Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri
Bu makalede
Özet
Özet
Retina, başlatır ve vizyon ilk adımları entegre karmaşık bir dokudur. Retina hücrelerinin disfonksiyon birçok kör edici hastalıklar özelliğidir ve gelecekteki tedaviler hücreleri normal çalışmasını temel anlayış üzerinde ne kadar farklı retina hakkında doğru katlayın. Katkıları belirli hücre tiplerinin retina hücre ortamda azalır çünkü bu tür bilgileri biyokimyasal yöntemlerle kazanıyor zor kanıtlamıştır. Canlı retina görüntüleme genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler, giderek artan sayıda sayesinde bir hücre altı düzeyde çok sayıda biyolojik süreçlerin bir görünümünü sağlar. Ancak, bu teknik şimdiye Kurbağa yavrularını ve Zebra balığı larva, izole retina en dıştaki retina katmanları veya retina Canlı hayvanlarda daha düşük çözünürlükte görüntüleme için sınırlı olmuştur. Burada confocal mikroskobu ile canlı görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden canlı ex vivo retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu hazırlık tüm retina katmanları ve çoğu hücre tipleri confocal görüntüleme deneyler perfüzyon kullanarak gerçekleştirmek için görünür enine dilimlerle verir. Transgenik Zebra balığı ifade floresan proteinler veya belirli retina hücre tipleri veya organelleri biyosensörler sağlam bir retina tek hücreli bilgi ayıklamak için kullanılır. Ayrıca, retina dilimleri floresan göstergesi boya, yöntemin çok yönlülük için ekleme ile yüklenebilir. Bu protokol Ca2 + Zebra balığı koni photoreceptors içinde görüntüleme için geliştirilmiş, ancak uygun işaretleri ile bu Ca2 + veya metabolitleri Müller hücreleri, bipolar ve yatay hücreler, microglia, amacrine hücreleri veya retina ölçmek için adapte ganglion hücrelerinin. Bu yöntem o hücre tipi eğitim için uygun değildir bu yüzden retina pigment epiteli dilimleri kaldırılır. Uygulama ile birden çok deneyler için bir hayvan seri dilimler oluşturmak mümkündür. Bu uyarlanabilir teknik retinal hücre biyolojisi, Ca2 +ve enerji homeostazı hakkında birçok soru cevap için güçlü bir araç sağlar.
Giriş
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın tıbbi ve temel bilimsel araştırma1, küçük boyutu, hızlı bir gelişme ve omurgalı organ sistemleri sayesinde kullanılan olmak. Zebra balığı larva transgenesis için kurulan yöntemleri ile birlikte doğal şeffaflık yaşayan hayvan hücresel süreçler ayrıntılı görselleştirme etkin. Bir dizi genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler Ca2 + 2, hidrojen peroksit3, apoptotik harekete geçirmek4 ve ATP5algılamak için belirli Zebra balığı hücrelere hedef almış.
Zebra balığı larva vivo içinde görüntüleme devrimler neuroscience eşleme beyin devresi6 dahil olmak üzere, alanında yol açmıştır ve ilaç geliştirme merkezi sinir sistemi için7bozuklukları. Zebra balığı vizyon araştırma için uygundur çünkü onların retina Laminer yapısı ve yüksek omurgalılarda nöron tipleri bulunmaktadır ve bunlar sağlam görsel davranışları8,9görüntüler. Retina dejenerasyonlar insan hastalığına benzer çeşitli başarıyla modellenmiş ve Zebra balığı10,11bireysel photoreceptors bir retina2içindeoluşan bozucu canlı görüntüleme dahil olmak üzere, okudu, 12.
Vivo larva Zebra balığı görüntüleme değerli bir araçtır, Balık büyüme ve gelişme pigmentasyon ve bazı farmakolojik tedaviler tüm hayvan nüfuz edemez gibi daha zor olur. Ayrıca, belirli hücresel süreçler daha sonraki zaman Puan anlayış fonksiyonu ve hastalık ilerleme için kritik yetişkin hayvanlarda yapmak geliştirme ve yaş ile değiştirme. Biyokimyasal immunoblot, quantitiative PCR, O2 tüketimi ve metabolomic analizleri gibi yöntemleri Biyoloji bir bütün olarak retina hakkında önemli ipuçları sağlayabilir, ancak katkıları etkilenen tek tek hücre tiplerinin ayırt etmek zordur hastalık. İzole retina doku ex vivo Imaging bu sorunlar atlar ve düz Imaging bağlı retina affords dış retina13bir görünümünü, daha derin iç retina özellikleri gizlenmiş. Bu içinde sunulan tüm katmanları ve hücre tipleri açık bir görünümünü etkinleştirmek immunohistokimyasal analizleri, sabit ama sadece tek bir anlık görüntü normal fonksiyon ve hastalık dahil dinamik süreçlerin teklif gibi enine retina dilimler.
Burada, görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden ex vivo enine retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Elektrofizyolojik ve morfolojik araştırmalar14,15, zaman atlamalı ex vivo confocal kullanarak görüntüleme için önemli değişiklikler ile amfibi ve Zebra balığı retina dilimleri hazırlama yöntemleri benzer mikroskobu. Floresans yanıt biyosensörler veya boya dilimleri içinde gerçek zamanlı olarak farmakolojik ajanlar perfüzyon kullanarak teslim ederken confocal mikroskop ile izlenir. Yöntem photoreceptors görüntüleme için geliştirilmiş olsa da, Müller hücre, iki kutuplu hücreler, yatay hücreler, amacrine hücreleri veya retina ganglion hücrelerinin uygun floresan işaretleri ile görüntülenmesi için kullanmak için uygun olabilir. Ayrıca, dilimleri rapor hücre canlılığı, veziküler ulaşım, mitokondri işlev veya Redoks devlet hücre geçirgen floresan boyalar ile yüklenebilir. Bu çok yönlü hazırlık Ca2 + dinamikleri, sinyal iletimi ve metabolik durumu da dahil olmak üzere retina hücre altı işlemleri geniş bir görselleştirme sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Üniversitesi Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlanması hayvanlar ve donanımları
Not: Retina pigment epiteli (RPE) olan pigmentasyon retina özellikleri karanlık ve confocal zaman ex vivoImaging dokusuna zarar retinanın dış çevreleyen doku karanlık bir sayfadır. Karanlıkta, Zebra balığı RPE retina uzak geri çekildi; karanlık uyum RPE retina üzerinden gelecek kaldırma önce dilimleme ve görüntüleme kolaylaştırmak için balık.
- Balık su ile dolu bir yumurtlama tank balık aktarmak ve yumurtlama tank ile koyu kumaş sarma veya karanlık bir dolapta yerleştirin.
- Karanlık Zebra balığı ötenazi tam RPE ayrılması retina yakınındaki izin vermek için önce en az 1 h için uyum. 30 dk karanlık adaptasyon çoğu RPE, kaldırmak için yeterli olsa da parçaları arasında photoreceptors intercalated kalabilir.
- Eritmek ~ 15 mL petrol jöle bir 50 mL ölçek sıcak tabakta ve 3 mL sıvı 3 mL kayma uç enjektör çizin. Şırınga ters çevir'i, bir tüp rafa yerleştirin ve Vazelin soğumasını sağlar.
- Yeniden kullanılabilir bir Dilimleme odası düz 7 cm X 2,5 cm mikroskop Slayt üzerindeki olun.
- Açık tırnak cilası, slayt, ortasında 3 cm X 2,5 cm dikdörtgen oluşturmak için boya dar çizgiler kullanarak kurumasını bekleyin ve ardından tırnak cilası başka bir katman ekleme.
- Görüntüleme merdivenler kapak dilimleri görüntüleme sırasında tutmak için paket fişi üzerinde hazırlamak. Dilimleri merdiveni "basamakları" oluşturacak.
- Statik görüntüleme veya en az düzeyde çözüm akışı ile enjeksiyon deneyler için vazelin 18 mm kare cam kapak paket fişi üzerinde iki düz geniş paralel şeritler oluşan vazelin merdivenler olun. İki basık uygulamak için şırınga kullanın ~ soğutmalı vazelin 0.5 cm kapak fişinde apart 1 cm uzun yayma.
- Doku dilimleyici hazır.
- Çift kenar jilet etanol ile temiz ve kuru hava sağlar. Dört eşit parçaya makasla, önce uzunlamasına yarıya içine sonra her'bıçak arasında kes.
- Dilimleme odası doku dilimleyici sahnesinde yerini, Sahne Alanı'nda yatay olarak ortalayın ve uzun kenar hizalama kalıcı marker ile işaretlemek.
- Bir bıçak bölüm doku dilimleyici kol üzerine yüklemek, bıçak slayt üzerinde tırnak cilası dokunmadan düz ve ortalanmış yatıyor emin olduktan sonra bıçağı aparat hafifçe sıkın. Daha düşük topuzu ¼ ayarlayarak bıçak kol açmak, sonra yer filtre kağıdı görüntüleme odası ve test merkezinde bir parça kes. Eğer kağıt tamamen aracılığıyla kesme değil, bıçak yeniden bağlayın.
- 10 cm kabında koyun soğutmalı vazelin tek bir küçük nokta Ģırınga kullanarak ~ sağdaki merkezinin 1,5 cm. Görüntüleme bir merdiven yukarı dönük olacak şekilde vazelin ile forseps kullanarak basın. Başka bir küçük vazelin nokta olun ~ görüntüleme odasının giriş kenarından 1 cm.
- Vazelin şırınga 20 g iğne ile uygun ve o çıkarın. İğne şırınga üzerine tutun ve iki 1 cm uzun ince paralel şeritler vazelin Dilimleme odası merkezinde boyuna yapmak için kullanabilirsiniz. Şeritler uzay ~ 1 cm arayla.
- Merkezi sarma tarafından yeniden kullanılabilir tel göz döngü aracı yapmak bir ~ 4 cm kesimi 30 g tungsten tel çifti etrafında bir kez sıkıca forseps kapalı. Döngünün çapı genellikle bir Zebra balığı göz, biraz daha büyük olana tel forseps aşağı ve yukarı kaydırarak ayarlayın ~ 2-3 mm. tel biter büküm ve onları laboratuvar bant kullanarak 6cm ahşap sopanın ucuna güvenli.
- Zil'ın çözüm hazırlamak.
- 50 ek hisse senedi çözüm (Tablo 1) X çözülme ve sabah deneme HEPES tampon, bikarbonat zil'ın çözüm (Tablo 2) taze ekleyin; her 10 mL konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe zil'ın çözeltisi içinde ek hisse senedi çözümün 200 µL sulandırmak. Statik görüntüleme deneyler için en az 30 mL deneme başına zil'ın çözeltisi hazırlamak. Perfüzyon deneyler için gerekli zil'ın çözüm hacmi toplam deneme saat ve akış hızı üzerinde bağlıdır.
- İlave çözüm pH 7.4 bir dijital pH probu veya pH kağıdı kullanarak olduğunu ve ayarlamak onay buna göre ile seyreltik NaOH veya HCl.
- İsteğe bağlı gaz bubbler manifold perfüzyon için kullanılan veya bir standart tıbbi oksijen tankı ve bir hortum ile donatılmış regülatör kullanarak en az 5 min için % 100 oksijen gazı ile köpüren tarafından desteklenmiştir zil'ın çözüm buz üzerinde oksijen. Mağaza kapalı konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe diseksiyon mikroskop yakınındaki buzda zil'ın çözüm oksijenli; Bu çözüm için Imaging, diseksiyon ve boyalar veya farmakolojik sulandırmak için kullanın.
- Diğer çözümler deneyinde, Na+gibi kullanılıyorsa,-zil'ın çözüm (Tablo 3) ücretsiz, tekrarlamak merdiven 1.9.1.-1.9.3.
- Petri yemekler, forseps, mikro-makas ve diğer araçları diseksiyon mikroskop yakınındaki toplamak ve bir balık su buz banyosu Zebra balığı ötenazi için hazırlanın.
2. retina dilimleri (bkz. şekil 1) hazırlanması
- Çalışma ışık adaptasyon, (hangi-ebilmek RPE sopa daha sıkı yapmak için retina) en aza indirmek için kırmızı ortam ışığı altında ötenazi Zebra balığı buz banyosu daldırma tarafından dokunmatik yanıt kaybolur kadar genellikle 1-2 dk. balık bir petri Transfer edecek ve bir neşter cervically yerinden çıkar ama balık başını kesmek değil.
- Tel döngünün bir göz etrafında bağ dokusu gevşetin için kullanın ve sonra bir yandan göz ileri döngü ile yavaşça çekin. Mikro-makas diğer elinde kullanılarak, gözün arka kesmemeye dikkat çekici ve göz altında beyaz optik sinir kesme.
- Forseps bir petri soğuk zil'ın çözüm için buza kullanarak göz aktarmak ve ikinci göz için yineleyin. RPE retina kaldırılana kadar gözleri karanlıkta veya kırmızı ışık altında tutun.
- Eyecups içinde bir damla soğuk zil'ın çözüm bir petri içinde düz cam slayt üzerindeki bir düşük güç diseksiyon mikroskop altında incelemek.
- Kornea ile iyi forseps pierce, sonra yavaşça çıkarın parçalarını temiz, kırılgan kornea ve forseps veya makas ile gümüş sklera. Kaldırmak ve objektif ve sklera çoğunu atmak ( şekil 1A' ya bakınız) ve izole kadeh en az.
- Yağ, sklera ve siyah RPE küçük bit parçalar için kadeh bağlı kalır ve retina daha sonra kaldırıldı. 2.4.1. adımda RPE retina ayıran, hassas izole retina zarar vermemesi için ekstra dikkatli kullanarak aynı adımlarla devam edin.
- Kadeh açık yan (RPE kadar) aşağı slayt üzerinde konumlandırın ve thirds veya taze tek uçlu jilet bir hareket ile üç aylık dönemler halinde kesilmiş (bkz. şekil 1B). Yüksek kavisli doku parçaları atmak.
- Düz montaj retina filtre kağıt üzerinde.
- Filtre kağıt zil'ın çözüm ile ıslak ve slayt yanındaki kadeh parçalar yerleştirin. Düz forseps sağlam ıslak filtre kağıdı işlerken bu delinme önlemek için kullanın. Filtre kağıdı ve doku kapsayacak şekilde soğuk zil'ın çözüm ekleyin.
- Her elinde forseps kullanarak dikkatle filtre kağıdı her kadeh parça RPE ve Yani , yukarı dönük olacak şekilde göz arkası ile karşı karşıya photoreceptors altına sürükleyin. Kadeh parçaları tek bir hat boyunca filtre kağıdı ortasına yerleştirin (bkz. şekil 1 c). Kadeh parçalar sadece bir kenar veya köşe yakınlarında iyi Forseps ile yavaşça ele.
- Filtre kağıdı bağlı retina yardımcı olmak için bir kuru kağıt havlu 3 için ıslak filtre kağıdı yerleştirin s aşağı doğru nem fitil, ancak kuru haline doku izin. Kadeh adet düz filtre kağıt üzerinde yalan kadar yineleyin. Nazik emiş filtre kağıdı alt uygulama retina dümdüz yardımcı olur, ama bu adım gerekli değildir.
- RPE siyah yaprak kadeh parçalar üzerinde kalır, iyi forseps yavaşça o uzakta--dan bir-başlangıç soyma için kullanın (bkz. şekil 1 d) doku zil'ın çözüm bir düşüş oturuyor iken köşe. Retina filtre kağıdı, tekrar 2.5.3 wicking adımda kaldırmak. Retina nedeniyle Ryslampa görsel pigmentler pembe görünebilir.
- Retina diseksiyon ve düz merdiven 2,4-2,6 ikinci göz, isterseniz, soğuk zil'ın çözümde dalmış ilk düz monte retina tutmak montaj yineleyin. Dilimleme işlemi kolaylaştırmak için her iki retina parçalarını bir filtre kağıt üzerinde yerleştirilebilir. RPE kaldırıldıktan sonra deneyler karanlık gerektiren sürece protokol normal oda ışık altında yürütülen olabilir.
- Bir slayt üzerinde filtre kağıdı yerleştirin ve içine bırakarak bir tek uçlu tıraş bıçağı olan bir dikdörtgen döşeme ~ filtre kağıt retina hattın iki tarafında 0.5 cm. Filtre kağıdı hazır Dilimleme odasına götürün uzun filtre kağıdı kenarları forseps kullanarak ince vazelin satırları itmek ve retina soğuk zil'ın çözüm 3-4 damla içinde bırakın.
Not: Bazı boya, lipofilik boya gibi en iyi bu aşamada Dilimleme önce düz bağlar yüklenir. Bu yüklü, uzak bir doku ile kötü ve dilimleme odasında yıkanmış. Örneğin, 558/568 BODIPY yoğun lekeleri retina C12 hücre membranları ve photoreceptor dış segmentleri (bkz. şekil 4A), yüklendiğinde ~ 5 µg/aşırı zil'ın çözüm bir makinaya ardından mL 15 dakika oda sıcaklığında (genellikle 23-27 ° C), . - Dilimleme odası doku dilimleyici Sahne Alanı'na transfer işaretli hat boyunca uzun kenarına getirin ve güvenli odası sahneye laboratuvar bant ile sona erer. Bir uçta başlayarak, retina ve filtre kağıdı Dilimleme kolunda firma, hafif basınç kullanarak kesmek. İlk dilim tam, kesilmiş onay sonra kesmek için mikrometre kullanmak ~ 400 µm dilimleri.
- Görüntüleme merdiven bir araya getirin.
- Yer Petri kabına adım 1.7 görüntüleme için bitişik dilimlenmiş retina bölümleri ile dilimleme odası merdiven ( 1E anlamayagörmek). Çanak soğuk zil'ın çözüm ile içeriğini daldırın için doldurun.
- Forseps kullanmak ve dilimleri sular altında tutmak, yavaşça transfer filtre kağıdı ve retina merdivene Petri kabına soldan sağa doğru kaydırarak şeritler. Retina doğrudan dokunma için dikkat ediniz. Dilimlerini döndürme 90° ve filtre kağıdı kenarları vazelin içinde gömmek.
- İnce merdiveni Forseps ile retina katmanları diseksiyon mikroskop altında açıkça görünecek şekilde retina dilimleri yerleştirin (bkz. şekil 1G). Merdivenin her ucunda dilimler için doku içe doğru hareket doku enjeksiyonu veya akış sırasında en aza indirmek için diğer dilimleri doğru dönük olduğundan emin olun. İyi olmayan retina dilimleri silmek için filtre kağıdı yapıştırılır (bkz. şekil 2A).
- İstenirse, boyalar retina dilimler halinde bu aşamada yük ve aşırı zil'ın çözüm görüntüleme önce yıkayın.
Not: Propidium iyodür (PI) ve Höchst 33342 sağlam ölü ve tüm hücreleri, çekirdekleri sırasıyla leke (bkz. şekil 2B), oda sıcaklığında 20 dakika 5 µg/mL, retina dilimleri ile inkübe zaman. Tetramethylrhodamine (TMRM) biriken retina 1 inkübe boyunca aktif respiring mitokondri nM, oda sıcaklığında 30 dakika. - Dilimleri boyama iken, görüntüleme odası ve enjeksiyon aparatı hazırlayın. Şırınga zil'ın çözüm ile boru Temizleme ve kabarcıklar tasfiye, görüntüleme odası giriş hortumunun açık ucunu takın ve stopcock kapatmak için kullanın. Şırınga kaldırın ve enjeksiyon için reagent(s) ile doldurun, sonra boru için yeniden bağlayın.
- Forseps vazelin görüntüleme odası giriş kenarına yakın nokta içine coverslip basarak görüntüleme odasına coverslip retina dilimleri ile aktarmak için kullanın (bkz. şekil 1 H). Görüntüleme odası dilimleri kapsayacak şekilde zil'ın çözüm ile doldurun.
3. görüntüleme retina dilimleri
- Sahne Alanı'ndaki bir dik confocal mikroskop objektif daldırma 20 veya 40 X su ile donatılmış bağlı enjeksiyon aparatı ile doldurulmuş görüntüleme odası yerleştirin. Görüntüleme odası sahne klipler ile güvenli.
- Merdiven üzerinde daldırma objektifin alt ve trans-ışıklı loş ışık altında merdivenin bir ucunda bir dilim odaklanmak. Her dilimin enine yönlendirme, photoreceptor dış segmentleri ve filtre kağıdı için güvenli yapışma varlığı için inceleyin.
- Zaman atlamalı görüntüleme için en iyi dilimi seçin ve mikroskop bilgisayar yazılımı zaman atlamalı resim alma için yapılandırın. Tablo 4 çeşitli floresan işaretleri ve boyalar tipik görüntüleme ayarları özetlenmektedir.
Not: Resim alma oranı mikroskop, floresan marker(s) ve biyolojik süreci okudu bağlı olarak değişir. Örneğin, 800 x 800 piksel çözünürlük, 2 µs/pixel inceden inceye gözden geçirmek hız ve 10-s kare hızı photoreceptors GCaMP3 ve kırmızı boya ile kalsiyum dinamiklerini görüntüleme için kullanın.- Varsa, yazılımı dilim (photoreceptor dış segmentleri, hücre gövdeleri, çekirdeği) zaman atlamalı sırasında olası hale gelmesini yardımcı olmak için fiziksel simge yapılar izlemek için kullanır. Ayrıca gerçek zamanlı Floresans dilim izlemek için yazılımı kurar.
- Görüntüleme başlar ve temel Floresans izleme. Floresans dilimi arasında (tipik olarak 2-5 dk içinde) stabilize, deney ile devam. Enjeksiyon, şırınga stopcock açın, sonra yavaş yavaş düşürmek ve geri iki kez karıştırma yardım için pistonu üzerinde çizin.
Not: Örneğin, protonophore CCCP görüntüleme odasında 1 µM son bir konsantrasyon ulaşmak için konsantre çözeltisi enjekte edilerek mitokondriyal işlev ortadan kaldırmak. Bu GCaMP tarafından bildirilen photoreceptor sitozol patlama bir sağlam Ca2 + , sonra TMRM tarafından bildirilen mitokondri zar potansiyel sürekli bir düşüş neden olmaktadır. - Yakından dilimleri drift için deneme sırasında izleyebilir ve mikro-ayarlamalar göre fiziksel yerler için yazılımı kullanın. Z yönünde enjeksiyon sırasında genellikle kayması ya da perfüzyon < 5 µm.
4. nerede çözümler değişen veya sürekli akan perfüzyon deneyler sırasında retina dilimleri görüntüleme
Not: Retina görüntüleme çözümleri değişti nerede perfüzyon deneyler sırasında dilimler veya sürekli akan Kur aşağıdaki değişiklikler ile statik görüntüleme veya enjeksiyon deneyler için benzer.
- 1.4. adımda anlatılan vazelin merdivenler yerine daha dayanıklı balmumu merdivenler retina dilimleri çözüm akışı sırasında sabit tutmak için kullanın.
- İki küçük paralel silindir unflavored diş balmumu yer ~ 0.5 cm bir coverslip ayrı. Düz bir yüzeye bir her ikisine coverslip kenarına paralel doğru aşağı ve dışarı yaparken. Her ikisi de Puan edinildi düzleştirilmiş silindir #1 coverslip ile yatay olarak ( 1E rakam, sağ tarafta görmek) sonra smear vazelin mum şeritler bir spatula ile arasında ince bir tabaka.
- 2.10.2. adımda görüntüleme merdiven montajı, dilimlenmiş filtre kağıdı kenarları ince forseps (şekil 1G) kullanarak balmumu puanları basın.
- Perfüzyon adım 2.12 için ayarlamak için şırınga rezervuar preoxygenated çözümleri ile doldurun veya isteğe bağlı gaz manifold her rezervuar çözümlerinde oksijen kullanın. Floş tüm boru ile zil'ın çözüm, tüm satırları açıldığında akışı ve büyük kabarcıklar tasfiye emin olun.
- Adım 2,13 görüntüleme odasında doldurmadan önce şırınga yanal akışı sırasında kayan önlemek için coverslip maruz kalan her köşesinde üzerinde vazelin başka bir nokta eklemenizi sağlar.
- Görüntüleme odası girdikten ve mikroskop sahnede monte sonra Aspiratörü üzerinde açın ve Aspiratörü boru bağlayın. Zil'ın çözüm akışını sınamak ve micropositioner odası taşmaları önce az miktarda sıvı çizilir böylece çıkış odası aspiratör tüp yerleştirmek için kullanın (genellikle ~ 2 mL/dk akış hızı için çözüm yüzey yukarıda 1 mm). Zil'ın çözüm adım 3.4 dilimleri seçerken akan tutun.
- 3.4. adımda perfüzyon deney yapmak için ilk çözüm stopcock bu ikinci çözüm açılırken kapatarak çözümleri akışının geçiş yapın.
- Örneğin, hücre dışı Na+ görüntüleme odası üzerinden tüketmek için zil'ın çözüm veya Na+ile dolu iki şırınga rezervuarlar kullanın-ücretsiz çözüm (Tablo 3). Taban çizgisi oluşturun, sonra+Na geçmek için zil'ın çözüm akış-ücretsiz çözüm. Bu büyük sitozolik Ca2 + photoreceptor dış kesimlerinde artırır ve hücre (bkz. şekil 4) organları ile sonuçlanır.
- Akış hızı görüntüleme sırasında sürekli bu yüzden yerçekimi beslenen perfüzyon sistemleri için çözüm her Reservoir düzeyini izlemeniz. Oksijenli çözümleri ile gerektiği gibi rezervuar kontör veya sürekli oksijen gazı manifoldu ile köpüren korumak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sabit konumlandırma ve dilimleri enine yönlendirme enjeksiyon veya perfüzyon farmakolojik ajanların başarılı görüntüleme anahtarıdır. Dikkatle inceleyin ve dilimler confocal görüntüleme önce tüm retina katmanlar görünür (şekil 2A, dilim II) emin olmak için gerektiği gibi yeniden konumlandırmak. Bir dilim döndürülürse biraz ileri (şekil 2A, dilim III), dış segmentleri demetleri görünür hale gelir ve istenen retina katmanları odak ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ex vivo görüntüleme taze Zebra balığı retina dilim photoreceptor Biyoloji20,21,22eğitim için çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır ve çözümleme olgun, tek hücre tam sağlar benzersizdir farklılaştırılmış retina. Uygulama ile hatta retina aynı kısmından seri dilimleri kullanarak tek bir balık dokudan ile birden çok deney mümkündür. Sorunlar ve öneriler Elektrofizyoloji çalışmalar14amfibi retina ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
Biz Ralph Nelson ve Daniel Possin geliştirilmesi istikrarlı transgenik Zebra balığı satırları oluşturmak için bu iletişim kuralı ve Eva Ma, Ashley George ve Gail Stanton ise düşünceli rehberlik için teşekkür ederiz. İş M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. ve M.G. için NSF GRFP 2013158531 ve EY026020 J.H. ve SB tarafından desteklenmiştir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| zebra balığı | Washington South Lake Union Su Sporları Tesisi | stokları, kararlı transgenik hatlar olarak kurum içinde korunur | |
| vazelin | Fisher Scientific | 19-090-843 | vazelin şırıngası için |
| 3 mL kayma uçlu şırınga | Fisher Scientific | 14-823-436 | vazelin şırıngası için |
| 20g 3.8 cm kayma uçlu iğne | Fisher Scientific | 14-826-5B | vazelin şırınga |
| düz için 7 cm X 2,5 cm mikroskop lamı | Fisher Scientific | 12-550-A3 | vizör lastiği diseksiyonu için, dilimleme odası |
| Seche Vite şeffaf oje | Amazon | B00150LT40 | dilimleme haznesi için |
| 18 mm X 18 mm # 1 cam lameller | Fisher Scientific | 12-542A | görüntüleme merdivenleri |
| için tatlandırılmamış diş mumu | Amazon | Görüntüleme | merdivenleri için B01K8WNL5A |
| çift kenarlı tıraş bıçağı | Doku dilimleme için Stoelting | 51427 | |
| dijital mikrometreli doku dilimleyici | dilimleme için | Stoelting | 51415 |
| filtre kağıdı - beyaz ızgaralı karışık selüloz, 13 mm çap, 0,45 & m gözenek boyutu | EMD Millipore | HAWG01300 | retina montajı için filtre kağıdı |
| 10 cm petri kabı | Balıklar için Fisher Scientific | FB0875712 | ötenazi, diseksiyon, görüntüleme merdiveni montajı |
| 15 cm düz uçlu ahşap aplikatör çubuğu | Fisher Scientific | 23-400-112 | tel göz halkası aracı için |
| 30g (0,25 mm çap) tungsten tel | Fisher Scientific | AA10408G6 | tel göz halkası aracı |
| D-glikoz | Sigma Aldrich | G8270 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| sodyum L-laktat | Sigma Aldrich | L7022 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| sodyum piruvat | Sigma Aldrich | P2256 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| L-glutamin | Sigma Aldrich | G3126 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| L-glutatyon, indirgenmiş | Sigma Aldrich | G4251 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| L-askorbik asit | Sigma Aldrich | A5960 | ek stok çözeltisinin bileşeni |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Ringer çözeltisinin bileşeni |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | Ringer çözeltisinin bileşeni |
| CaCl2 ve orta nokta; 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | Ringer çözümünün |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | Ringer çözümünün bileşeni |
| MgCl2 & 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | Ringer çözümünün bileşeni |
| HEPES | Sigma Ringer çözeltisinin Aldrich | H3375 | bileşeni |
| Tris tabanı | Fisher Scientific | BP152 | Na+ içermeyen Ringer çözeltisinin |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | Na+ içermeyen Ringer çözeltisinin bileşeni |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | Na+ içermeyen bileşeni Ringer çözeltisi |
| 50 mL konik santrifüj tüpü | Ringer çözeltisi için | Denville Scientific | C1062-P |
| Vannas makas - 8 cm, açılı 5 mm bıçaklar | World Precision Instruments | 501790 | vizör lastiği diseksiyonu için mikro makas |
| İsviçre cımbızı - #5, 11 cm, düz, 0,06 X 0,07 mm uçlar | Dünya Hassas Aletler | 504510 | vizör lastiği diseksiyonu ve dilim manipülasyonu için ince forseps |
| tek kenarlı tıraş bıçağı | Fisher Scientific | 12-640 | vizör lastiği diseksiyonu ve düzeltme için filtre kağıdı |
| EMD Kırlangıç filtre forseps | Fisher Scientific | XX6200006P | ıslak filtre kağıdını işlemek için düz forseps |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | canlı hücre çekirdeklerini lekeler; inkübe 5 ve mikro; oda sıcaklığında 15 dakika boyunca g / mL |
| propidyum iyodür (PI) | Fisher Scientific | P3566 | ölü hücre çekirdeklerini lekeler; inkübe 5 ve mikro; oda sıcaklığında 20 dakika boyunca g / mL |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | canlı hücre çekirdeklerini lekeler; inkübe 5 ve mikro; oda sıcaklığında 20 dakika boyunca g / mL |
| Tetrametilrodamin, metil ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | fonksiyonel, negatif yüklü mitokondriyi boyar; oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1 nM inkübe edin |
| doku perfüzyon odası | Cell MicroControls | BT-1-18 / BT-1-18BV [-SY] | enjeksiyon veya perfüzyon için görüntüleme odası |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-Deoksiglukoz (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | floresan glikoz analogu, ötenaziden 30 dakika önce zebra balığına oral yoldan uygulanır |
| Olympus lazer taramalı konfokal mikroskop | hücre çözünürlüğünde dilimlerin floresansını görselleştirmek için | Olympus | FV1000 |
| Karbonil siyanür 3-klorofenilhidrazon (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | mitokondriyal solunumu ablasyon yapan deneysel reaktif; dilimleri 1 & mikro'luk bir nihai konsantrasyona kadar tedavi edin; M |
| minyatür aspiratör konumlandırıcı | Perfüzyon perfüzyon | Cell MicroControls | FL-1 |
| , gaz fıskiye manifoldu, akış valfi, 60cc şırınga tutucu | Warner Instruments | perfüzyon için | çeşitli |
Kaynaklar
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
