre. ES hücreleri de iğne doğrudan aracılığıyla ICM (TICM) (Şekil 2Tamamlayıcı film) iterek ICM yoluyla enjekte edildi.

5. eEmbryos devri

  1. Transfer embriyoların İsviçre Webster farelere, E2.5, üretim prosedürleri başına bir cerrahi olmayan embriyo transferi aygıtı kullanarak. Cerrahi olmayan bu yordam herhangi bir anestezi veya özel ameliyat sonrası bakım gerektirir. Tek tek embriyo ve teslim ve sonraki sütten kesme yoluyla transferden sonra evi fareler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre kültürünü rasgele etkisi olarak tedavi, karışık etkileri Doğrusal model (örneğin SAS (sürüm 9.2)) yazılımında verileri çözümlemek için kullanıldı. Her analiz embriyo transfer ve hücre sayısı için kontrollü. İkinci analiz de hayatta yavru sayısı için kontrol.

Bu çalışma için her ES hücre kültürünü ve klon her ikisi ile geleneksel enjekte ettiler ve TICM teknikleri, her embriyo sonra iki yöntem arasında geçiş yapma. Enjeksiy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Uzun ICM herhangi bir rahatsızlık ölüm, aslında, Şu anki blastosist mikroenjeksiyon protokolleri hala bu12,13uyarmak yol açabileceğini zannedildiği. Biz burada göstermiştir ne olduğunu mikroenjeksiyon ICM ile embriyo için zararlı değildir ve chimeras verimini artırır.

Böyle bir sonuç kesin mekanizması tanımlanmamış. Ancak, ICM ve eşlik eden hypoblast, mekanik bozulma ES Hücre entegrasyon mikroenjeksiyon takip yeni kurulan ICM insidansı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

Bu araştırma [kısmen] Intramural araştırma NIH, Ulusal Enstitüsü Çevre Sağlık Bilimleri Program tarafından desteklenmiştir. İstatistiksel analiz için özel Shyamal Peddada teşekkürler. Biz de Humphrey Yao, Gary kuş ve Yuki Arao incelenmesi bu el yazması ve Franco St onun sürekli destek ve tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ES Hücre enjeksiyon iğnesiHumagenMSC-20-0
NSET cihazıParatechs60010
DMEMGibco (yaşam teknolojileri)11965-092
FBSGibco (yaşam teknolojileri)10439-024lotları ES Hücre uyumluluğu için ayrı ayrı test edilmelidir.
HEPESSigmaH0887
β-merkaptoetanolSigmaM7522
Mikro manipülatörLeicaMikro manipülatör
mikro enjektörEppendorf AGCell Tram Air 5176
MikroskopLeicaDM IRB
4 kuyulu çanakThermo Scientific176740
60 mm çanakSarstedt83.3901
B6(Cg)-Tyr< c-2J>/JJackson Labs, Bar Harbor, Maine, ABD000058
İsviçre Webster fareleriTaconic, ABDTac:SW
Enjeksiyon KabıMatTek Corp.P50G-0-30-F

Kaynaklar

  1. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
  3. Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
  4. Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
  5. Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).
  6. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  7. Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
  8. Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
  9. Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
  10. Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
  11. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
  12. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
  13. Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
  14. Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Blastokist Enjeksiyon ProtokolEmbriyo TransferiMikroskop KurulumuEmbriyo Y netimiGerm hatt letimiGebelik OranEmbriyo Geri Kazan m
Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.