Yöntem makalesi

Kan ve Serum lekeler kanser biyolojik değerlendirmek örnek depolama için yararlı bir araç olarak kurutulmuş

10.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57113

⸱

11 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı periferik kan ve serum/plazma tek nükleotit polimorfizmi (SNP) değerlendirme ve ELISA tahlil gibi aşağı akım analizleri için saklamak için basit ve kullanışlı bir yöntem açıklanır.

Özet

Kan örnek kalite gerçek zamanlı PCR veya ELISA gibi doğru aşağı akım analizleri sağlamak çok önemlidir. Biyolojik malzeme doğru depolama tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için başlangıç noktasıdır. Tüm örneklerini aynı şekilde depolama birimine kan koleksiyonundan değerlendirilmelidir. Analizler yapılması için bağlı olarak, tam kan ve serum numuneleri-20 ° C veya-80 ° C kadar kullanmak saklanmalıdır. Kan/serum numuneleri de birden çok donma-çözülme önlemek için bölünmemeli olmalıdır. Bir başka önemli konu bir laboratuvar Sevikiyatta başka bir örnek koşullar bulunuyor. Kuru buz kullanılamaz veya sevk irsaliyesi birkaç günden daha uzun sürer, alternatif yaklaşımlar ihtiyaç vardır. Filtre kağıdı kan toplanması için kullanılmasını bir seçenektir. Burada, bir yöntem kan için önerdiğimiz ve yararlanır serum örnek toplama kan lekeleri (DBS) kurutulmuş ve serum noktalar (DSS) kurutulmuş. Biz DNA DBS bazı tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) aşağı akım değerlendirme için gerçek zamanlı PCR ayıklamak için prosedür geliştirilmiştir. Biz de DSS eluted proteinler başlayarak bir ELISA tahlil optimize. Bu yöntem diğer ELISA testleri veya yordamlar proteinler değerlendirilmesi ile kullanılabilir.

Giriş

Araştırmanın temel amacı kanser biyolojik içine tanı, predicting hasta prognoz ve bir hasta belirli bir tedaviye yanıt olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir yeni biyolojik parametreler tanımlamasıdır. Bu araştırma alanı yenilikçi kanser tedavileri keşfi için temel ve özel tedavisinde önemli bir rol oynar.

Her adımında biyomarker tanımlama ve doğrulama sırasında yürütülen yordamlar güvenilir ve tekrarlanabilir olmalıdır. Kan ve serum gibi biyolojik örneklerin doğru depolama translasyonel araştırma başarısı için bir taşıdır. Moleküler biyoloji deneyleri veya protein testleri gerçekleştirmek için kullanılan yüksek kaliteli biyolojik malzeme elde etme yolunda ilk adım bu.

Kadınlarında çalışmalar kez sağlam veri elde etmek için yeterli hasta işe almak için ihtiyaç vardır. Tüm kurumları örnekleri-80 ° C'de veya kuru buz içinde uluslararası diğer merkezlere örnekler göndermek için edebiliyoruz. Filtre kağıdı kullanımı kan koleksiyonu için kan ve serum depolamak için basit bir yöntemdir ve örnekleri1,2hemen dondurulması gerektirmez. Bir damla kan veya serum kuru gecede yaptı ve sonra 14 gün oda sıcaklığında1,2için depolanan kağıt üzerine lekeli olabilir. Bu araştırmacılar örnekleri diğer laboratuvarlar için göndermek için zaman verir. Kurumuş kan kullanımı (DBS) noktalar ve kurutulmuş serum noktalar (DSS) böylece gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde kurumları arasındaki işbirliğini kolaylaştırmak.

Kullanım kolaylığı göz önüne alındığında, DBS örnekleme yaygın serolojik veya genetik aşağı akım analizleri için çeşitli deneyleri içinde kullanılır. Örneğin, geçmişte, DBS sık gelişmekte olan ülkelerde1,2,3,4,5' te eleme HIV için kullanılmıştır. Bu depolama yöntemi bir diğer avantajı kan örnekleri parmak-pislikler, böylece tarama testleri 6,7,8yenidoğan için kullanımı etkinleştirilmesi toplanan olduğunu. Kolay örnek kullanım ve taşıma vardır daha fazla DBS, avantajları özellikle uzak sitelerdeki toplanan örnekleri için olduğu yerde yok Labaratuar donanımları. Bir önceki yayın biz DBS ve DSS D vitamini ve D vitamini bağlayıcı protein (DBP) beyaz ve Afrika hastaların9bir dizi sınamak için kullanılır. Afrikalı meslektaşlarımıza Kuru buz elde etmek mümkün değildi. D vitamini yolu iki etnik nüfus arasındaki farklılıkları anlamak için biyolojik veri işaretleyicilerini karşılaştırmak için daha fazla eşleşen örnekler standart koşullar altında ve filtre kağıdı depolanmış yordam geliştirilmiş. DBS/DSS yordamı optimize sonra biz DBP ve her iki tabur hasta serumda D vitamini çözümlemek başardık. Biz de DNA ekstraksiyon işgal için tam kan ve DBS Afrikalılar9dan sonra bir dizi tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) değerlendirildi. Mevcut Protokolü kaliteli kan örnekleri karşıdan akış analizleri moleküler biyoloji ELISA deneyleri için arasında değişen farklı türde etkilemeden oda sıcaklığında saklanmasına izin verir. Bu Biyolojik materyallerde kadınlarında çalışmalarda yönetmek kullanmak veya standart depolama koşulları için imkanlar var mı merkezleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş bu yordamları doruk temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Periferik kan ve serum toplanan ve sağlıklı bağış ve Yazılı onam çalışmaya katılmak için veren hastalar depolanır. Çalışma protokolü 1964 Helsinki Bildirgesi içinde ortaya konan etik standartlarına uygun olarak Yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. kan depolama DBS

  1. Kan örneği koleksiyonu
    1. Periferik kan örneği 3 mL tüp içinde 3 mL ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 5.4 mg ile toplamak.
      Not: periferik kan olarak en kısa zamanda DBS ve 8 h içinde saklayın.
    2. Hasta kod numarası koruyucu kartı alt sağ köşede yazmak.
    3. Dikkatle 5 mL pipet ile kan resuspend.
  2. DBS üzerinde lekelenme kan
    1. Pipet ve kan (50 µL) (Tablo reçetesi) koruyucu kartına bir yerde 50-200 µL bahşiş ile aktarın.
    2. 1.2.1 arasındaki adımları yineleyin. 3-5 kan noktalar toplamda sahip olmak. Yaşlı uç atın ve her kan için yeni bir aliquot alın.
    3. DBS bir yatay pozisyonda oda sıcaklığında kuru gecede doğrudan güneş ışığından kaçınmak bir açık emici olmayan yüzey üzerinde bırakın. Koruyucu kartı kapağını kan kurutma kolaylaştırmak için açık bırakın.
      Not: Herhangi bir partikül hava veya toz kurutma bu adımı sırasında aşağı akım uygulamaları etkilemez.
    4. Kartı oda sıcaklığında nem ile bir plastik torba kullanmak kadar saklamak.

2. DBS DNA ekstraksiyon kiti veri sayfası (kurumuş kan lekeleri için bölümüne) göre başlayarak DNA ekstraksiyon

  1. Numune hazırlama
    1. 3 kurumuş kan lekeleri kartı kullanın. Her kart kurumuş kan noktalardan biri kesmek veya cımbız ile kartından ayırabilirsiniz. Ayrılmış kurumuş kan lekeleri (çapı 1 mm) küçük parçalar halinde kesin.
    2. Küçük bir 1,5 mL santrifüj tüpüne alin.
  2. Örnek sindirim
    1. 180 µL lizis tampon tüp seti (Tablo reçetesi) sağlanan 1 ekleyin. 20 µL İndinavir K. Ekle Lizis arabellek 1 1,5 mL tüp içine kart benekli kanla pipetting önce İndinavir k ile birlikte kullanmayın. Vortexing tarafından mix.
    2. Bir thermoincubator tüpü yerleştirin ve 60 dk 56 ° C'de kuluçkaya. Thermoincubator girdap örnek bir shaker ile donatılmış değil eğer en azından 10 için her 10-15 dk s, örnek sıcaklığını azaltmak izin vermemeye dikkat çekici. Kısaca damla--dan kapağı kaldırmak için tüpler santrifüj kapasitesi.
  3. Yıkama adım
    1. 200 µL lizis arabelleğinin 2 (Malzemeler tablo) ve 10 için girdap ekleyin s.
    2. Bir thermomixer veya ısıtmalı yörünge kuluçka tüpler yerleştirin ve 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya. Eğer thermoincubator bir shaker ile donatılmış değil girdap örnekleri bir kez için en az 10 s, örnekleri sıcaklığını azaltmak izin vermemeye dikkat çekici.
    3. 2.3.1 arasındaki adımları yineleyin. Transfer, lysate 400 µL 1,5 mL tüp elüsyon sütun (Malzemeler tablo). 6.000 x g 1 dk. için adresindeki sütun santrifüj kapasitesi.
    4. Elüsyon sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
    5. 500 µL yıkama arabelleği 1 (Malzemeler tablo) ve santrifüj 6.000 x g 1 dk. için ekleyin.
    6. Sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
    7. 500 µL yıkama arabelleğinin 2 (Malzemeler tablo) ve santrifüj 6.000 x g 1 dk. için ekleyin.
    8. Sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
    9. Membran kuru için 3 dakika için 20.000 x g, santrifüj kapasitesi.
  4. Elüsyon adım
    1. Sütun yeni 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve toplama tüp atın.
    2. Yer 50 µL distile su membran ortasına üzerine. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
    3. 20.000 x g 1 dk. toplamak, tüp eluate santrifüj kapasitesi ve tekrar membran ortasına yerleştirin.
    4. 1 dakika süreyle santrifüj tüpü 20.000 x g de zar atmak.
    5. Bir spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek.
    6. Mağaza DNA-20 ° c kadar kullan.
      Not: DBS çıkarılan DNA SNP değerlendirme gibi birçok analizleri gerçekleştirmek için gerçek zamanlı PCR veya DNA Sanger sıralama tarafından kullanılabilir.

3. serum depolama DSS için

  1. Kan örneği koleksiyonu
    1. 7 mL EDTA olmadan 7 mL tüp periferik kan örneğinde toplamak. Oda sıcaklığında 30 dakika koagüle kan örneği bırakın.
    2. Hasta kod numarası koruyucu kartı alt sağ köşede yazmak.
    3. Kan örneği ' 980 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi.
      Not: serum olarak en kısa zamanda DSS ve 8 h içinde saklayın.
    4. Dikkatle ve yeni bir 15 mL tüp transfer süpernatant tüpünden çıkarın. Dikkatle 5 mL pipet ile kan resuspend.
  2. DSS içinde lekelenme serum
    1. Pipet ve tek bir noktada serum (50 µL) koruyucu kartına aktarmak. 3-5 kan lekeleri bakildi için bu adımı yineleyin.
      Not: tam olarak 50 µL serum her yerini pipet için dikkatli olun. Serum ötesinde kart kesikli çizgi gitmemeli.
    2. DSS oda sıcaklığında kuru gecede bırakın. Koruyucu kartı kapağını kan kurutma kolaylaştırmak için açık bırakın.
    3. Kartı oda sıcaklığında nem ile bir plastik torba kullanmak kadar saklamak. Depolama 14 günden daha uzun olursa, kart-20 ° C'de depolayın

4. ELISA Assay DSS başlayarak

  1. DSS protein elute.
    1. Gerekirse, her örnek için bir DSS çözülme. DSS (yaklaşık 1 mm çapında) küçük parçalara kesilmiş. Adet 400 µL PBS ile 1,5 mL tüp içine koyun.
    2. Örnekleri gecede 4 ° C'de sallamak
      Not: onları düşük yoğunlukta sallamak. PBS tüp kapak sallayarak sırasında ıslak değil.
  2. Protein eluate serum örneği salgılanan protein/büyüme faktör analizine göre ELISA kiti talimatları, sonra uygun dilutions kullanın.
    Not: Bu yordam de DBP algılama9için çalışır. Diğer ELISA deneyleri için bir en iyi duruma getirme adım gerekli.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biyolojik malzeme kalitesini etkilemeden kan ve serum oda sıcaklığında saklamak için DBS ve DSS yordamlar yararlandı. Şekil 1 protein kart koruyucu olmadan kan ve kan toplama sonra bir örneği gösterilir. Filtre kağıdı üzerindeki depolama ve kan elute yordamına örnek kalite ile karışmayın onaylamak için biz standart depolama yöntemleri ile bir karşılaştırma yapılacak. Biz DNA tam bir 2 mL tüp içinde toplanan veya DBS depolanan kan 3 eşleşen örnekleri olarak Pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralı laboratuarlar personel ya da kan örnekleri doğru kullanımı için gerekli altyapı var mı ne zaman kan ve serum filtre kağıt üzerinde depolamak için potansiyel inceler. Özellikle, tam kan veya serum standart tüpler veya parmak-hıyar tarafından toplanan bu yöntem kullanılarak depolanabilir ve hemen sonra kan toplama örnekleri-20 ° C veya-80 ° C dondurmak için gerek yoktur. DBS/DSS oda sıcaklığında kan/serum bütünlük içinde herhangi bir değişiklik olmaksızın 14 güne kadar kalabilir. Depolama birimi için kri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Whatman protein koruyucu kartlar 903 Protein koruyucu kart, 100/pk‎SigmaZ761575Aşağı akış analizleri için numuneleri oda sıcaklığında saklamak için kullanışlıdır
Falcon Serolojik Pipetler, 5 mLKök hücre# 38003
50-200 & mikro; L ipuçlarıStar-LabS1120-8810
1.5 mL santrifüj tüpüEppendorf4036-3204
QIAamp DNA mikrokitiQiagen56304Bu, küçük miktarlarda DNA'yı izole etmek için tasarlanmış bir DNA ekstraksiyon kitidir.  
Tampon ATL (QIAamp DNA mikrokitinde bulunur)QiagenBu, metinde Lizis Tamponu 1 olarak bildirilir
Tampon AL (QIAamp DNA mikrokitinde bulunur)QiagenBu, metinde Lysis Tamponu 2 olarak bildirilir
QIAamp mini elute sütunuQiagenBu, metinde sütun olarak bildirilir
AW1  (QIAamp DNA mikrokitine dahildir)QiagenMETNINDE Yıkama Tamponu 1 olarak bildirilir
; (QIAamp DNA mikrokitine dahildir)Qiagenmetninde Yıkama Tamponu 2 olarak bildirilmiştir
. D sistemleriDVDBP0
Bu, AW2  Bu, İnsan D Vitamini BP Kuantikin ELISA Kiti R&

Kaynaklar

  1. Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
  2. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
  3. Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
  4. Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
  5. Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
  6. Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).
  7. Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
  8. Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
  9. Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
  10. Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
  11. Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
  12. Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
  13. St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710(2013).
  14. Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kurutulmu Kan LekeleriKurutulmu Serum LekeleriDNA EkstraksiyonuELISA AnaliziKan ToplamaSerum Ay rmaFiltre Ka dOda S cakl nda SaklamaBiyobelirte Analizi

İlgili makaleler