Dil hücre dışı matriks ve dil Skuamöz Hücre Karsinomu Vitro sulandırma imalatı

Dil deglutition, eklem ve tatma gibi çeşitli önemli işlevleri vardır. Böylece, dil işlev bozukluğu hastaların yaşam kalitesi¹üzerinde büyük etkisi vardır. Oral kavite içinde en yaygın malignite dil Skuamöz Hücre alkol veya sigara tütün²insan genellikle oluşan Karsinomu (TSCC), olduğunu.

Son yıllarda, TSCC üzerinde temel araştırma az bir gelişme sağlanmıştır. Verimli vitro araştırma eksikliği en büyük sorunlardan biri kalır modelleri. Böylece, hücre dışı matriks (ECM) olası bir çözüm olarak ortaya çıktı. ECM son derece organize matris bileşenlerden oluşan bir karmaşık ağ çerçeve olduğu bir ECM benzeri yapıda ve kompozisyon sahip İskele malzemeleri kanser araştırmaları için yetkili gerekir. Decellularized ECM mükemmel niş için hangi ECM en önemli avantajı için çıkıyor aynı kökenli vitro, hücrelerden sağlar.

ECM doku deterjanlar ve enzimler kullanarak decellularization aracılığıyla gelen kaldırılmakta olan hücresel bileşenleri ile muhafaza edilebilir. Kolajen, fibronektin ve laminin decellularized matris içinde de dahil olmak üzere çeşitli ECM bileşenleri yerel doku gibi microenvironment kültürlü hücreler için hayatta kalma, yayılması ve hücreleri³farklılaşma teşvik sağlar. Ayrıca, ECM hücresel bileşenleri yokluğu ile en az düzeye immünojenisite nakli için azaltılabilir.

Şimdiye kadar decellularized ECM imalat yöntemleri farklı doku ve organlarında, kalp^4,5,6,7, karaciğer^8,gibi^{9,10 denendi ,11}, akciğer^{12,13,14,15,16,17}ve böbrek^{18,19 , 20}. ancak, ilgili hiçbir araştırma olmak buldu en iyi bildiğimiz kadarıyla dilinde benzer iş.

Bu çalışmada, decellularized dil hücre dışı matriks (TEM) verimli ve uygun fiyatla rezervasyon yaptırın fiziksel, kimyasal ve enzimatik tedavi bir dizi tarafından fabrikasyon. Sonra TEM TSCC vitro, özetlemek için TSCC davranış ve Kalkınma için uygun bir simülasyon gösterilen kullanıldı. TEM iyi biyouyumluluk hücreleri TEM TSCC araştırma³' te büyük potansiyeli olabilir gösterir doku özel niş Kılavuzu yeteneği vardır. Burada gösterilen iletişim kuralı Patogenez ya da TSCC klinik tedaviler üzerinde eğitim araştırmacılar için bir seçim sağlar.

Tüm hayvan iş hayvan refahı Yasası, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Sun Yat-Sen'in Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. TEM hazırlanması

1. Fareler tarafından servikal çıkığı yürütmek ve steril cerrahi makas ve cımbız kullanarak dilleri kaldırın.
2. Tongues yılında % 75 etanol 3 min için bırakın, sonra her dil bir 1,5 mL koymak Eppendorf (EP) tüp ile 1 mL 10 mM steril fosfat tamponlu çözüm (PBS).
   Not: PBS konsantrasyonu aşağıdaki adımlarda bu adımda konsantrasyon olarak aynıdır.
3. Lizis donma çözülme tarafından hücre:-80 ° c için 1 h EP tüpler dilleri donma ve 3 kür için dilleri için 45 dakika oda sıcaklığında erimek.
4. Cerrahi sütür cerrahi iğne kullanarak bir parça üzerine her dil yüklemek ve steril folyo küçük bir parça ile dikiş sonu sarın. % 75 etanol steril koşullarda içeren bir 3,5 cm veya 6 cm kültür tabağına işlemi.
   Not: Uygun da cerrahi sütür her parçası yaklaşık 20 cm uzunluğunda ve 0,3 cm² hakkında (1 cm × 0,3 cm) folyo her parçasının uygun boyutudur. Dil folyo yüklü olmalıdır.
5. Her dil 3 mL steril PBS ile 30 s. gerçekleştir steril koşullarda bu işlem için bir 3,5 cm veya 6 cm kültür tabak içinde yıkayın.
6. Dilleri Ultrasaf Su ile yıkamak: ampicilin geniş ağız şişe içine steril Ultrasaf Su 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri içeren bir heyecan bar şişe içine koymak. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
   Not: en fazla 5 dilleri dikiş twining söz konusu aynı şişe içine koyabilirsiniz. Folyo şişe dil kapalı kaymasını önlemek için dikiş sonu altındadır. Dilleri şişe içinde kalan dikiş uzunluğunu ayarlayarak şişenin alttan 2 cm yüksekliğinde yerleştirilmelidir. Bu Not için adımları 1.8, 1.10, 1.12 ve 1,16 da.
7. Manyetik karıştırıcı 12 h için şişe koymak.
8. Dilleri NaCl ile yıkayın: ampicilin geniş ağız şişe içine steril 1 250 mL ile eklemek M NaCl 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
9. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
10. Hücre lizis Triton X-100 tarafından: 90 µg/mL 250 mL steril % 2 ile son bir konsantrasyon geniş ağız şişe içine ampicilin eklemek PBS Triton X-100. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
11. Manyetik karıştırıcı 48 h için şişe koymak.
12. Dilleri CaCl₂/MgCl₂yıkama: ampicilin geniş ağız şişe içine steril 5 mM CaCl₂/MgCl₂ 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
13. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
14. DNaz tarafından sindirim: Hank'in 1 mL dengeli tuz solüsyonu (HBSS) her EP tüp için ekleyin. DNaz HBSS sırasıyla 300 son bir konsantrasyon için eklemek µM. taşımak her dil tüp dışında dikiş parçası ile her EP tüpün içine. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
    Not: yukarıdaki adımı şişelerde içinde kalır dikiş parçası da bu adımda EP tüp içinde kalır emin olun ve önceki adımları şişelerde dışında kalır dikiş parçası da bu adımda EP tüp dışında kalır emin olun.
15. EP tüpler için 24 h 37 ° C'de dilleri kuluçkaya.
16. Dilleri PBS ile yıkayın: ampicilin geniş ağız şişe içine steril PBS 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
17. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
18. Hazırlanan TEM 4 ° C'de steril PBS kadar kullanmak saklayın.

2. TSCC üç boyutlu (3D) sulandırma

1. Statik TSCC modeli İnşaat
   1. Tohum 1.0 x 10⁶ tek TSCC hücreler (Cal27) 3.5 cm kültür çanak içine. Dulbecco'nın 3 mL kartal orta/F12 (DF12) içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS), 90 µg/mL ampicilin ve 90 µg/mL sefaloridin modifiye ekleyin.
   2. Cal27 hücreleri 37 ° C'de 2-3 gün için kültür. Hücreleri en az % 60 cover emin olun alan çanak alt.
   3. TEM Cal27 monolayer kültür tabağına üzerine yükleyin.
   4. Çanak 28 gün boyunca bir CO₂ kuluçka 37 ° C'de koyun.
   5. Kültür Orta hücre kültür işlemi sırasında her gün yenileyin. Kuluçka CO₂ konsantrasyonu % 5 var.
2. Karıştırılmış TSCC modeli İnşaat
   1. Kendi yaptığınız karıştırılmış minibioreactor hazırlanması
      1. Dalgıç 10 mL şırınga dan çıkar.
      2. Çubuk daha düşük terminal bir delik (1 cm çapında) kazmak ve delik bir heyecan bar yük.
      3. Bir delik (çapı 0.5 cm) geniş ağız şişe Plastik şişe kapağı merkezinde kazmak ve piston kolu ile kap koymak.
      4. 50 mL santrifüj tüpü yarısı kesilmiş ve şişe kapağı dış tarafında kaynak.
      5. Eşyaları için çubuk çubuk eşyaları için bağlı balıkçılık satırlar ile sarma tarafından iliştirin.
         Not: en fazla 4 eşyaları bir çubuk için eklenebilir.
      6. Otoklav kullanmadan önce kendi kendine yapılan karmaşık.
         Not: değil basınçlı kap plastik geniş ağız şişe var. Yeni bir steril plastik geniş ağız şişe hücre kültürü çalışmalarının ise kullanın.
3. Dinamik hücre kültürü
   1. Tohum 1.0 x 10⁶ tek Cal27 hücrelerde kendi kendine yapılan minibioreactor. %10 FBS, 90 µg/mL ampicilin ve 90 µg/mL sefaloridin içeren DF12 orta 150 mL ekleyin.
   2. TEM çubuk bağlı eşyaları kullanarak minibioreactor üzerine yükleyin.
   3. Şişe kapağı sıkın ve minibioreactor bir manyetik karıştırıcı tarih koymak. CO₂ kuluçka 37 ° C'de 200 devirde minibioreactor 7-14 gün için etkinleştirin.
      Not: CO₂ kuluçka CO₂ konsantrasyonu % 5 olduğunu.

Bu iletişim kuralı TEM hazırlanması için verimli ve uygun olduğu ortaya çıkıyor. TEM anadili kurcalayarak kıyasla mükemmel decellularization gösterdi. Decellularization etkinliğini hematoksilen-(Şekil 1A-B) boyama eozin tarafından (o) doğrulandı. Sonuçları boyama o nükleer TEM (Şekil 1B) boyama tam ortadan kalkması saptandı. Ayrıca, önceki işten DNA içerik miktar DNA TEM3neredeyse tamamen kaldırıldığını gösterdi. Bu iletişim kuralı da hücre bileşenleri (Şekil 1B) kaldırılırken doku bütünlüğü için nadir hasar gösterdi.

TSCC TEM ve kendi kendine yapılan minibioreactor (resim 2A-B) kullanarak 3D sulandırma tatmin edici sonuçlar elde. O boyama TEM Cal27 hücrelerde tipik TSCC patolojik özellikleri (Şekil 2C-D) sunulan gösterdi. Karıştırılmış kültür koşulları hücreleri tek hücre geçiş (Şekil 2C) veya toplu geçiş (Şekil 2D) farklı lezyon alanlarda mevcuttur. Statik kültür koşullarında Cal27 hücreleri de bu invaziv yapıları içinde TEM araya ama daha uzun bir süre (Şekil 2E) aldı. Ayrıca, bir insan osteosarkom hücre kültürünü U2OS da aynı karıştırılmış kültür sistemi kullanılmaya başlandı. U2OS hücreler kültür ortamında yaşamak rağmen TEM (Şekil 2F) bulunamadı. TEM kanser hücrelerinin farklı türleri için farklı biyouyumluluk farklı tümör hücreleri güzelleşmek için farklı microenvironments gerekebilir düşündüren gösterdi.

Resim 1 : TEM hazırlanması. (A) o fareler gelen yerli diller boyama. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) o = fare üzerinden decellularized TEM, boyama. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : TEM tarafından TSCC sulandırma. (A) kendi kendine yapılan minibioreactor genel bakış. (B) kendi kendine yapılan minibioreactor TEM-yükleme konumunu görünümü. (C) o 14 günlük boyama kültürlü TSCC TEM ile karıştırılır. Tek hücre saldırı olayları siyah oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 50 µm. (D) o = 14 günlük karıştırılmış kültürlü TSCC ile TEM, boyama. Toplu saldırı olayları siyah oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 50 µm. (E) o = 28 günlük statik boyama kültürlü TSCC ile TEM. Tek hücre saldırı olayları siyah oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 100 µm. (F) o = 14 günlük karıştırılmış kültürlü U2OS hücre TEM ile boyama. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.